全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2012 年
收稿日期：2011－11－01
基金项目：湖北省教育厅科学技术研究计划优秀中青年人才项目（Q20111007）
作者简介：杜雪竹（1980－），女，黑龙江哈尔滨人，讲师，博士，主要从事油菜遗传育种研究工作，（电话）15927010812（电子信箱）
duxuezhu＠yahoo．com．cn；通讯作者，李再云，教授，博士，主要从事油菜分子细胞遗传学研究工作，（电子信箱）
lizaiyun＠mail．hzau．edu．cn。
第 51卷第 11期
2012年 6 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 51 No.11
Jun．，2012
菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引
起的一种广谱性真菌病害，是我国油菜的第一大病
害，目前国内外尚未找到有效抗源，抗病育种难度
大，有油菜生产中的癌症之称。 虽然经过多年研究
已经得到了数份高耐菌核病的材料，但真正的抗源
至今未能获得。 近年来，研究人员开始尝试从油菜
近缘植物中获得新的抗性基因。 菘蓝（Isatis tincto-
ria Fort．，2n＝14） 又名大靛， 为十字花科（Brassi-
甘蓝型油菜与菘蓝原生质体融合及植株
再生体系的研究
杜雪竹 1，李再云 2
（1．湖北大学生命科学学院，武汉 430062；2．华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070）
摘要：以甘蓝型油菜（Brassica napus）和菘蓝（Isatis tinctoria）叶片为材料提取原生质体，采用 PEG—高钙
高 pH 法融合亲本原生质体，采用固液双层培养法诱导愈伤组织的形成。 研究适宜原生质体分离的酶种
类及浓度，并考察了激素种类和用量对愈伤组织诱导和分化的影响。结果表明，5 mg ／ L 纤维素酶＋3 mg ／ L
离析酶适合甘蓝型油菜和菘蓝的酶解。 各培养基中适宜的激素浓度分别为，诱导培养基 PellB 1．0 mg ／ L
6－BA＋1．0 mg ／ L NAA＋0．25 mg ／ L 2，4－D； 增殖培养基 PellC 2．0 mg ／ L 6－BA＋0．1 mg ／ L NAA＋0．1 mg ／ L
2，4－D；分化培养基 PellE 2．0 mg ／ L 6－BA ＋0．1 mg ／ L NAA＋0．02 mg ／ L 2，4－D。 获得了 15 株再生植株，杂
种幼苗叶片均呈深绿色，叶表面覆有厚的蜡质，叶片肥厚，植株在成熟期时株高比甘蓝型油菜矮，开花较
晚，雄蕊发育不完全，杂种体细胞染色体数目为 48～66。
关键词：甘蓝型油菜（Brassica napus）；菘蓝（Isatis tinctoria）；原生质体融合；植株再生
中图分类号：S565．4 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2012）11－2364-05
Study on the Protoplast Fusion and Plant Regeneration System between Brassica napus
and Isatis tinctoria
DU Xue－zhu1，LI Zai－yun2
（1．School of Life Sciences， Hubei University， Wuhan 430062， China，
2．National Key Laboratory of Crop Generic Improvement， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）
Abstract： Protoplast was isolated from leaves of Brassica napus and Isatis tinctoria and fused by PEG－high pH and high
calcium method． Callus was then induced by solid－liquid double layer culture method． Effects of factors including enzyme type
and concentration on protoplast isolation， type and dose of hormone on callus induction and differentiation were studied to im-
prove the plant regeneration efficiency． The results suggested that the enzyme combination suitable for protoplast isolation was
5 mg ／ L cellulase＋3 mg ／ L macerozyme． The concentration of hormone for protoplasts induction， proliferation and differentiation
were 1．0 mg ／ L 6－BA＋1．0 mg ／ L NAA＋0．25 mg ／ L 2，4－D， 2．0 mg ／ L 6－BA＋0．1 mg ／ L NAA＋0．1 mg ／ L 2，4－D and 2．0 mg ／ L
6－BA ＋0．1 mg ／ L NAA ＋0．02 mg ／ L 2，4－D． A total of 15 somatic hybrids were obtained． The leaves of the hybrids seedling
was dark green and thick， covered with wax layer． The adult plants were shorter and flowered later than B． napus． Their
stamens were ateleiosis； and the chromosomes number was 48～66 in somatic cells．
Key words： Brassica napus； Isatis tinctoria； protoplast fusion； plant regeneration
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2012.11.048
第 11 期
caceae）菘蓝属一年生至多年生草本植物，其根称为
板蓝根，为一种常用中药，具有清热、解毒、凉血消
斑、抑菌和杀虫等多种功效，抗病力强，是一种难得
的抗病和优质资源。 然而，菘蓝和油菜之间亲缘关
系较远，存在严重的生殖隔离，通过有性杂交难以
转入整条染色体和较多的遗传物质［1］。
原生质体融合能够打破远缘杂种间的生殖隔
离，是在远缘杂交中转移核基因和胞质基因非常有
效的手段，近年来通过原生质体融合技术获得了大
量的甘蓝型油菜（Brassica napus）与近缘种的体细
胞杂种。 本研究通过对称融合和非对称融合两种方
式获得菘蓝和甘蓝型油菜的体细胞杂种，为油菜—
菘蓝附加系的获得奠定基础，同时希望将菘蓝中有
益的遗传特性转入油菜中，培育高抗菌核病的油菜
新品种。
1 材料和方法
1．1 材料
以甘蓝型油菜品种 Oro （世界上第一个低芥酸
品种）、中油 821（中国油料作物研究所培育的双高、
抗菌核病品种）和华双 3 号（华中农业大学培育的
双低品种）为受体，菘蓝为供体，所有种子均为华中
农业大学油菜育种研究室保存。
SCM （0．5 mol ／ L 葡糖醇＋10 mmol ／ L CaCl2＋ 5
mmol ／ L MES，pH 5．8）和纤维素酶（Onozuka R－10）、
离析酶（Y－23）、甘露醇酶液均用 0．22 μm 的滤膜抽
滤，酶液于－20 ℃保存，酶解前于 4 ℃融化；原生质
体清洗液 W5（154 mmol ／ L NaCl＋125 mmol ／ L CaCl2＋
5 mmol ／ L KCl＋5 mmol ／ L Glucose）；质壁分离液为蔗
糖＋MES（0．5 mmol ／ L Sucrose＋ 1 mmol ／ L MES）。实验
中原生质体培养基主要参照文献［2］中培养基配方。
1．2 实验方法
1．2．1 原生质体的分离和纯化 分别将甘蓝型油
菜和菘蓝的种子用体积分数 70％的乙醇表面消毒 1
min，然后用 1 mg ／ L HgCl2溶液浸泡消毒 15 min，最
后用无菌水冲洗 3 次，接种到 MS 培养基上，置于组
培室发芽。 20～40 d 后取充分展开的叶片用于叶肉
原生质体的分离， 在 37 ℃酶解 18 h 后用手轻轻摇
动使原生质体完全释放，经 200 目和 400 目不锈钢
滤网粗滤去渣质，加 W5混匀，收集滤液至 10 mL 离
心管中，600 r ／ min 离心 5 min，去上清液，沉淀物加
入 2 mL W5 悬浮原生质体，用胶头滴管吸出，沿管
壁轻轻地加入到另一含有 5 mL 质壁分离液的 10
mL离心管中，600 r ／ min 离心 10 min，小心收集环型
带状的原生质体至 10 mL 离心管中， 再加入适量
W5 600 r ／ min 离心 5 min。
考察不同的酶种类及浓度组合对原生质体分
离效果的影响，酶的种类与浓度组合见表 1。
1．2．2 原生质体的前处理 在原生质体对称融合
的过程中供体和受体均不经过任何处理。 在非对称
融合中，受体（甘蓝型油菜）原生质体用 3 mmol ／ L 碘
乙酰胺（IOA）处理 10～15 min；供体（菘蓝）原生质体
在 SW－CT－1D 超净工作台上用紫外线照射 20 s，原
生质体与光源的距离为 10 cm。
1．2．3 原生质体融合及植株再生 采用 PEG—高
钙高 pH 法融合亲本原生质体， 程序和所用原生质
体培养基主要参照文献［2］。 将供体、受体原生质体
密度调至 2×106个 ／ mL 后等体积混匀，将 PEG 融合
液 4×2滴或 8×2滴分别成对滴入 6 cm 或 9 cm 培养
皿中，然后用胶头滴管将混匀后的两亲本原生质体
滴加 2～3 滴在成对的融合液中间，边缘再各加 1 滴
融合液，暗培养 10 min。 用 W5＋MES 将上述培养皿
中的原生质体融合团逐步稀释，剂量依次为 0．125、
0．250、0．375、0．500、1．000 mL（6 cm 培养皿），每次稀
释的时间间隔为 1 min。 稀释的原生质体融合团在
超净工作台上暗培养 1．5 h 后， 向培养皿中滴加
W5＋MES收集原生质体，600 r ／ min 离心 5 min，然后
用 PellB 液体培养基调整原生质体密度为 5×104～
10×104个 ／ mL。采用固液双层培养法诱导愈伤组织，
加 1．5 mL融合后的原生质体悬液到直径为 4 cm、铺
满 PellB固体培养基的培养皿中。暗培养 20～30 d后
细胞团增大、形成肉眼可见的小愈伤组织，挑出转
移到增殖培养基 PellC 中并转为光照培养， 培养温
度为（25±1）℃。 继续培养 7～10 d后，挑选颜色鲜艳、
大小合适的愈伤组织转入分化培养基 PellE 中进行
分化培养，待小芽长至高 1 cm 左右后，切下转入生
根培养基，待再生植株生根后取出移栽，经 2 周炼
苗后移至田间。
考查培养基 PellB、PellC、PellE 中添加激素 6－
BA、NAA 和 2，4－D 的浓度对融合后原生质体愈伤
组织的诱导、增殖及分化的影响，激素的种类和浓
度设置见表 2。
2 结果与分析
2．1 酶种类和浓度对原生质体分离的影响
酶液的酶解效果不仅取决于酶的种类和绝对
用量，而且与各种酶的添加比例密切相关，本实验
中酶种类和浓度对原生质体分离的影响结果见表
1。 从表 1可以看出，5 mg ／ L纤维素酶＋3 mg ／ L 离析
酶的解离效果最好，产物杂质少、解离充分、原生质
体完整，最适合甘蓝型油菜和菘蓝试管苗叶片的酶
解，能获得理想的原生质体产量（图 1）。纤维素酶的
杜雪竹等：甘蓝型油菜与菘蓝原生质体融合及植株再生体系的研究 2365
湖 北 农 业 科 学 2012 年
表 2 激素的种类和浓度对原生质体和愈伤组织生长状态的影响
PellB
PellC
PellE
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
6-BA
1.0
1.0
1.0
1.0
2.0
2.0
2.0
0
2.0
1.0
2.0
NAA
0.5
1.0
1.0
0.2
0.2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
2，4-D
0
0.25
0.40
0
0
0.10
0.20
0.02
0
0
0.02
原生质体和愈伤组织生长状态
原生质体褐化死亡
有肉眼可见的白色愈伤组织出现
只有少数原生质体分裂
生长缓慢，有根毛出现
生长缓慢，易褐化
生长速度适中，松散，淡黄色
质地紧密 ，易褐化
不能分化出芽，最后死亡
愈伤逐渐增大，分化出芽
愈伤由黄色转绿色，但很难分化出芽
愈伤由黄色转绿色，分化出芽
培养基
激素浓度//mg/L
表 1 酶的种类和浓度对叶肉原生质体分离的影响
酶液组合
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
酶液成分
10 mg/L 纤维素酶+10 mg/L 离析酶+5 mg/L 果胶酶
10 mg/L 纤维素酶+5 mg/L 离析酶+6 mg/L 果胶酶
10 mg/L 纤维素酶+5 mg/L 离析酶
5 mg/L 纤维素酶+3 mg/L 离析酶
镜检结果
碎片多，解离不彻底
杂质很多，原生质体有大量破碎
杂质多，解离不充分
杂质少，解离充分，原生质体完整
浓度过高时，细胞尚未从叶片上游离下来就被纤维
素酶消化，使得叶片组织呈孔状，容易被认为是酶
量不足而未完全解离。
2．2 激素种类和浓度对融合原生质体生长的影响
2．2．1 愈伤组织诱导和增殖 融合后的原生质体
（图 1）起始培养到细胞团产生以及进一步形成小愈
伤组织是培养的关键时期，这一时期原生质体对培
养条件和外界环境反应非常敏感。 大多数融合后的
原生质体在培养 24 h 后启动生长，体积增大，部分
原生质体再生出新的细胞壁，形状由圆球形逐渐拉
长呈椭圆形。培养 3～4 d后，原生质体（细胞）出现首
次分裂，大多数表现为均等分裂，持续分裂的细胞
继续培养约 30 d后长出直径约为 1 mm的小愈伤组
织。
激素的种类和浓度对原生质体能否启动分裂
形成细胞团有着至关重要的影响。 实验结果（表 2）
表明， 在未加入 2，4－D 的 PellB 培养基中没有发现
肉眼可见的小愈伤组织形成，可见 2，4－D 对小愈伤
组织的诱导起着重要作用，但 2，4－D 浓度过高也会
抑制原生质体的生长和分裂，适合愈伤组织诱导的
PellB 培养基中激素浓度配方为 1．0 mg ／ L 6－BA＋1．0
mg ／ L NAA＋0．25 mg ／ L 2，4－D。 而在愈伤组织的增殖
过程中，PellC 培养基中不添加 2，4－D 会导致愈伤
组织生长缓慢，2，4－D 浓度过高则会使愈伤组织质
地紧密、易褐化。 适宜的 PellC培养基中激素配方为
2．0 mg ／ L 6－BA＋0．1 mg ／ L NAA＋0．10 mg ／ L 2，4－D。
2．2．2 愈伤组织的分化培养 挑出直径大于 3 mm
的愈伤组织转入分化培养基， 愈伤组织进一步增
大，结构逐渐致密，分化培养基中激素浓度不同，其
生长状态和形态特征表现出差异（表 2）。 在加入了
0．02 mg ／ L 2，4－D 的 PellE 培养基中， 愈伤组织生
长旺盛，能进一步增大，颜色由浅绿色逐渐变为鲜
绿，40 d 左右就分化出小芽； 未添加 2，4－D 的分化
培养基上愈伤组织生长缓慢，初始分化时间明显延
长，并出现了不同程度的褐化现象，分化频率明显
降低。此外，PellE培养基中不添加 6－BA时，愈伤组
织也不能分化，最后死亡。 可见在芽分化的过程中，
激素的组成和浓度同样起着重要的作用，在本实验
条件下，适合芽分化的激素配方为 2．0 mg ／ L 6－BA＋
图 1 分离纯化后的原生质体发生融合
2366
第 11 期
0．1 mg ／ L NAA＋0．02 mg ／ L 2，4－D。
2．3 融合植株形态学特征及细胞学观察结果
本实验设置了 3 个体细胞杂交组合： 菘蓝＋中
油 821、菘蓝＋华双 3 号、菘蓝＋Oro，共获得愈伤组织
237个，15株再生植株。 其中对称融合植株 2株，来
自于菘蓝＋华双 3 号组合，标号为 S1，S2；非对称融
合植株 13 株（编号为 AS1－AS13），其甘蓝型油菜亲
本分别为：AS1～AS8、AS11、AS12， 华双 3 号，AS9，
Oro，AS10，中油 821，植株再生频率为 6．3％，部分亲
本和杂种幼苗及植株形态见图 2。 杂种在幼苗期叶
片颜色均呈深绿色，叶表面覆有蜡质，叶片肥厚。 植
株 S2、AS1和 AS4 叶片在大小和形态上与甘蓝型油
菜叶片相似。 植株 AS6 和 AS7 叶片为长圆或椭圆
型，较脆，极易断裂（在培养基中也如此），其叶裂明
显变浅变少， 表现出菘蓝叶片浑圆的特点。 植株
AS12叶片与菘蓝一样为茎生叶， 叶基部半抱茎，呈
椭圆形，其花瓣形态以及花序与分枝特点都与菘蓝
十分相似。 杂种植株在成熟期时株高较甘蓝型油菜
矮，开花较晚，育性降低，雄蕊发育不完全，在绝大
多数的花中只含有 3～5枚雄蕊。
细胞学观察结果显示植株 S2 和 AS1 体细胞染
色体数目为 2n＝52（图 3A）；AS1 的绝大多数花粉母
细胞（PMC）在终变期表现正常配对（26Ⅱ），在个别
的细胞中出现 25Ⅱ＋2Ⅰ的配对方式（图 3B）；在后
期Ⅰ染色体的主要分离方式为 26∶26（图 3C）；植株
AS4、AS6 和 AS7 体细胞中染色体数目不同，为混倍
体， 其体细胞染色体数目为 48～62 （图 3D）； 植株
AS12体细胞染色体数目为 66。
3 讨论
在远缘杂交中利用原生质体融合转移核基因
和胞质基因已经成为一个非常有效的手段。 最初研
究者们主要采用的是对称融合方式，但是随后发现
对称融合存在来源于不同亲本的基因组之间的不
协调性、育性低及生活力差等缺陷，因此又发展了
非对称融合方式［3］。 在非对称融合过程中染色体丢
失是一个复杂的过程，有些研究中发现非对称杂种
中保留了很多供体染色体［4，5］，但有的研究中发现供
1－8．分别为华双 3 号、菘蓝、AS1、S2、AS4、AS6、AS7 和 AS12 幼苗；9，10．分别为 AS7 和 AS12 的成株
图 2 亲本及杂种植株形态
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10
A．植株 S1 的子房细胞染色体数目 2n＝52； B．植株 AS1 花粉母细胞终变期染色体的配对方式 25Ⅱ＋2Ⅰ； C．植株 AS1 花粉母细胞后期Ⅰ染
色体分离方式 26∶26； D．杂种 AS7 子房细胞染色体数目 2n＝62
图 3 甘蓝型油菜与菘蓝体细胞杂种的细胞学观察
A B C D
杜雪竹等：甘蓝型油菜与菘蓝原生质体融合及植株再生体系的研究 2367
湖 北 农 业 科 学 2012 年
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（责任编辑 向 闱）
体的染色体丢失相当严重［3，6］，甚至在杂种植株中供
体染色体完全丢失，只检测到 DNA片段［7，8］。在本研
究的非对称融合组合中所获得的再生植株染色体
数目为 48～66， 表明供体染色体几乎没有丢失。 另
外， 在所获得的杂种植株中没有发现菘蓝再生植
株，均为真实杂种，说明在非对称融合实验中采用
紫外光照射 20 s，可将菘蓝基因组破坏，使细胞不能
正常分裂。 染色体丢失除了受到射线辐射剂量的影
响，还与培养条件、融合亲本亲缘关系远近以及融
合亲本原生质体所处的细胞周期等有关，有待于进
一步研究。
本研究融合原生质体的愈伤组织分化率较低，
很可能是由于甘蓝型油菜和菘蓝之间的亲缘关系
较远、染色体结构差异过大，生理上很难协调造成
的。 大多数杂种植株在培养基中就表现出生长缓
慢、长势弱小且很难生根的特点，因此最后只有植
株 S2、AS1、AS4、AS6、AS7 和 AS12移栽成功。
本研究建立了甘蓝型油菜与菘蓝的原生质体
对称融合及非对称融合技术体系，分别探索了影响
原生质体分离、融合和再生的因素。 获得的再生植
株从形态、 细胞学可以确定为属间体细胞杂种，为
进一步的分子细胞遗传研究及甘蓝型油菜—菘蓝
附加系的建立提供了基础，同时也为菘蓝中有利基
因转移到甘蓝型油菜中提供了良好的育种材料。
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品种来源： 浚县农业科学研究所用浚 313×浚 66 配组而
成的玉米新品种， 审定编号是国审玉 2011012。 省级审定情
况：2009 年河南省农作物品种审定委员会审定。
特征特性：该品种在黄淮海夏玉米区种植，出苗至成熟 100
d，与对照郑单 958 相当。 幼苗叶鞘紫色，叶片绿色，叶缘绿
色，花药黄色，颖壳绿色。株型紧凑，株高 258 cm，穗位高 117
cm，成株叶片数 19～20 片。 花丝浅紫色，果穗筒型，穗长 16.6
cm，穗行数 14～16 行，穗轴白色，子粒黄色、半马齿型，百粒重
31.7 g。 平均倒伏（折）率。 抗性：经河北省农林科学院植物保
护研究所两年接种鉴定，高抗矮花叶病，中抗小斑病、茎腐病
和玉米螟，感大斑病和弯孢菌叶斑病，高感瘤黑粉病。 经农业
部谷物品质监督检验测试中心 （北京 ）测定 ，子粒容重 759
g/L。
产量表现：2008～2009 年参加黄淮海夏玉米品种区域试
验，两年平均单产 9 823.5 kg，比对照郑单 958 增产。 2009 年
生产试验，平均单产 9 178.5 kg，比对照郑单 958 增产。
栽培技术要点：①土壤肥力：在中等肥力以上地块种植。
②播种期：适宜播种期 6 月中旬。 ③种植密度：每公顷适宜密
度 60 000～67 500 株。 ④注意防止倒伏和防治病虫害。
适宜范围：该品种适宜在河南(南阳和周口除外)、河北保
定及以南地区（石家庄除外）、山东（枣庄除外）、陕西咸阳、山
西运城、江苏北部、安徽阜阳地区夏播种植。 瘤黑粉病高发区
慎用。
玉米杂交新品种浚单 29
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