全 文 ： DOI: 10.13344/j.microbiol.china.160188
超积累和非超积累生态型东南景天茎叶内生细菌多样
性分析
邓平香 郭荣荣 余光伟 种云霄 龙新宪∗
(华南农业大学资源环境学院 广东 广州 510642)
摘 要：【目的】探究和比较超累积生态型东南景天和非超累积生态型东南景天茎、
叶微生物群落结构的异同。【方法】采用高通量测序技术研究了野外两种生态型东
南景天叶片和茎的内生细菌群落结构。【结果】4 个样品总共得到 366 783 条有效
序列和 39 948 个 OTU (97%相似度)。从 Shannon 指数得知：两种生态型东南景天
叶片内生菌的多样性均高于茎；超积累生态型东南景天叶片内生菌的多样性高于
非超累积生态型，但非生态型东南景天茎组织中内生菌多样性高于超累积生态型
东南景天茎。超累积生态型东南景天的叶片和茎内生菌分别包括 26 和 21 个门，
123 和 117 个科；非超积累生态型东南景天叶片和茎中的内生菌分别包括 43 和 22
个门，175 和 83 个科，4 个样品的优势菌群均为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌
门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和蓝藻细菌门
(Cyanobacteria)。在属分类水平上，超累积生态型东南景天叶片和茎第一优势菌属
分别为 Synechococcus 和 Plesiomonas；非超累积生态型东南景天叶片和茎组织第
一优势菌群分别为 Pseudomonas 和 Dechloromonas。【结论】两种生态型东南景天
的叶片和茎中均具有丰富的内生细菌，但超累积生态型东南景天叶片内生菌多样
性最大，且存在一些独有的功能菌群。
关键词：东南景天，内生细菌多样性，高通量测序
Characterization of endophytic bacterial communities from
leaves and stems of two ecotype of Sedum alfredii by high
-throughput sequencing
DENG Ping-Xiang GUO Rong-Rong YU Guang-Wei ZHONG Yun-Xiao
Foundation item: National Natural Science Foundation of China (No. 41471264)
∗Corresponding author: Fax: 86-20-85288326; E-mail: longxx@scau.edu.cn
Received: , 2016; Accepted:, 2016; Published online (www.cnki.net): August 01, 2016
基金项目：国家自然科学基金项目(No. 41471264)
*通讯作者：Fax：86-20-85288326；E-mail：longxx@scau.edu.cn
收稿日期：2016-03-02；接受日期：2016-05-06；优先数字出版日期(www.cnki.net)：2016-08-01

网络出版时间：2016-08-01 11:31:52
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1996.Q.20160801.1131.001.html
LONG Xin-Xian*
(College of Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong
510642, China)
Abstract: [Objective] The ability of accumulation of Zn and Cd between the
hyperaccumlating and non-hyperaccumulating ecotypes of Sedum alfredii differed
significantly, which might be related to their endophytic bacteria communities. Thus,
the objective of this study is to investigate and compare the endophytic bacterial
communities between two ecotypes of S. alfredii. [Methods] By using high-throughput
sequencing technique, a research on the diversity of endophytic bacterial communities
in leaves and stems samples of the hyperaccumulating and non-hyperaccumulating of S.
alfredii was conducted. The samples of the hyperaccumulating of S. alfredii were
collected from an old lead-zinc mine located in Quzhou city, the west of Zhejiang
province, and the non-hyperaccumulating of S. alfredii were collected from a tea garden
located in Jiuxi, Hangzhou city, the north of Zhejiang province. [Results] A total of 366
783 sequences and 39 948 Operational Taxonomic Units (OTUs) were obtained from
the four samples (at the level of 97%). The index of Shannon indicated that endophytic
bacterial biodiversity in the leaves of two ecotype of S. alfredii were consistenly higher
than in the stems, endophytic bacterial biodiversity in the leaves of hyperaccumulator
ecotype of S. alfredii were higher than in the leaves of non-hyperaccumulator ecotype
of S. alfredii, while the reverse was true for the stem samples. Endophytes in the leaves
and stems samples of the hyperaccumulator ecotype of S. alfredii included 26 and 21
phyla, 123 and 117 families respectively, while the non-hyperaccumulator ecotype of S.
alfredii included 43 and 22 phyla, 175 and 83 families respectively. In addition, the
most abundance associated with the four sample libraries were consistently found to be
related to Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria and Cyanobacteria.
On the genus level, the most abundance bacteria associated with the leaves and stems of
hyperaccumulator ecotype of S. alfredii were Synechococcus and Plesiomonas, while
Pseudomonas and Dechloromonas were for the leaves and stems of
non-hyperaccumulator ecotype of S. alfredii. [Conclusion] Diverse communities
endophytes inhabit leave and stems of the two ecotype of S. alfredii, while the most
endophytes diversity of the four samples was the leave of hyperaccumulator ecotype of
S. alfredii.
Key words: S. alfredii， Endophytic bacterial biodiversity， High-throughput sequence
内生菌是植物组织内的正常菌群，包括了互惠共利的和中性的共生细菌，它们的存在不
会使植物出现可见的伤害或功能的改变[1]。近年来，重金属超积累植物的内生细菌引起了广
大研究者的关注，研究者陆续从超积累植物中分离和纯化具有抗金属的、促植物生长特征的
内生细菌，并将这些功能菌应用于植物修复中[2]。Indris等(2004)首次研究了Ni超积累遏蓝菜
(Thlaspi goesingense)的内生菌群落结构，其优势菌属为变形菌(Proteobacteria)的鞘氨醇菌属
[3]。Shin等(2012)从Pb超累积植物桤木(Alnus firma)的根部分离出14株内生细菌，其中芽孢杆
菌(Bacillus sp.)MN3-4能够产铁载体和IAA，对Pb具有很强的去除率[4]。一些研究者认为，植
物超累积重金属的机制很可能与定殖于其组织内的内生菌多样性有着十分密切的关系。Li
等(2012)研究发现，不同组织器官的重金属浓度不同会导致其体内定殖的内生菌对重金属的
敏感性和耐受性不同[5]；Weyens等(2010)也发现，生长在同一重金属污染土壤上的两种不同
品种的柳树，它们对金属抗性和积累能力与其根系和地上部的内生菌多样性呈正相关[6]。这
说明不同植物对污染物的耐性、积累和解毒能力与其体内定殖的内生菌息息相关。
目前，研究植物内生菌多样性的方法主要有培养法和非培养法。通常，培养法难以模拟
自然界中微生物生长的真实条件，相当多的内生细菌处于活的、不可培养状态。随着分子生
物学技术的发展，基于16S rRNA基因的指纹图谱技术如(变性梯度凝胶电泳) DGGE、(温度
梯度凝胶电泳) TGGE、(单链构象多态性检测) SSCP、(核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分
析) ARDRA和(末端限制性片段长度多态性指纹技术) T-RFLP等被广泛用于微生物群落的研
究中[7]，尤其是近年来发展迅速的高通量测序技术具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨
大等优势[8]。Chen等(2012)利用16S rRNA基因克隆文库技术对龙葵的内生菌进行测序，主要
为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门
(Actinobacteria)[9]。Lundberg等(2012)采用高通量测序对600多株拟南芥植物的根系内生菌进
行研究，发现内生菌群落结构和多样性主要受植物的生育期和基因型的影响[10]。Liu等(2014)
采用高通量测序技术研究了诺丽(Morinda citrifolia L.)种子内生菌群落结构，丰度排名前10
的OTUs主要属于Pelomonas sp.，Ochrobactrum intermedium，Kinneretia sp.，Serratia sp.，
Paucibacter sp.，Leptothrix sp.，Inhella sp.，Ewingella sp.，Thiomonas sp.和Massilia sp.[11]。
东南景天(Sedum alfredii Hance)是一种以无性繁殖为主、生物量大、生长速率较快的锌、
镉超富集植物，不仅是研究植物超积累重金属机理的模式植物，且已经应用到我国重金属污
染土壤的修复实践中[12]。Long等(2011)从东南景天的叶片、茎、根中分离和纯化了 14株具
有较强的 Zn、Cd抗性的细菌，一些内生菌还具有产吲哚、溶解磷、产铁载体和固氮作用[13]。
张新成(2012)的土培实验也发现，接种内生菌 SaZR4、SaMR12和 SaNRl促进了东南景天的
生长及对重金属的吸收[14]。为了对东南景天内生细菌群落多样性进行全面系统的研究，本
研究拟采用高通量测序技术对两种生态型东南景天叶片和茎内生菌多样性进行比较研究。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
Plant DNA Kit (D4105)植物DNA提取试剂盒，广州捷倍斯生物科技有限公司；TE Buffer，
GBCBIO Technologies；3%次氯酸钠，广州化学试剂厂；30%双氧水，广州化学试剂厂；95%
乙醇，天津市富宇精细化工有限公司。原子吸收光谱仪(火焰) Z-5300，日本Hitachi公司；自
动高压灭菌锅Hirayama autoclave HVE-50，日本Wada Stainless Kogyo公司；CT14RD高速离
心机，天美控股有限公司；Nanodrop 2000超微量分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific
公司；MiSeq平台，美国Illumina公司。
1.2 植物与土壤样品的采集
2013年10月中旬，于浙江衢州铅锌矿山选择3个代表性的采样点，采集数株超累积生态
型东南景天植物，组成一个混合样品；浙江杭州九溪选择3个代表性样点，采集具有代表性
的非超累积生态型东南景天数株，组成一个混合样品。将植物连同根际土壤放入无菌的封口
袋中，地上部裸露于袋外，保持鲜活状态，然后置于纸盒中，于3 d内活体带回实验室。
回到实验室后，立即将植物根际土壤小心抖落在称量纸上，挑去根、种子等杂物，自然
风干后，研磨，分别过20目和100目筛。土壤理化性质的测定参考《土壤农化分析》[15]：土
壤pH采用玻璃电极法，水土比为2.5:1；有机质测定采用重铬酸钾外加热容量法；土壤全N
测定采用浓硫酸消煮-半微量开氏法；全P测定采用高氯酸-硫酸消煮，钼锑抗比色法；全K
采用NaOH熔融-火焰光度法；碱解N采用碱解扩散法、有效K采用火焰光度计测定；有效P
采用钼锑抗比色法；重金属Zn、Cd、Pb全量采用硝酸-氢氟酸-高氯酸消煮法，原子吸收光谱
测定(Z-2000)；重金属Zn、Cd、Pb有效态含量采用1 mol/L NH4NO3浸提法，土水比为1:2.5。
1.3 DNA提取、测序
将采集的东南景天植株用蒸馏水清洗干净，在超净工作台晾干水分。将部分东南景天的
叶、茎、根分开，分别进行样品表面消毒，即：95%乙醇1 min→30%双氧水+3%次氯酸钠(30
min)→95%乙醇1 min→无菌水冲洗3次。液氮速冻，−80 °C保存，用于DNA的提取。称取0.1
g植物样品放入预冷的研钵中，小心注入液氮，充分研磨，待液氮挥发后，迅速收集植物细
粉于1.5 mL离心管中，严格按照捷倍斯植物DNA提取试剂盒中的说明步骤分别提取东南景天
叶、茎的总DNA。DNA样品置于−20 °C保存，送广州基迪奥生物科技有限公司利用MiSeq
平台对16S rRNA基因的V3+V4可变区的PCR产物进行测序，并拼接成Tag，并根据Tag进行
物种分类、OTU分析、多样性分析、多样品的比较分析等。PCR扩增的引物为Primer-F
(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和Primer-R (5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)，每25
μL反应体系包括0.5 U/μL Taq酶1.25 μL，10×PCR buffer (500 mmol/L KCl，100 mmol/L
Tris-HCl pH 8.3，15 mmol/L MgCl2，1% Triton-100) 2.5 μL，200 μmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L
Primer-F 1 μL，10 μmol/L Primer-R 1 μL，25 mg/L模板DNA 2 μL，无菌ddH2O补足至25 μL。
PCR反应条件：94 °C 2 min；94 °C 15 s；50 °C 30 s；72 °C 30 s，35个循环；72 °C 1 min。
1.4 数据处理与分析
为了获得更准确的序列，使用Mothur (v.1.11.0)对原始的测序数据进行过滤处理：首先
去除平均质量低于20的Reads、接头污染的Reads、含N的Reads和低复杂度的Reads；样品通
过Barcode合并建库，得到Clean Data后，根据Barcode序列，采用公司内部撰写的程序对样
品进行拆分。序列拼接使用软件FLASH (Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11)，利
用重叠关系将双末端测序得到的成对Reads组装成一条序列，得到高变区的Tags。将经过上
述处理的Clean Tags进行OTU聚类，然后通过对OTU注释完成OTU的物种分类。利用软件
USEARCH (v7.0.1090)将拼接好的Tags聚类为OTU (利用UPARSE在97%相似度下进行聚
类)。利用Mothur (v.1.11.0)绘制稀释性曲线。为获得每个OTU (Operational Taxonomic Unites)
的分类学信息，在97%相似度下进行聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到用于物
种分类的OTU。利用软件SLP、Mothur将OTU综合分类表中的信息按门、纲、目、科、属5
个水平分类，分别统计各样品在不同分类水平上的菌群组成及丰度。软件及算法：Qiime平
台，RDP Classifier (版本2.2)，置信度阈值为0.7。
样品复杂度分析包括：单样品的多样性分析[Alpha多样性，Mothur (v.1.11.0)]可以反映
微生物群落的丰度和多样性(用于指数评估的OTU相似水平97%)；Beta多样性分析[Mothur
(v.1.11.0)]，反映不同样品间在物种多样性方面存在的差异大小；利用PCA分析法(CANOCO
for Windows 4.5)分析两种生态型东南景天叶、茎内生菌群落结构相似水平；根据在科水平
对各样品中物种丰度的统计结果，计算样品间距离，并对样品进行聚类分析[R(V.2.9.1)]，以
判断在“科”水平上各样品物种组成的相似性。
2 结果与分析
2.1 两种生态型东南景天根际土壤性质的差异
超累积生态型东南景天的根际土壤偏酸(pH 5.9)，土壤Cd、Pb、Zn全量及有效态含量非
常高(表1)；非超累积生态型东南景天的根际土壤呈极酸性(pH 3.9)，土壤中Cd、Pb、Zn全量
和有效态含量远远低于超累积生态型。两种生态型东南景天根际土壤的营养水平相近，N、
P、K全量及有机质含量水平均相差不大，但非超累积生态型东南景天根际土壤中的碱解N
和有效P含量均显著高于超累积生态型，前者分别是后者的2.5倍和5.1倍。
表 1 两种生态型东南景天的根际土理化性质
Table 1 Physicochemical properties of the rhizosphere soils of two ecotypes of S. alfredii
项目
Property
超累积
Hyper accumulator
非超累积
Non-hyper accumulator
有机质 Organic matter (g/kg) 35.52±2.39 42.14±1.15
全氮 Total N (g/kg) 2.00±0.08 2.18±0.02
碱解氮 alkali-hydrolyzale N (mg/kg) 58.50±2.93 148.23±8.97
全钾 Total K (g/kg) 19.03±1.77 11.28±0.32
有效钾 Available K (mg/kg) 121.7±1.97 123.99±4.15
全磷 Total P (g/kg) 1.02±0.00 0.69±0.05
有效磷 Available P (g/kg) 11.75±0.80 60.18±3.38
pH 5.90±0.06 3.90±0.09
全镉 Total Cd (mg/kg) 31.33±0.32 0.06±0.01
有效镉 Available Cd (mg/kg) 0.59±0.01 0.01±0.00
全铅 Total Pb (mg/kg) 5 756.73±162.77 25.47±0.49
有效铅 Available Pb (mg/kg) 0.26±0.01 0.39±0.02
全锌 Total Zn (mg/kg) 2 363.02±17.16 70.93±0.61
有效锌 Available Zn (mg/kg) 8.55±0.07 1.64±0.10
注：数据为平均值±标准差(n=3)，下同.
Note: Values are mean ± standard deviation (n=3), the same below.
2.2 两种生态型东南景天叶、茎的内生细菌的多样性
通过对V3+V4区测序，4个样品的原始序列为547 819条，利用RDP Classifier过滤掉低质
量的序列后，有效序列的总数为366 783条(表2)。为了比较这些样品的细菌种类的丰度，在
97%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTU，统计得到各个样品在不同OTU中的丰度信
息，4个样品共产生39 948个OTU。非超累积东南景天叶片(NHL)和茎(NHS)有效序列分别比
超累积东南景天叶片(HL)高32.21%和12.82%；两种生态型东南景天叶片OTU数目均显著高
于茎，前者是后者的2.04−3.77倍。







表 2 样品的高通量测序结果和 OTUs数量
Table 2 Summary of high-throughput sequencing Data and Number OTUs
样品名称
Sample name
原始序列数量
Original sequence
number
有效序列数量
Available sequence
number
有效序列比例
Valid serial ratio (%)
OTU数量
Numbers of OTU
NHL 204 252 143 567 70.29 18 724
HL 156 546 108 590 69.37 10 904
NHS 95 478 60 765 63.64 4 964
HS 91 543 53 861 58.84 5 356
注：NHL：非超累积生态型东南景天的叶片组织；HL：超累积生态型东南景天的叶片组织；NHS：非超累积生态
型东南景天的茎组织；HS：超累积生态型东南景天的茎组织.
Note: NHL: The leaves of non-hyperaccumulator ecotype of S. alfredii; HL: The leaves of hyperaccumulator ecotype of S.
alfredii; NHS: The stems of non-hyperaccumulator ecotype of S. alfredii; HS: The stems of hyperaccumulator ecotype of
S. alfredii.
Shannon指数综合考虑了OTU丰度和均匀度，Shannon和NpShannon指数越大，Simpson
指数越接近于 0，则表示该样品中的物种越丰富。超累积生态型东南景天叶片组织(HL)中内
生菌的多样性最大，其 Shannon指数比非超累积生态型东南景天叶片(NHL)高 13%，但非超
累积生态型东南景天茎组织(NHS)中内生菌多样性大于超累积生态型东南景天组织(HS)，其
Shannon指数比超累积生态型东南景天茎组织(HS)高 35% (表 3)。
表 3 两种生态型东南景天叶、茎组织中内生菌的 α多样性指数
Table 3 Alpha diversity of endophytic bacteria in the leaves and stems samples of two ecotypes S. alfredii
多样性指数
Alpha diversity chao1 ACE Shannon NpShannon Simpson
NHL 115 647 273 963 4.47 4.81 0.16
HL 70 511 196 906 5.03 5.23 0.04
NHS 31 219 76 451 4.47 4.63 0.06
HS 30 852 76 671 3.31 3.54 0.18

2.3 两种生态型东南景天叶、茎内生菌的群落结构组成
非超累积和超累积生态型东南景天叶片、非超累积东南景天茎和超累积东南景天茎中的
内生细菌分别属于 43、26、22和 21门，这说明在门分类水平上，非超累积东南景天叶的内
生菌多样性最高，超累积东南景天茎的内生菌多样性最低。其中变形菌门(Proteobacteria)、
拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻细菌门
(Cyanobacteria)在 4种样品中均占有较高的比例(图 1)。对于超累积生态型东南景天茎的内生
菌，超过 51.03%的序列属于拟杆菌门(Bacteroidetes)；而在其他 3 个样品中，变形菌门
(Proteobacteria)为第一优势菌属，在非超累积东南景天叶片、超累积东南景天叶片和非超累
积东南景天茎样品中所占的比例分别为 67.70%、33.91%和 52.57% (图 1)。

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Unclassify
OD1
NC10
Gemmatimonadetes
BRC1
Euryarchaeota
WS5
Tenericutes
Armatimonadetes
TM6
Chlorobi
Planctomycetes
Acidobacteria
Chloroflexi
TM7
Fusobacteria
Verrucomicrobia
Actinobacteria
Cyanobacteria
Firmicutes
Bacteroidetes
Proteobacteria

图 1 两种生态型东南景天叶、茎组织中内生菌在门水平的相对丰度
Figure 1 The relative abundance of endophytic bacteria communities at phylum levels in the leaves and
stems samples of two ecotypes S. alfredii
注：NHL:非超累积生态型东南景天叶片；HL：超累积生态型东南景天叶片；NHS：非超累积生态型东南景天茎；
HS：超累积生态型东南景天茎.
Note: NHL: the leaf of non-hyperaccumulator ecotype of S. alfredii; HL: the leaf of hyperaccumulator ecotype of
S.alfredii; NHS: the stem of non-hyperaccumulator ecotype of S. alfredii; HS: the stem of hyperaccumulator ecotype of S.
alfredii.
非超累积和超累积生态型东南景天叶片、非超累积和超累积生态型东南景天茎中的内生
细菌分别属于 103、58、44和 46个纲。非超累积生态型东南景天叶片和茎的第一优势菌群
均为 γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria) (47.93%和 33.97%)，为变性菌门(Proteobacteria)；超
累积生态型东南景天叶片和茎的第一优势菌群分别为芽孢杆菌纲(Bacilli) (20.84%)和拟杆菌
纲(Bacteroidia) (50.83%)，二者分别属于厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes) (图
2)。
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Others
Unclassify
Nostocophycideae
Phycisphaerae
Cytophagia
OPB56
Flavobacteriia
Sphingobacteriia
Acidimicrobiia
Oscillatoriophycideae
Planctomycetia
Acidobacteria-6
Anaerolineae
Clostridia
TM7-1
Synechococcophycideae
Deltaproteobacteria
Fusobacteriia
Chloroplast
Actinobacteria
Verrucomicrobiae
Alphaproteobacteria
Betaproteobacteria
Bacilli
Bacteroidia
Gammaproteobacteria
图 2 两种生态型东南景天叶、茎组织中内生菌在纲水平的相对丰度
Figure 2 The relative abundance of endophytic bacteria communities at class levels in the leaves and stems
samples of two ecotypes S. alfredii
非超累积和超积累东南景天叶片中的内生菌分别属于 175和 123个科，茎中的内生菌分
别属于 83个科和 117个科。在科分类水平上(图 3)，4种样品的第一优势菌群各不相同。非
超累积型东南景天叶片和茎组织中第一优势内生菌分别为假单胞菌科(Pseudomonas)和气单
胞菌科 (Aeromonadaceae)，所占比例分别为 40.00%和 22.08%，二者均属于变形菌门
(Proteobacteria)中的 γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)；第二优势菌群分别属于(ACK-M)和拟
杆菌科(Bacteroidaceae)，相对丰度分别为 5.80%和 9.11%。超累积型东南景天叶片和茎组织
中的内生菌的优势菌群分别属于芽孢杆菌科(Bacillaceeae)和拟杆菌科(Bacteroidaceae)，相对
丰度分别为 18.54%和 50.24%，分别属于厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌纲(Bacilli)和拟杆菌
门 (Bacteroidetes) 的 拟 杆 菌 纲 (Bacteroidia) ； 第 二 优 势 菌 群 分 别 属 于 疣 微 菌 科
(Verrucomicrobiaceae)和气单胞菌科(Aeromonadaceae)，其相对丰度分别为 9.43%和 10.66%。

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NHL HL NHS HS
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Others
Unclassify
Pirellulaceae
Coxiellaceae
Gomphosphaeriaceae
Syntrophobacteraceae
Desulfobulbaceae
Chlamydomonadaceae
Cryomorphaceae
C111
Alcaligenaceae
Oxalobacteraceae
Clostridiaceae
Rhodobacteraceae
Rhodospirillaceae
Peptostreptococcaceae
Caldilineaceae
Streptococcaceae
Moraxellaceae
Neisseriaceae
Mycobacteriaceae
Comamonadaceae
ACK-M1
Rhodocyclaceae
Synechococcaceae
Fusobacteriaceae
Acetobacteraceae
Enterobacteriaceae
Verrucomicrobiaceae
Bacillaceae
Aeromonadaceae
Pseudomonadaceae
Bacteroidaceae
图 3 两种生态型东南景天叶、茎组织中内生菌在科水平的相对丰度
Figure 3 The relative abundance of endophytic bacteria communities at family levels in the leaves and
stems samples of two ecotypes S. alfredii
非超累积和超累积生态型东南景天叶片、非超累积和超累积生态型东南景天茎的内生细
菌分别属于 221、142、90、121个属。非超累积生态型东南景天叶片和茎的第一优势菌群分
别为假单胞菌属(Pseudomonas) (40.00%)和固氮弓菌属(Dechloromonas) (3.56%)，分别属于变
形菌门(Proteobacteria)的 γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)的假单胞菌科(Pseudomonas)和变
形菌门(Proteobacteria)的 β-变形菌纲(Betaproteobacteria)的红环菌科(Rhodocyclales)；超累积
生态型东南景天叶片和茎的第一优势菌群分别为聚球藻属(Synechococcus) (3.26%)和邻単胞
菌属(Plesiomonas) (6.59%)，分别属于蓝藻门(Cyanobacteria)的蓝藻纲(Cyanobacteria)的色球
藻目(Chroococcales)的第一科和变形菌门(Proteobacteria)的 γ-变形菌纲(Gammaproteobaceria)
的肠杆菌科(Enterobacteriaceae) (图 4)。
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
NHL HL NHS HS
R
el
at
iv
e
ab
un
da
nc
e%
Others
Unclassify
Desulfobacca
Hydrogenophaga
Bacillus
Rubrivivax
Roseomonas
Desulfococcus
Cylindrospermopsis
Brochothrix
Psychrobacter
Luteolibacter
Limnohabitans
SMB53
Microcystis
Microvirgula
Enhydrobacter
Virgibacillus
Brenneria
Clostridium
Fluviicola
Desulfobulbus
Polynucleobacter
Rhodobacter
Pelomonas
Lactococcus
Caldilinea
Acinetobacter
Vogesella
Mycobacterium
Dechloromonas
Synechococcus
Cetobacterium
Plesiomonas
Pseudomonas
图 4 两种生态型东南景天叶、茎组织中内生菌在属水平的相对丰度
Figure 4 The relative abundance of endophytic bacteria communities at genus levels in the leaves and
stems samples of two ecotypes S. alfredii
2.4 两种生态型东南景天叶、茎内生菌群落结构的差异性
β-多样性反映不同样品间在物种多样性方面存在的差异，β-多样性值越接近 0，表示这
两个样品之间的差异越小。如表 4所示，非超累积东南景天叶片和茎组织内生菌的群落结构
差异最大，β-多样性指数为 0.42，其余样品之间内生菌多样性的差异相差不大，β-多样性指
数在 0.24−0.29之间。

表 4 两种生态型东南景天叶、茎内生菌多样性的相关系数
Table 4 Spearman correlations between the leaf and stem tissue in two ecotypes Sedum alfredii
NHL HL NHS HS
NHL 0.00 0.29 0.42 0.29
HL 0.00 0.27 0.24
NHS 0.00 0.28
HS 0.00

在科分类水平，以内生菌的相对丰度大于 1%为阈值，NHL、HL、NHS、HS样品中分
别包含 11、14、16、8个科内生菌。从图 5可知，单独存在于非超累积生态型东南景天叶片
组织的内生菌中有 7 个科，分别为 C111、ACK-M1、Cryomorphaceae、丛毛单胞菌科
(Comamonadaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)、莫拉氏菌科
(Moraxellaceae)，它们的相对丰度分别为 1.60%、5.80%、1.59%、3.29%、1.82%、4.18%和
3.78%。单独在超累积生态型东南景天叶片组织发现的内生菌有 2 个科，分别为梭菌科
(Clostridiaceae)、产碱菌科(Alcaligenaceae)，它们的相对丰度分别为 1.18%和 1.46%。单独在
非超累积生态型东南景天茎组织的内生菌有 2 个科，分别为消化链球菌科
(Peptostreptococcaceae)和(Desulfobulbaceae)，相对丰度分别为 1.78%和 1.16%。超累积型东
南景天茎组织中并没有发现有特殊的内生菌。


图 5 4个样品的内生细菌在科水平的维恩图
Figure 5 Four-way Venn diagram of unique endophytic bacteria at the family level detected in 4 samples
热图通过颜色深浅反应不同物种内生菌所占比例，颜色越红表示物种在该样品中所占比
例越高。如图 6所示，绝大部分内生菌在超累积型东南景天叶片组织所占比例较高，而在超
累积东南景天茎组织中所占比例较低，表明超累积型东南景天叶片组织的物种多样性最为丰
富。特别是，超累积生态型东南景天叶内生细菌的群落结构特异性最高，如分支杆菌科
(Mycobacteriaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链球菌科(Streptococcacea)在超累积生态型叶
片中所占比例较高，而在非超累积生态型东南景天地上部比例都较低。此外，依据内生菌分
布丰度特征(科的水平上)进行聚类，两种生态型东南景天的茎组织内生菌聚在同一分支，表
明它们具有更为相似的内生菌群落结构。



图 6 4个样品的内生细菌在科水平相对丰度热图
Figure 6 The heatmap plot depicts the relative percentage of each bacterial family within 4 samples
注：垂直方向为内生细菌的聚类；水平方向为样品聚类；左上角颜色的梯度变化表示不同的内生细菌相对丰度.
Note: The percentage of each endophytic bacteria clustering on the vertical axis; the 4 samples clustering on the
horizon-axis; the relative values for bacterial family are indicated by color intensity with the legend indicated at the top
left corner.
3 讨论
本研究釆用Illumina公司最新推出的MiSeq平台，对两种生态型东南景天叶片和茎组织中
内生菌的16S rRNA基因的V3+V4区进行测序，获得的有效序列在14−5万条之间，OTU数量
在1.8−0.5万之间(表2)，这说明东南景天的叶片和茎内生菌具有丰富的多样性。与他人的研
究相比较，本研究所获的信息量略低[16]，这可能与不同研究选择的测序区域不同、以及植
物种类不同有一定的关系[17]。例如，Bodenhausen等(2013)对拟南芥叶和根内生菌16S rRNA
基因的V6−V7区测序，共获得有效序列126 841条，3 160条OTU数[18]；Ren等(2015)对水稻叶
片进行16S rRNA基因的V4−V5测序，获得338 711条有效序列和1 387条OTU[19]。16S rRNA
基因的序列包含9个可变区(Variable region)和11个恒定区(Constant region)，V3和V4高变区的
遗传信息可提供丰富的细菌群落结构信息，因此被广泛应用于微生物研究领域[20]。例如，
Shi等(2014)对甜菜进行16S rRNA基因的V3区测序，获得60.84万有效序列[21]。但两种生态型
东南景天内生细菌的种类较其他植物内生细菌更为丰富，非超累积东南景天叶片、超累积东
南景天叶片、非超累积东南景天茎和超累积东南景天茎的门总数分别为43、26、22和21。如
采样高通量测序对细菌16S rRNA基因的V4区测序，发现番茄叶片组织内生菌也由仅由变形
菌门 (Proteobacteria)、放线菌门 (Actinobacteria)、浮霉菌门 (Planctomycetes)、疣微菌门
(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria) 5个门类组成[22]。研究者指出[23-26]，原核微生物
的16S rRNA基因常具有多个和不同的基因拷贝数量，即存在基因组内的异质性，因此，基
于16S rRNA基因的方法测定环境样品中原核微生物的多样性的结果往往偏高。Sun等[23]的研
究进一步发现，基因组内的异质性倾向于特定位点，其中细菌的V1和V6区的异质性最高，
V4和V5区的异质性最小；而且，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)常有多个16S
rRNA基因拷贝数，其OTU多样性被高估的程度比低拷贝数的菌群高。本研究对V3+V4区进
行扩增，在相似度为97%水平对OTU所有序列进行一致性分析，因此，得到的两种生态型东
南景天叶片和内生细菌的多样性结果可能也偏高，但总体上受基因组内异质性影响较小。Sun
等指出，V4−V5区的基因异质性现象最少，尤其适合含有大量厚壁菌门和变形菌门的环境样
品的研究[23]。因此，在今后的研究中测定V4−V5区遗传信息，可能更能真实地体现东南景
天叶片和茎内生细菌的多样性。
两种生态型东南景天叶片和茎组织中的优势内生菌均为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆
菌门 (Bacteroidetes)、厚壁菌门 (Firmicutes)、放线菌门 (Actinobacteria)和蓝藻细菌门
(Cyanobacteria)，尤其变形菌门占绝对优势，其在非超累积生态型东南景天的叶片和茎、超
累积生态型东南景天叶片中的相对丰度分别为67.70%，33.91%和52.57%，这与众多研究者
对植物内生菌群落结构组成的报道相似。例如，利用454焦磷酸测序，Bodenhausen等发现在
拟南芥叶片和根组织中以变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门
(Bacteroidetes)为主要优势细菌[18]。
两种生态型东南景天地上部内生菌群落结构组分虽较为相似，但各个类群细菌所占比例
却相差很大。从图6可知，分支杆菌科、芽孢杆菌科和链霉菌科在超累积生态型东南景天叶
片组织中占较高比例，而在非超累积生态型东南景天叶、茎中所占比例较低。分支杆菌科所
属细菌也常被报道具有降解氯代有机物的作用[27]。黄杆菌属被报道具有Zn/Cd抗性[14]。Shin
等研究发现重金属超累积植物桤木(Alnus firma)根内生菌芽孢杆菌MN3-4能够通过胞外沉淀
和胞内富集的复合机制吸附重金属Pb[4]。陈雯等研究发现胡杨根际菌链霉菌C90具有Cu2+、
Ni2+、Pb2+抗性，链霉菌N22具有Cu2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+抗性[28]。Wang等[29]研究发现，芽孢
杆菌USTB-O可提高小麦对Cu的积累，且能分泌IAA促进植物生长。以往的研究表明耐重金
属内生菌提高植物重金属抗性的机理主要包括在与植物协同进化过程中，内生菌可以耐受多
种重金属污染，并通过固氮作用，溶磷作用，产吲哚乙酸(IAA)、高铁载体和1-氨基环丙烷
-1-羧酸乙酯脱氨酶(ACC脱氨酶)等机制改善植物营养，降低重金属对植物的毒害效应，提高
植物重金属抗性[2]。我们从超累积生态型东南景天中分离出14株重金属抗性菌，发现这些菌
株具有产IAA、铁载体、溶磷、提高东南景天Zn、Cd抗性的作用[13]。
在属分类水平上，两种生态型东南景天叶片和茎段第一优势菌属各不相同。Pseudomonas
为非超累积生态型东南景天叶片第一优势菌，Synechococcus为超累积生态型东南景天叶片第
一优势菌属，Dechloromonas为非超累积生态型东南景天茎第一优势菌属，Plesiomonas为超
累积生态型东南景天茎第一优势菌属。Inceoglu等在6个品种的马铃薯根际土及土著土壤中共
研究发现450个属，主要菌属有33个，包括8个Actinobacteria (放线菌属)，6个Acidobacteria (酸
杆菌属)，5个Alphaproteobacteria (α-变形菌属)，4个Gammaproteobacteria (γ-变形菌属)，3个
Bacteriodetes (拟杆菌属)，2个Chloroflexi (氯降解菌)，Cyanobacteria (蓝藻)，Verrucomicrobia
(疣微菌)，Firmicutes (厚壁菌属)，Gemmatimonadetes (芽单胞菌属)各1个[30]。
基于α多样性指数，超累积生态型东南景天叶片组织(HL)的内生菌物种多样性最高，其
次为非超累积生态型东南景天叶片组织(NHL)和非超累积生态型东南景天茎组织(NHS)，超
累积生态型东南景天茎组织(HS)的内生菌物种多样性最低(表3)。在β多样性指数方面，非超
累积东南景天叶片和茎组织内生菌的群落结构差异最大，其他样品之间群落结构相差不大
(表4)。造成两种生态型东南景天内生细菌差异的原因可能有以下几个方面：(1) 土壤是植物
内生菌的主要来源，两种生态型东南景天生长的土壤成分差异显著(pH、有机质、碱解氮、
有效磷等) (表1)为细菌提供不同的定殖环境[31]，非超累积东南景天根际土的营养水平比超累
积东南景天高，从而导致两种生态型东南景天内生菌群落结构之间存在差异；(2) 不同植物
根系分泌物的差异导致根际环境微生物的动态变化，影响侵染定殖植物体内的内生菌[32]；(3)
超累积生态型东南景天地上部重金属含量远大于非超累积生态型东南景天(表1)，不同组织
器官的重金属浓度不同会导致其体内定殖的内生菌对重金属的敏感性和耐受性不同[33]；(4)
植物内生菌的多样性受植物品种和组织的影响，不同品种的哈密瓜内生菌群落结构有显著差
异[34]，Jin等研究发现植物组织和生育期对中国西北地区瑞香狼毒叶、茎和根内生真菌群落
结构有显著影响[35]，Inceoglu等大田实验的6个品种的马铃薯在幼苗期、开花期和衰亡期根
际土和土著土壤细菌群落结构的多样性，结果发现幼苗期品种对马铃薯根际菌多样性有显著
影响，季节对根际菌和土壤土著微生物均有显著影响[30]。
参 考 文 献
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