全 文 ：　　
第 28 卷 第 1 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 1
2002 年 1 月　 1～ 5 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 1～ 5　 Jan. , 2002
甘蓝型油菜隐性核不育两用系 S45AB 中与M S2B nap 基因同源片段的
克隆及序列分析α
李德谋　侯　磊　罗小英　裴　炎　杨光伟3
(西南农业大学生物技术研究中心, 重庆 400716)
摘　要　以甘蓝型油菜隐性核不育两用系 S45AB 的可育株和不育株为材料, 提取减数分裂期与单核期的花粉mRNA ,
反转录合成 cDNA , 并以其为模板扩增花粉特异基因M S 2B nap。结果减数分裂期能扩出产物, 而单核期无任何产物。
将减数分裂期的扩增产物克隆、测序。同源性分析表明: 在 S45AB 上克隆的M S 2B nap 基因与 Gene Bank 公布的拟南
芥控制核育性基因M S 2 和已报道的甘蓝型油菜的M S 2B nap 基因的同源性分别为 88% 和 99%。可育株 S45B 与不育株
S45A 在M S 2B nap 基因序列上有 4 处碱基存在差异, 其中 3 处为同义突变, 编码氨基酸未发生变化: 1 处为错义突变,
可育株为AAA , 不育株为A GA。其三联体密码对应的氨基酸也发生了变化, AAA 编码赖氨酸, A GA 编码精氨酸。该
变化可能与 S45A 的不育有关。
关键词　甘蓝型油菜 (B rassica nap us) ; 隐性核不育; M S 2B nap ; 序列分析
中图分类号: S565　　　文献标识码: A
Clon ing and Sequence Ana lysis of Fragmen t Homologous to M S2B nap Gene in
Rapeseed Recessive Gen ic M a le Ster ile L ine S45AB (B rassica napus L. )
L ID e2M ou　HOU L ei　LUO X iao2Ying　PE I Yan　YAN G Guang2W ei
(B iotechnology R esearch Center, SW A U , Chongqing 400716, China)
Abstract　C lon ing by R T 2PCR and analyzing of sequence of fragm en t homologous to M S 2B nap gene from re2
cessive gen ic m ale sterile line S45AB of B rassica nap us are imm ensely importan t. It help s to understand of gene
regulation in sexual rep roduction of flow ering p lan ts, po ten tial app lication in agriculture such as m ale2sterility.
In th is paper, fragm en t homologous to M S 2B nap gene w as amp lified and sequenced by PCR w ith temp late cD 2
NA of S45AB m ale sterility and m ale fertility. T he m ajo r results are fo llow ed: fragm en t homologous to
M S 2B nap gene w as steadily amp lified from m eiosis stage, but there w as no PCR p roducts using cDNA of single
nucleus stage as temp late,w h ich suggested that the fragm en t homologous to M S 2B nap gene w as no t exp ressed
at th is stage. cDNA fragm en t homologous to M S 2B nap sequence of S45AB show s 88% iden tity to A rabid op sis
thaliana M S2 sequence, and 99% iden tity to B rassica nap us M S 2B nap sequence gene repo rted p reviously. Se2
quence comparison show ed that there w ere four diverged nucleo tides dispersed in the code region of the frag2
m ent homologous to M S 2B nap cDNA of S45AB i. e. , AA CöAA T , TCCöTCT , AA T öAA C and A GA öAAA.
F ragm en t homologous of AA CöAA T , TCCöTCT and AA T öAA C w ere synonymousm utations. W h ile A GA ö
AAA w as m issense m utation, A GA encoding argin ine and AAA encoding lysine.
Key words　 B rassica nap us; R ecessive nucleus m ale sterility; M S 2B nap ; cDNA sequence
　　目前, 虽已克隆到许多与花粉发育相关的基
因[ 1, 2 ] , 但迄今为止, 拟南芥M S 2 基因是分离克隆
到的第一个控制核不育的基因, 全长 2126 bp。当
在其A CAAA C 区段中的AAA 中任一位置插入Aα 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (批准号: 39570467)
作者简介: 李德谋 (1972. 92) , 男, 贵州遵义人, 助教, 硕士, 研究方向: 植物分子育种.
　 3 通讯作者。　 A uthor for correspondence.
Received on (收稿日期) : 2000211221, A ccep ted on (接受日期) : 2001203225

或 T 时, 就会导致花粉败育[ 3 ]。M S 2B nap 基因是
从甘蓝型油菜花药 cDNA 文库中克隆的与M S2 有
很高同源性的基因[ 4 ] , 该基因的不育位点未见报
道。甘蓝型油菜隐性核不育系 S45A 是花粉败育突
变体[ 5 ] , 其不育株的败育彻底, 不受环境影响; 自
交不能结实, 授以同群体可育株的花粉, 能正常结
实, F 1 代可育与不育分离比稳定为 1∶1 [ 6 ]。
本实验以 S45A 及其表型正常的姊妹系 S45B
为材料, 对控制花粉育性的M S 2B nap 基因同源片
段进行克隆与序列分析研究, 以进一步了解该基因
的功能, 并探究 S45A 核不育与M S 2B nap 基因的
关系。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
甘蓝型油菜隐性核不育系 S45A 及其表型正常
的姊妹系 S45B 由西南农业大学油菜育种研究室提
供, 种植在西南农业大学农场。
1. 2　减数分裂期和单核期的细胞学鉴别
细胞学鉴定按照余凤群等[ 7 ]的方法略有改动,
在油菜现蕾后, 取一整枝花序用卡诺氏固定液固定
2 h, 转入 70% 乙醇, 贮存在 4℃冰箱中。按蕾长由
小到大依次用改良卡宝品红染色和压片, 进行显微
观察。统计蕾长与雄配子发育时期的关系。
1. 3　油菜花蕾m RNA 的制备
在提取 RNA 的当日上午, 到田间分取可育株
和不育株花蕾, 测量两者的花蕾长度, 根据蕾长选
取减数分裂期和单核期的花蕾各 5 g, 加入液氮迅
速研磨成粉状, 按照mRNA Iso lation System (L IFE
T ECHNOLO GY Inc. )的步骤操作, 纯化mRNA。
1. 4　cD NA 的合成
用M annheim Boeh ringer 公司的 cDNA Syn the2
sis K it 合成 cDNA。操作步骤按试剂盒说明书进行。
1. 5　引物设计及扩增程序
根据 Gene Bank (基因编号 X99922) 提供的
M S 2B nap 基因的全长序列, 为便于测序将M S 2B 2
nap 基因分成互有部分序列重叠的三段, 长度依次
为 799 bp、761 bp、487 bp。按此三段的序列分别设
计特异引物进行扩增 (表 1)。
表 1　引物序列及其在M S2B nap 基因全序列中的位置
Table 1　Sequence of pr imers and its place in the M S2B nap complete sequence
引物编号
No. of p rim er
引物序列
Sequence of p rim ers
在M S 2B nap 基因中的位置
P rim ers′p lace in the sequence of M S 2B nap (bp)
P rim er1 5′2AA TGGAA TGGACA GTTTACTGTC23′ 1～ 23
P rim er2 5′2GAA GGTTGTA TTGGCA GCTGA G23′ 778～ 799
P rim er3 5′2CA GA TTCA GA GGA GA TTGC23′ 732～ 753
P rim er4 5′2GAA GCTCA GCTAA GTCCTCG23′ 1483～ 1502
P rim er5 5′2CGTGTA TCA GA TCGCTTC23′ 1441～ 1458
P rim er6 5′2TTTGACCTAA GCCCTTCC23′ 1909～ 1927
　　本试验的扩增产物将用于测序, 为提高 PCR
的保真性, 降低其误掺率, 所有扩增体系均采用大
连宝生物工程有限公司的高保真扩增试剂盒
(TA KA RA LA PCR K it V er2. 1)。扩增循环参数
为: 94℃ 3 m in; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 m in
35cycles; 72℃, 10 m in。
1. 6　PCR 产物的克隆
经 1. 2% 的琼脂糖凝胶电泳后, 在紫外灯下用
刀片挖取含目的片段的凝胶, 用试剂盒 (GFXTM
PCR DNA and Gel Band purification K it) 进行 PCR
产物回收。回收的 PCR 产物克隆到 pGEM ○R 2T vec2
to r 上。
1. 7　测序与基因数据分析
经酶切验证后的克隆, 寄到大连宝生物工程有
限公司测序。测序结果的同源性比较采用BLA ST
分析程序 (h ttp∶ööwww. ncbi. n lm. n ih. govöen2
trezönucleo tide. h tm l)。基因序列比较采用DNA S2
TA R 软件。
2　结果与分析
2. 1　M S2Bnap 的扩增结果
以可育株与不育株的 cDNA 为模板进行扩增,
单核期 cDNA 均未扩出任何产物, 而减数分裂期
cDNA 都能扩出稳定的条带 (图 1)。造成该现象的
原因可能是M S 2B nap 的mRNA 只在减数分裂期
转录表达, 而在单核期不转录表达。以可育株和不
育株减数分裂期的 cDNA 为模板扩增, 均扩出预期
长度的三段产物 (图 2) , 分别将其命名为 F ragm en t
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É、Ê 和Ë。
图 1　P rim er5、P rim er6 以减数分裂期和单核期
cDNA 为模板的扩增结果
1: DNA 分子量标记; 2、3、4、5: 以减数分裂期 cDNA 为模板的
扩增结果; 6、7、8、9: 以单核期为模板的扩增结果; 2、4、
6、8 为可育株; 3、5、7、9 为不育株; 10: 空白对照.
F ig 1　A grose gel electrophoresis parttern using m eiosis
and single nuclear stage cDNA as PCR temp late. L ane 1:
M arker; L ane2, 3, 4 and 5: m eiosis stage cDNA ; L ane6,
7, 8 and 9: single nuclear stage cDNA ; L ane2, 4, 6,
8: m ale fertile line; L ane3, 5, 7, 9: m ale
sterile line; L ane 10: blank contro l.
图 2　三对引物的扩增结果
1: DNA 分子量标准; 2、4、6: 可育株扩增产物; 3、5、7:
不育株扩增产物; 2、3: 引物 P rim er1 和 P rim er2 扩增产物
(F ragm entÉ ) ; 4、5: 引物 P rim er3 和 P rim er4 扩增产物
(F ragm entÊ ) ; 6、7: 引物 P rim er5 和 P rim er6
扩增产物 (F ragm entË ).
F ig. 2　A grose gel electrophoresis pattern of th ree pair p rim ers.
L ane 2 and 3: The p roducts of PCR w ith P rim er 1 and P rim er 2 for
fragm entÉ (1～ 799 bp) ; L ane 4 and 5: The p roducts of PCR w ith
P rim er 3 and P rim er 4 for fragm entÊ (732～ 1502 bp) ; L ane 6 and
7: the p roducts of PCR w ith P rim er 5 and P rim er 6 for
fragm entË (1441～ 1927 bp) ; L ane 1: M arker; L ane 2,
4, 6: p roducts of m ale fertile line; L ane 3,
5, 7: p roducts of m ale sterile line.
2. 2　序列比较与分析
把 S45A (不育株) 和 S45B (可育株) 的M S 2B 2
nap 基因同源序列进行比较时发现, S45A 和 S45B
的M S 2B nap 基因同源序列间存在差异 (两次扩增
与测序的结果相同)。将来自甘蓝型油菜核不育两
用系材料 S45A 和 S45B 中的与M S 2B nap 基因同
源序列分别称为m s 和m f, 并将它们同 Gene Bank
已登录拟南芥控制核育性的基因M S 2 和甘蓝型油
菜可育基因M S 2B nap 进行比较。结果显示: 从
S45B 克隆的同源序列m f 和M S 2 与M S 2B nap 的
同源性分别为 88% 和 99%。由此表明: m f 和
M S 2、M S 2B nap 基因具有相同的序列结构。并且
在两个地域相差甚远的甘蓝型油菜不同材料中克隆
的M S 2B nap 基因碱基间差异较小。说明M S 2B nap
基因存在较强的保守性, 这种较强的保守性也表明
S45A 和 S45B 在M S 2B nap 基因上存在的差异很可
能造成了 S45B 育性的变化。
两次测序结果均显示: S45B 和 S45A 序列间有
4 个核苷酸存在差异 (图 3)。涉及到 4 个密码子, 其
中有 3 个密码子虽然发生了变化 (AA CöAA T、
TCT öTCC、AA CöAA T ) , 但它们所编码的氨基酸
并未发生变化, 为同义突变。另 1 个密码子的变化
(AAA öA GA ) 为错义突变, 其编码氨基酸由赖氨酸
变为精氨酸, 均为碱性带正电荷氨基酸, 为同类型
氨基酸间的变化。发生错义突变的位点处, S45B
(可育株)的碱基 (AAA )与M S 2B nap 相同位置的碱
基序列 (AAA ) 相同, 而 S45A (不育株) 碱基在相同
位点AAA 产生点突变成为A GA。
M S 2、M S 2B nap、m f 和m s 基因编码的氨基酸
序列同源性比较表明 (图 4) : M S 2、M S 2B nap、m f
和m s 均编码 616 个氨基酸。在 616 个氨基酸中,
M S 2 和M S 2B nap 之间共有 59 个氨基酸存在差异,
其两者编码氨基酸的同源性为 90. 4% [ 6 ]。m f 编码
的氨基酸和M S2 编码氨基酸之间共有 65 个氨基酸
的差异, 同源性为 89. 44% ; 与M S 2B nap 编码氨基
酸相比只存在 4 个氨基酸差异, 同源性高达
99. 35%。m s 和M S 2、M S 2B nap 编码的氨基酸之
间的差异除第 312 位氨基酸 (3 标记处) 外, 其余差
异均和m f 与M S 2、M S 2B nap 的差异相同。在第
312 位氨基酸处m s(S45A 不育株的M S 2B nap 同源
序列) 编码的氨基酸精氨酸 (R ) , 而M S 2、M S 2B 2
nap 和m f (S45B 可育株的M S 2B nap 同源序列) 编
码的都是赖氨酸 (K)。M S 2、M S 2B nap 和m f 的均
表现为可育, 而m s 表现为不育, 可能正是由于这
一氨基酸的变化使 S45B 可育性状发生突变而表现
为不育性状。M S 2、M S 2B nap、m f 和 m s 编码
的氨基酸与希蒙德木 ( jo joba) 的脂肪酰还原酶显示
31 期　　　　李德谋等: 甘蓝型油菜隐性核不育两用系 S45AB 中与M S 2B nap 基因同源片段的克隆及序列分析　　　　　　

图 3　　M S 2B nap、S45B (m f)与 S45A (m s)差异部分 cDNA 序列及其编码氨基酸序列的
比较 (氨基酸用单字母表示, 阴影和下划线表示核苷酸及其编码氨基酸的差异. )
F ig. 3　　A lignm ent of the partial cDNA and deduced am ino acid sequence from M S 2B nap , m ale
fertile (m f) and m ale sterile (m s) line. (N um bers at the righ t m argin refer to the nucleo tide
position. The encoded am ino acids are designated by single2letter codes. The differential
nucleo tide site and its deduced am ino acid are underlined and been shadow. )
了较高的同源性, 脂肪酰还原酶与希蒙德木种子发
育时蜡酯的合成有关[ 6 ]。
　　M S 2 编码的氨基酸序列与M S 2B nap、m f 和
m s 编码的氨基酸序列存在着相对较大的差异, 而
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M S 2B nap、m f 和m s 三者所编码氨基酸序列间差异
较小。造成这种结果的原因可能就在于M S2 是来
自于拟南芥属, 而M S 2B nap、m f 和m s 为芸薹属中
不同的甘蓝型油菜品种, 属间的差异往往比种间,
品种间的差异大。
图 4　　M S 2、M S 2B nap、m f (S45B)和m s(S45A )
编码氨基酸序列的比较
(方框和3 标记处氨基酸为不育的推测位点)
F ig. 4　　Comparison of the p redicted am ino acid sequence of
M S 2, M S 2B nap , m f (S45B) and m s (S45A ) cDNA p redicted
am ino2acid sequence. A putative m ale sterility am ino
acid residues w as m arked w ith box and star.
3　讨论
3. 1　M S2B nap 基因在 S45AB 上的差异与育性的
关系
拟南芥的m s2 不育突变体是由于A CAAA C 之
间插入了一个或多个A 或 T 造成[ 2 ] , 而M S 2B nap
是从花粉特异 cDNA 文库中克隆到的序列, 是花粉
特异性基因, 但它发生不育突变的位点未见相关报
道。本实验克隆到的可育与不育的 cDNA 序列, 有
4 处发生了单个碱基的替换。在这 4 个单碱基的替
换中, 其中 3 个单碱基的替换是同义突变, 1 个单
碱基的替换为错义突变。错义突变致使原有的氨基
酸顺序发生改变, 即蛋白质的一级结构发生改变,
一级结构的改变可能引起由它构成的蛋白质的二级
结构或三级结构的变化, 影响蛋白质的活性, 甚至
使活性丧失从而影响了表型。S45B 可育株和 S45A
不育株之间在M S 2B nap 基因编码氨基酸上的差
异, 可能使 S45B 可育株原有表现为正常可育的生
物功能丧失, 而导致了不育的产生。M S 2B nap 基
因及其与之高度同源的M S2 基因编码产物和 jo joba
的脂酰还原酶具有较高的同源性 (41. 4% ) , 推测其
功能和形成花粉壁有关[ 6 ]。可能是不育 cDNA 编码
的氨基酸发生了变化, 改变了原有酶的活性, 使花
粉壁的形成受阻或不能正常形成花粉壁而导致不
育。至于甘蓝型隐性核不育油菜 S45A 的不育性状
是否确实由M S 2B nap 基因的突变引起, 还需通过
进一步的研究来确定。
3. 2　M S2B nap 基因表达的时间特异性
拟南芥的M S 2 基因经原位杂交表明在小孢子
发育早期的绒毡层中表达。进一步的启动子特异性
分析表明, 其融合的 GU S 活性开始于四分体释放
小孢子, 结束于小孢子的第一次有丝分裂[ 3 ]。本实
验扩增过程中发现, 只有以减数分裂期合成的
cDNA 为模板时, 才能扩增出产物, 而在单核期尽
管扩增时退火温度降低到 48℃也仍然扩不出任何
产物。其原因很可能是M S 2B nap 基因只在减数分
裂期表达, 而在单核期不表达或表达量极低。
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