全 文 ：陈桂平 ,客绍英 ,陈玉芹.菘蓝根腐病菌毒素的提取及生物活性测定 [ J] .江苏农业科学 , 2010(2):105-106, 109.
菘蓝根腐病菌毒素的提取及生物活性测定
陈桂平 , 客绍英 , 陈玉芹
(唐山师范学院生命科学系 ,河北唐山 063000)
　　摘要:探讨有机溶剂萃取法和硫酸铵分级沉淀法提取菘蓝根腐病原菌毒素的具体方法 , 并用浸苗法进行了病菌
毒素的生物活性测定 , 对该毒素的热稳定性也进行了鉴定。试验结果表明:菘蓝根腐病菌毒素为极性较强的大分子物
质 , 应采用强极性的有机溶剂萃取 ,用硫酸铵分级沉淀法不能提取该毒素 ,说明该毒素不是蛋白质类物质;经生物活性
测定 , 该毒素能使菘蓝幼苗发生病变 ,病变的程度随毒素稀释倍数的增大而减弱;毒素经 120 ℃高温处理后仍具有很
高的活性 , 说明该毒素具有很强的热稳定性。
　　关键词:菘蓝根腐病;病菌毒素;提取;生物活性;热稳定性
　　中图分类号:S661.2　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)02-0105-02
收稿日期:2009-07-27
基金项目:河北省唐山市科技项目(编号:06234501A-9)。
作者简介:陈桂平(1972—),女 , 硕士 ,副教授 ,主要从事植物分子遗
传学工作。 E-mail:chenguiping968@sohu.com。
　　菘蓝 (IsatisindigoticaFort.)为十字花科 2年生草本植
物 ,具有清热 、解毒 、凉血 、止血功效 ,主治流行性感冒 、流行性
腮腺炎等 ,是常用的中药 [ 1] 。根腐病是危害菘蓝的主要病害
之一 ,严重影响菘蓝的品质和产量 。根腐病由镰刀菌属真菌
侵染所致 ,镰刀菌毒素是由镰刀菌产生的一类对寄主植物具
有一定生理活性和非专化性作用位点的代谢产物 ,属于非寄
主选择性毒素 ,被认为是植物产生病害的主要原因之一 [ 2 ] 。
最常用的真菌毒素提取方法是萃取 ,由于毒素可能为蛋白质
物质 ,所以硫酸铵分级沉淀法也较为常用 。迄今为止 ,很多学
者在菘蓝的生药学 、化学 、药理 、有效成分含量测定 、制剂与工
艺等研究方面取得了较快进展 ,但关于菘蓝根腐病的研究少
见报道 。本研究对菘蓝根腐病菌毒素的提取及生物活性鉴定
等进行试验探讨 ,不仅对揭示菘蓝根腐病菌致病机理有重要意
义 ,而且可为探讨菘蓝根腐菌毒素的实际利用价值提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
供试菌种:菘蓝根腐病病原菌 ,由河北农业大学提供 。供
试幼苗:菘蓝种子来源于河北省玉田菘蓝培养基地 。挑选饱
满的宽叶菘蓝种子 ,流水浸泡 3h,在超净工作台上用无菌水
冲洗 3 ～ 4次 , 70%乙醇表面消毒 30 s, 0.1% HgCl2消毒 6 ～
12min,无菌水冲洗 4次 ,接种于 1/2MS培养基中 , 23 ℃培养
箱中培养 10d左右 。
1.2　毒素培养滤液的制备
从保藏试管中挑出菌种进行活化 ,然后转接于 PDA培养
基 ,在培养箱中于 28 ℃、黑暗条件下培养 7 d,用直径 1 cm的
圆形打孔器取菌落边缘菌丝 5块 ,在无菌条件下接种到盛有
150mL改良 Fries液体培养基的三角瓶中 , 置于摇床中
70r/min、28℃、黑暗条件下培养 21 d。待菌丝长成数个菌球
后 ,用 4层纱布过滤 ,滤出菌丝和菌球。滤液 3 000r/min离心
30min,弃去沉淀 ,取上清液 ,此上清液即为无菌丝体的毒素
滤液 [ 3 ] 。
1.3　毒素的提取
(1)有机溶剂萃取法 。分别将等体积的乙酸乙酯、乙醇
与病原菌培养的毒素滤液混合 ,经搅拌 、静止萃取至分层后 ,
将有机相移出 。随后继续对水相进行萃取 ,连续萃取 3次 ,收
集合并有机溶剂相 ,同时保留水相 ,将有机相和水相萃取液在
38℃条件下用恒温水浴锅蒸发 ,残渣用 100 mL无水乙醇溶
解 ,再次蒸发除去残渣中的水分 ,最终产物用无菌水溶解 ,定
容至培养物毒素滤液总体积的 1/100 ,即为毒素母液 [ 4-5 ] 。
(2)硫酸铵分级沉淀法 。在病原菌毒素滤液中分别加入饱和
度达到 0、30%、70%、80%、90%、100%的硫酸铵 ,放于磁力
搅拌器上 ,经搅拌 、沉淀过夜 ,进行离心 。
1.4　毒素的生物活性测定
在 23℃恒温室内 ,取苗龄为 14 d、长势良好且健康状况
相同的菘蓝幼苗 ,浸于稀释浓度分别为 10倍 、50倍 、100倍的
毒素粗提液中 。每个浓度 3株菘蓝幼苗 ,每个浓度重复 3次 ,
处理 24h,同时设无菌水为对照 ,记载病状 ,并照相 。
1.5　毒素的热稳定性测定
取 30mL稀释 10倍的毒素提取液 ,于 121℃高温下处理
20min,待毒素冷却后 ,取 5株菘蓝幼苗浸于其中 ,同时设稀
释 10倍的没有经高温处理的毒素提取液和无菌水分别作为
对照 ,处理 24 h,记载病状 ,并照相 。
2　结果与分析
2.1　毒素的提取
2.1.1　有机溶剂萃取结果　在乙酸乙酯萃取中 ,有机相和水
相分层明显 ,两相分别经水浴蒸发后 ,水相留有较多的红色黏
稠物质 ,该物质水溶液经活性测定能使菘蓝发生病变 。而乙
酸乙酯相只在底部有一薄层浅红色物质 ,经水溶解后能使菘
蓝幼苗子叶发生轻微萎蔫 。由此可见 ,尽管有机相中也有一
定的致病活性物质存在 ,但大部分有致病作用的毒素成分都
在水相中 ,这说明产生的毒素化合物具有较强的极性 。用极
性较弱的乙酸乙酯萃取 ,结果并不理想 。用极性较强的与水
互溶的乙醇萃取时 ,不发生分层 ,混合液呈棕色 ,产生深棕色
的絮状沉淀物 ,经离心除去沉淀后的溶液基本是澄清状态 。
将沉淀复溶在水中定容至 30mL进行活性测定 ,结果表明 ,能
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DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.02.040
使幼苗发生病症 。说明具有致病作用的活性物质基本都在沉
淀中 ,表明菘蓝根腐病菌在液体培养基中所产生的具有致病
作用的活性物质不属于小分子化合物 ,而是大分子化合物。
2.1.2　硫酸铵分级沉淀结果　在沉淀过程中 ,不管硫酸铵浓
度为多少 ,都没能产生有致病作用的沉淀 ,说明菘蓝根腐病原
菌产生的毒素不是蛋白质类物质 ,不能用硫酸铵分级沉淀提
取 。在有机溶剂萃取中 ,水相经蒸发后留下红色黏稠物质 , 2
个试验结果都说明了该毒素为非蛋白质类物质 ,初步断定可
能为多糖类物质 。
2.2　毒素活性测定
由图 1可以看出:稀释 10倍的毒素处理菘蓝幼苗 ,在
48h后 ,处理的 9株幼苗叶片全部干枯 ,且茎部维管束变褐 ,
萎蔫皱缩 ,基部倒伏 ,整个植株接近死亡 。稀释 50倍的毒素
处理菘蓝幼苗 48h后 ,处理的 9株幼苗都有病症但发病程度
不一样 ,有 2株叶子枯萎严重 ,同时茎部轻微萎蔫皱缩 ,有些
许变褐 ,基部没有倒伏现象;其余 7株只有叶片发生了不同程
度萎蔫 ,茎部稍微有些变软 ,但没有发生明显症状 ,植株没有
死亡 ,还保持一定的生命力 。稀释 100倍毒素处理菘蓝幼苗
48h后 , 9株幼苗叶子周围出现了轻微的萎蔫凹陷 ,茎部已无
明显的变化 ,整个植株生命力较强。对照组幼苗 48 h后叶
片 、茎部均保持健康状态 ,没有任何发病现象 。以上结果表
明 ,所提取毒素对幼苗具有杀伤作用 ,这为毒素在病程中是首
要致病因子提供了佐证 。同时发现 ,毒素浓度的大小直接影
响到致病的效果 ,在 3种不同浓度毒素液处理下 ,稀释 10倍
的毒素液由于毒素含量相对较高 ,植株全部死亡 ,稀释 50倍
的毒素液有 2株幼苗发病较严重 ,其余只是叶片萎蔫 ,稀释
100倍的毒素液由于毒素含量相对较低 ,除叶片有轻微的凹
陷外 , 9株幼苗均未出现明显发病症状。所以在筛选菘蓝抗
性植株时 ,合适的毒素筛选浓度应该是稀释 10 ～ 50倍 。
2.3　毒素的热稳定性
由图 2可以看出:经高温处理后的毒素与未经高温处理
的同浓度毒素均能使菘蓝幼苗叶片枯萎 、茎部萎蔫 、维管束变
褐色 、基部倒伏 、整个植株接近死亡 ,表明高温处理后毒素的
致病力并无减弱 。说明菘蓝根腐病菌产生的毒素具有很强的
热稳定性 ,能耐高温 。
3　讨论
3.1　毒素的提取方法
萃取是提取毒素时最常用的方法之一 [ 6 ] ,萃取溶剂一般
有 2种 ,一种是水溶性或极性较强的毒素常采用的水溶性或
强极性有机溶剂 ,如甲酸 、乙酸提取;另一种是针对弱极性或
中性毒素常采用的极性较弱的有机溶剂 ,如乙酸乙酯 、氯仿 、
乙醚等 。穆丽松等对草莓红中柱根腐病毒素提取时 ,选择了
四氯化碳、氯仿 、乙醚 、乙酸乙酯 、丙酮 、乙醇 、甲醇等一系列极
性不同的有机溶剂 ,从而得出草莓红中柱根腐病菌毒素为极
性较强的大分子物质 ,用乙醇 、甲醇提取效果最好 [ 4] 。刘亚
光等在大豆灰斑病菌毒素的提取时 ,选择了石油醚、正己烷 、
乙酸乙酯 、乙醇 、甲醇等溶剂 ,结果表明 ,用极性较大的乙醇 、
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孢杆菌 7Ze3, 能够产生表面活性素 surfactin和伊枯草菌素
iturinA等抗菌活性物质 ,同时还具有纤维素酶 、葡聚糖酶和
蛋白酶的活性 ,表现出较好的平板拮抗效果 ,显示出较出色的
生物防治利用潜力 。从该菌株的发酵液中分离到 5个化合
物 ,结构鉴定它们均为环二肽类化合物 。但由于受到样品量
的限制而没有对其生物活性完成研究 。
1999年 Holden等从 Proteusmirabilis、Citrobacterfreundii、
Enterobacteragglomerans和 Pseudomonasaeruginosa等细菌中
发现的细菌环二肽具有细胞间通讯介导作用 ,即环二肽可作
为信号分子 ,这是一个引人注目的发现 。从供试菌株 Bacilus
subtilis7Ze3中同样分离到具有良好生防特性的环二肽类化
合物 ,提示该株菌在发挥生物防治作用时 ,有可能存在这样一
种机制 ,即通过所产生的环二肽类化合物分子作为细胞间信
号分子对微生境中周围微生物的活动产生影响 。该机制存在
与否将有待进一步研究证明 。
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(上接第 106页)
甲醇提取效果最好 ,均产生毒素沉淀 ,从而证明了大豆灰斑病
菌毒素为极性较强的大分子物质 [ 7 ] 。本试验采用了乙酸乙
酯 、乙醇 2种极性差异较大的有机溶剂萃取菘蓝根腐病菌毒
素 ,试验结果表明乙酸乙酯萃取效果不理想 ,毒素都在水相
中 ,说明该毒素极性较大 ,用乙醇萃取可产生毒素沉淀 ,从而
判断该毒素为极性较强的大分子物质 。有机溶剂萃取法是一
种简单 、方便 、结果明确的提取方法 ,但该方法在萃取过程中 ,
2层液体不能完全分离 ,提取效果存在误差 ,而且所提取出的
毒素只是粗毒素 ,要获得较纯毒素的萃取工艺仍需进一步探
讨 。
3.2　毒素生物活性的测定方法
毒素的生物活性测定方法有多种 ,其中生物检测法是一
种最传统 、最普遍适用 、检测结果最直观的方法 ,主要从整株
植物 、组织器官 、细胞及细胞器等不同水平测定生物活性 。例
如 ,张淑珍等利用切根苗法测定大豆根腐病毒素的活性 [ 8 ] ;
穆丽松等运用叶柄接种法测定草莓红中柱根腐病菌毒素的活
性 [ 4] ;王福妹等用叶片针刺法测定番茄煤霉病菌毒素的活
性 [ 2] 。本试验用整株水平的幼苗浸渍法作为毒素的活性测定
方法 ,该方法需要毒素量小 ,方法简单 ,不需大型仪器和设备 。
但是由于不同实验室使用不同的毒素提取 、纯化 、生物测定方
法 ,缺乏统一的规范化标准 ,使生物测定方法只能用于定性分
析或半定量检测 ,而不能对毒素的生物活性进行精确测定 。
3.3　用毒素代替病原菌进行植物病理学研究的优点
用毒素代替病原菌作为植物病理学研究工具 ,无论在理
论上还是在应用上都有极重要的意义 。研究可以在人为控制
条件下进行 ,不受生长季节及环境因素的影响 , 能 准 确 、迅 速
得 出 试 验结 果 , 同 时 可 以 消 除 常 规 病 理 学 研 究 中 往 往 存 在 的
生 物 间 互 相 干 扰 和 污 染 的 复 杂 影 响 , 而 且 由 于 具 有 简 便 、精
确 、易 定 量 测 定 等 特 点 ,对 探 讨 寄 主 与 病 原物 间 互 相 作 用 的 分
子 生 物 学研 究 有 极 大 便 利 , 有 助 于 人 们 进 一 步 了 解 病 原 菌 的
特 性 与 致 病 机 理 , 也 是 毒 素 研 究 在 实 践 中 应 用 的 一 种
体 现 [ 9] 。
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