全 文 ：第 11 卷 第 3 期 环 境 工 程 学 报 Vol． 11，No． 3
2 0 1 7 年 3 月 Chinese Journal of Environmental Engineering Mar ． 2 0 1 7
基金项目:国家自然科学基金资助项目(41471264)
收稿日期:2015 － 12 － 13;录用日期:2016 － 01 － 08
第一作者:郭荣荣(1989—)，女，硕士研究生，研究方向:污染环境修复。E-mail:835776029@ qq． com
* 通信作者，E-mail:longxx@ scau． edu． cn
促生内生菌假单胞菌Ⅱ8 L4 的 GFPuv标记
及其侵染东南景天的特征
郭荣荣，陆丽婷，种云霄，余光伟，龙新宪*
华南农业大学资源环境学院，广州 510642
摘 要 绿色荧光蛋白标记法是研究内生细菌和宿主互作的重要手段。采用热激法将含有绿色荧光蛋白基因的质粒 pD-
SK-GFPuv导入超积累植物东南景天叶片分离和纯化的、具有促植物生长特性的 Zn、Cd 抗性内生细菌假单胞菌Ⅱ8L4，获得
了具有良好发光表现型的荧光标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A。GFPuv 基因在标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A 中不仅可以稳定表达，且
标记菌株保持了野生型菌株的促植物生长特征，其分泌 IAA和高铁载体、溶解无机磷的能力与野生型菌株之间没有显著差
异，但标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A对 Zn、Cd的抗性水平有所降低。借助激光共聚焦显微镜荧光观察发现，标记菌株Ⅱ8L4-GF-
Puv-A可从东南景天茎扦插苗的伤口处和芽点侵入，并大量迁移至维管束木质部的细胞间隙;标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A 还
可以从根表或根毛侵入根系，并迁移和定殖于根系的维管束内。
关键词 东南景天;内生细菌;GFPuv基因标记;侵染途径
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1673-9108(2017)03-1927-08 DOI 10. 12030 / j． cjee． 201512082
Transformed GFPuv into plant growth promoting endophytic bacteria Pseudo-
monas fluorescens Ⅱ8L4 and its infection and colonization in S． alfredii
GUO Ｒongrong，LU Liting，ZHONG Yunxiao，YU Guangwei，LONG Xinxian*
College of Ｒesources and Environment，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China
Abstract The objective of this study was to fluorescently label the Ⅱ8L4 strain of the endophytic bacteria
Pseudomonas fluorescens，which was isolated from the leaf of the Zn /Cd hyperaccumulator Sedum alfredii and has
high Zn and Cd tolerance，to understand its infection and colonization processes in the Zn /Cd hyperaccumulator
Sedum alfredii． The Ⅱ8L4 strain was tagged with GFPuv by the thermal activation method． The growth curve，
plant growth-promoting characters including secretion of IAA and siderophores，phosphate-solubilizing ability，and
maximum Zn and Cd tolerant concentrations of the tagged Ⅱ8L4 strain were compared with those of the wild type
strain． Confocal laser scanning fluorescence microscopy was used to detect the infection and colonization of the
tagged strain in the stems and roots of Sedum alfredii． The transformants showed strong green fluorescence under
UV-light indicating GFPuv expression，and the GFPuv gene was stably expressed in the tagged strain． Analysis of
the genetic stability and growth parameters indicated that GFPuv was inherited normally in the Ⅱ8L4-GFPuv-A
tagged strain，and its growth rate，secretion of IAA and siderophores，and phosphate-solubilizing ability were com-
parable to those of the wild type strain． However，its Zn and Cd resistance levels were slightly lower compared
with those of the wild type strain． Confocal laser scanning fluorescence microscopy indicated that the Ⅱ8L4-GF-
Puv-A tagged strain infected the stem cuttings and buds of Sedum alfredii and then migrated to the vascular bun-
dles of xylem;the tagged strains could also directly infect the surface of roots or root hairs and then move into and
colonize the root vascular bundles．
Key words Sedum alfredii;endophytic bacterial;GFPuv gene marker;infectious way
环 境 工 程 学 报 第 11 卷
东南景天(Seduma alfredii Hance)是在中国浙江省东南部古老的铅锌矿上发现的一种锌、镉超富集植
物［1-2］。与其他超积累植物相比较，其具有无性繁殖为主、生物量大、生长速率较快、适应性较广等优点，
不仅是我国学者研究超积累植物吸收和积累重金属机理的模式植物，且已应用到我国重金属污染土壤的
修复实践中［3-4］。近年来，研究者陆续从超积累植物的根系、茎或叶片中分离和纯化一些具有促植物生长
特征的、抗重金属的内生菌［5-8］。利用内生细菌强化植物修复重金属污染土壤也引起了国内外研究者的
兴趣［9-12］。LONG等［13］从东南景天的根系、茎和叶片组织中分离出大量具有重金属抗性、促植物生长特性
的内生菌;盆栽实验发现，土壤接种这些特殊内生菌不仅可以提高土壤锌有效性，而且能促进东南景天对
锌的吸收和向地上部转运［14］。张新成［15］以 1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)为唯一氮源的培养基，从东南景
天中筛选到 85 个耐受重金属的内生菌，其中 3 个菌株能促进东南景天的生长和提高 Cd 的修复效率。潘
风山等［16］从东南景天的根部筛选到 4 株对镉具有耐性的、且产生生长素(IAA)和铁载体等促生物质的内
生菌;砂培实验发现，接种上述菌株能促进油菜植株的生长，提高植物对镉的积累量。
随着超积累植物内生细菌研究的兴起，越来越多的具有金属抗性的、促植物生长特性的菌株应用于强
化植物修复重金属污染土壤。然而，应用效果不佳的情况时有发生［14］。其可能是受土著微生物的竞争或
其他不良环境因子的影响，外源接种的细菌并没有在植物根际和 /或植物体内成功定殖，或者其数量没有
达到一定的水平［17-19］。当前对内生细菌强化植物修复重金属污染土壤的绝大部分研究并没有跟踪外源
接种的内生菌在根际土壤中的存活情况、也没有证实它们是否再次成功感染植物成为内生菌并发挥其促
植物生长的作用［7，14，20-22］。东南景天主要依靠茎扦插苗进行无性繁殖，当茎上的芽点与土壤或营养液接
触，就会发出新的根系;如果芽点露出土壤或营养液，就长出新叶或新枝条。唐飞［23］的研究发现，体外接
种内生菌的方式显著影响其对东南景天的生长、吸收和积累 Cd的促进作用，其中“幼苗浸根接种”在促进
东南景天的生长、吸收和累积 Cd方面均高于“种植当天土壤接种菌液”和“植株成活后根际土壤接种菌
液”。因此，内生菌的成功定殖是影响外源接种功能内生细菌提高植物修复效率的重要因素之一。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记技术是研究内生细菌的侵染和定殖动态的有效手
段之一，具有易于检测、无毒性、荧光稳定且适用于活体检测等优点，已成功用于微生物定殖、宿主组织侵
染、微生物动态监测等研究［17-18，24-25］。因此，本研究采用 GFP 技术标记东南景天内生菌，检测其遗传稳定
性、比较其标记前后生长速率、促植物生长特性和重金属抗性，再用共聚焦显微镜观察标记菌株侵染东南
景天的方式，以期明确内生菌侵染和定殖东南景天的机制。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
菌株和质粒:假单胞菌Ⅱ8L4(Pseudomonas fluorescens)是本实验室从超积累生态型东南景天叶片组织
中分离、纯化和保存的内生菌［13］。大肠杆菌 DH5α(E． coli DH5α)购自杭州贤至生物科技有限公司。质粒
pDSK-GFPuv具有卡那霉素抗性，由美国 The Samuel Ｒoberts Noble Foundation 的 Mysore 博士惠赠(质粒点
于滤纸上，风干并邮寄于本实验室)［25］。使用前，将点样纸上的 pDSK-GFPuv 质粒洗脱，利用热激法将质
粒转入大肠杆菌 E． coli DH5α感受态细胞中，扩大培养后(28 ℃，160 r·min －1)，提取目标质粒，分装，
－ 20 ℃ 保存备用。
培养基:内生菌Ⅱ8L4 及其转化子、大肠杆菌 DH5α采用 LB 培养基，分别于 30 ℃ 和 37 ℃下培养。测
定菌株的溶磷作用采用 Pikovskaya’s固体培养基［26］，测定菌株分泌 IAA作用采用 Ｒ2A 培养基
［27］，测定菌
株产高铁载体采用 CAS培养基［28］。
1. 2 质粒 pDSK-GFPuv转化内生菌Ⅱ8L4
CaC12法制备内生菌Ⅱ8L4 的感受态细胞，采用热激法将质粒 pDSK-GFPuv 转化到内生菌Ⅱ8L4 中
［29］。
将转化物涂布于含有 50 μg·mL －1卡那霉素的 LB固体培养基上培养 24 h。在手持式 UV灯下观察菌落，
选择发出强烈绿色荧光的菌落，即为阳性转化子。然后转接到含有 50 μg·mL －1卡那霉素的 LB液体培养
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第 3 期 郭荣荣等:促生内生菌假单胞菌Ⅱ8L4 的 GFPuv标记及其侵染东南景天的特征
基培养 24 h。取 5 μL菌液于洁净的载玻片上，蒸馏水稀释，用洁净的盖玻片轻轻覆盖于载玻片上，在酒精
灯的外焰出迅速来回 3 ～ 5 次，固定，荧光显微镜(DM5000B)下观察(480 nm)，挑取发绿色荧光的转化子
Ⅱ8L4-GFPuv在 LB培养基上划线培养，4 ℃保存。
1. 3 标记菌株的遗传稳定性检测
把对数生长期的标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A以 1%的比例接种到新鲜的 LB液体培养基中，每 12 h 转接
一次。连续转接 30 次，划线于含有 50 μg·mL －1卡那霉素的的 LB固体平板培养基上，观察菌株的生长情
况，并用手持式 UV灯观察菌株的发绿色荧光情况。
1. 4 标记菌株与野生型菌株的生物学特性比较
1. 4. 1 菌株的生长曲线
将处于对数生长期的野生型菌株和标记菌株培养至相同的浓度(OD600≈0. 6)，按照 1%的比例接种
到新鲜的 LB 培养液中，28 ℃，180 r·min －1下振荡培养，每隔 3 h 取样，用紫外分光光度计测定 OD600值，
再以 OD600值对不同时间作图。并分别计算野生型菌株和标记菌株的生长代时(以 G表示)。
G =
T2 － T1
(lgw1 － lgw2)/ lg2
式中:T1 为进入对数期的时间，T2 为结束对数期的时间;W1 为 T1 时刻的 OD600值，W2 为 T2 时刻的 OD600的
吸光值。
1. 4. 2 菌株的溶磷作用
菌株在 LB液体培养基上活化培养 12 h后，取 10 μL菌液点接到 Pikovskaya’s固体培养基上，30 ℃下
培养 1 周，观察菌落周围是否出现明显的亮圈，如果有，说明该菌株对无机磷化合物有溶解作用，记录溶解
圈的直径，比较标记菌和野生菌的溶解无机磷的能力。
1. 4. 3 菌株的产吲哚乙酸作用
将野生型和标记菌株分别接种于 50 mL 的 Ｒ2A 液体培养基，每个菌株重复 3 次，在恒温摇床上
(28 ℃，转速为 180 r·min －1)培养 4 d。将菌悬液 10 000g 离心 10 min，取上清液 5 mL，加入等体积
Salkowski 比色液(50 mL 35% HClO4 + 1 mL 0. 5 mol·L
－1 FeCl3)，避光静置 30 min，采用分光光度法测定
其 OD530值。对照标准曲线确定分泌 IAA的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的 IAA梯度稀释制备。
1. 4. 4 菌株的产高铁载体检测
将处于对数生长期的细菌直接接种到含有 CAS 的蓝色琼紫培养基，28 ℃培养 7 d，在蓝色 CAS 平板
上能生长、且菌落周围形成黄色晕圈的菌落为高铁载体产生菌，记录晕圈直径，比较标记菌和野生菌的产
高铁载体能力的差异。
1. 4. 5 菌株的对 Zn、Cd的抗性水平
将标记菌株和野生菌株在 LB液体培养基上活化 24 h后，划线接种于含有不同锌、镉浓度的 LB 固体
培养基上，其中 Zn的浓度分别为 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 和 15 mmol·L －1;Cd 的浓度分
别为 0、0. 5、1、1. 5 和 2 mmol·L －1。菌株在 30 ℃下培养 1 周，观察菌株的生长情况，确定菌株对 Zn、Cd的
最大忍耐浓度。
1. 5 标记菌株侵染东南景天的茎和根系
将标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A 接种到 100 mL 含 50 μg·mL
－1 Kana 的 LB 液体培养基中，培养约至
1010 cfu·mL －1，离心菌体(4 ℃，5 000 r·min －1，5 min)，用灭菌的生理盐水洗涤 3 遍，再用无菌水重悬沉
淀物，并稀释至 OD600≈0. 6 备用。将超累积生态型的东南景天茎扦插苗洗涤干净，将整株植物表面消毒
(先用 70%酒精对植物表面消毒 30 s，然后再用 1 g·L －1的 HgCl2 溶液表面消毒 5 min，无菌蒸馏水洗涤 5
遍)。移栽前，用无菌剪刀修剪茎的末端，使其形成新的伤口。
在无菌操作台上，将东南景天的茎扦插苗移栽到装有 50 mL灭菌的 MS液体培养基的三角瓶中(用海
绵固定植物，并用锡纸包裹瓶身避光)。移栽植物前，吸取上述 3 mL 标记的菌悬液于培养液中，放入光照
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环 境 工 程 学 报 第 11 卷
培养箱中培养(光照 12 h，黑暗 12 h，温度 25 ℃)。分别于培养第 1 天、第 2 天、第 3 天取样，采用激光共聚
焦显微镜(LSM 7 DUO)观察东南景天的茎组织的横切面和纵切面，并拍照。
将蛭石与珍珠岩的混合基质(1 ∶ 3)300 g 放入组培瓶中，加入 50 mL的 1 /10 的 MS 液体培养基，灭菌
备用。在无菌操作台上，分别将上述东南景天茎扦插苗转接到上述基质中，培养至生根后(约 10 d)，再均
匀加入 3 mL上述标记菌悬液 。分别于培养第 1 天、第 2 天、第 3 天取东南景天的根系进行压片，在激光
共聚焦显微镜(LSM 7 DUO)下观察，并拍照。
2 结果与讨论
2. 1 假单胞菌Ⅱ8L4 的 GFP标记及其遗传稳定性
图 1 标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A在荧光显微镜下的
照片 (放大 10 倍)
Fig． 1 Photo of marked strain Ⅱ8L4-GFPuv-A under
fluorescence microscope (magnifications was 10 times)
将内生菌Ⅱ8L4 的感受态细胞和质粒 DNA 热激
后的菌液，涂布于含有 50 μg·mL －1 Kana 的 LB 固
体培养基上培养 16 h后，长出 4 个菌落，其菌落形态
与原始Ⅱ8L4 相似、但颜色略带黄绿色。将平板放置
于手持紫外光下，4 个菌落均发出强烈的绿色荧光。
因此，将 4 个转化子全部挑出，分别标记为Ⅱ8L4-GF-
Puv-A、Ⅱ8L4-GFPuv-B、Ⅱ8L4-GFPuv-C、Ⅱ8L4-GFPuv-
D。在荧光显微镜下，单个菌体细胞均发出强烈的绿
色荧光，为典型的杆状细菌(图 1)，这说明含绿色荧
光蛋白基因的质粒 pDSK-GFPuv 成功转入内生菌
Ⅱ8L4 中。
采用 GFP标记技术研究内生菌与宿主植物之间
关系的前提条件是 gfp基因在标记菌株侵染、定殖宿
主植物的过程中能够稳定表达。然而，采用质粒载
体将 gfp基因转入目标菌株的最大问题是带有 gfp 基因的质粒在菌株繁殖过程中可能丢失或者不表
达［30］。本研究发现，转化子Ⅱ8L4-GFPuv-A、Ⅱ8L4-GFPuv-B、Ⅱ8L4-GFPuv-C、Ⅱ8L4-GFPuv-D 在无选择性
LB液体培养基上继代培养 30 次后，转接到在含有 Kana的 LB固体平板培养基上培养 1 d 后，4 个转化子
不仅生长旺盛，而且发出强烈的荧光，这说明 GFPuv基因在转化子中可以稳定表达。质粒载体 pDSK-GF-
Puv是WANG等［31］构建的一个具有广谱宿主的、遗传稳定的、高水平表达 GFPuv的质粒，他们成功将质粒
pDSK-GFPuv转入多个常见的植物病原菌(A． tumefaciens，P． syringae pv． tabaci，P． syringae pv． tomato，P．
syringae pv． glycinea，P． syringae pv． syringae，Xanthomonas axonopodis pv． vesicatoria and X． campestris pv．
图 2 标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A与野生型菌株Ⅱ8L4 的
生长曲线比较
Fig． 2 Comparison of growth curve between the marked strain
Ⅱ8L4-GFPuv-A and the wild strainⅡ8L4
Campestris)中。黄其玲等［32］采用电击转化方法，也
成功将 pDSK-GFPuv 转入丁香假单胞杆菌(Pseudo-
monas syringae pv)中，而且 GFPuv 基因在标记菌中
的稳定性很高，转接至第 10 天时荧光稳定性还保持
在 100%。因此，标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv 为进一步阐
明内生菌在土壤中或植株体内的定殖、扩散和生存
竞争能力，揭示其促进植物生长、吸收和积累重金属
的作用机理奠定了良好的基础。
2. 2 标记菌株与野生型菌株的生长曲线
在相同培养条件下，标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A 与
野生型菌株Ⅱ8L4 的生长曲线的变化趋势基本相同，
培养 3 h 后，两者均进入指数生长期;培养约 21 h
后，进入稳定期(图 2)。根据生长曲线计算得出:野
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第 3 期 郭荣荣等:促生内生菌假单胞菌Ⅱ8L4 的 GFPuv标记及其侵染东南景天的特征
表 1 标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A和野生菌株Ⅱ8L4 的促植物生长特性及锌、镉抗性水平
Table 1 Comparison of plant growth promoting character and Zn，Cd resistant level between marked strain
Ⅱ8L4-GFPuv-A and wild strainⅡ8L4
参数 标记菌株Ⅱ8 L4 -GFPuv-A 野生型菌株Ⅱ8 L4
溶磷圈直径 / cm 14. 1 ± 0. 20 13. 8 ± 0. 14
铁晕圈直径 / cm 12. 1 ± 0. 11 12. 5 ± 0. 23
分泌吲哚乙酸 /(g·L －1) 8. 16 ± 0. 33 7. 00 ± 0. 48
Cd最小致死浓度浓度 /(mmol·L －1) 1 2
Zn最小致死浓度浓度 /(mmol·L －1) 2 8
图 3 标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A从茎组织侵染
东南景天的途径
Fig． 3 Infection pathway of marked strain of Ⅱ8L4-
GFPuv-A from stem tissue of S． alfredii
生型Ⅱ8L4的生长代时为 3. 33 h，标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A 的代时为 3. 67 h，后者的代时比前者延长了
9. 3%。这表明标记菌株出现生长滞后现象，但总体上，质粒 pDSK-GFPuv 的存在与表达对宿主菌的生长
没有明显影响。由于外源基因插入而导致转化株生长滞后的现象在其他菌株中也有出现。例如，冯永君
等［33］比较水稻内生优势成团泛菌(Pantoea agglomerans)YS19 及其 GFP 标记的 YS19B:gfp 菌株的生长曲
线，标记菌株的代时比野生型菌株延长了 14%;黄其玲等［32］报道标记菌株 PSAmx7-GFPuv1 的代时比野生
型菌株 PSAmx7 延长了 17%，但总体上 GFPuv 的存在与表达对宿主菌的生长没有明显影响。
2. 3 标记菌株与野生型菌株的促植物生长特征和金属抗性水平
菌株Ⅱ8L4 为从超累积生态型东南景天叶片分离和纯化的内生菌，具有分泌植物生长激素、分泌高铁
载体和溶磷作用等促植物生长特征，同时对 Zn、Cd有较高的抗性水平，土壤接种菌株Ⅱ8L4 能促进东南景
天对土壤锌的吸收和积累［13-14］。与野生型菌株Ⅱ8L4 比较，标记菌Ⅱ8L4-GFPuv-A对 Zn、Cd的耐性能力显
著降低，其对 Cd、Zn的忍耐水平分别降低了 50%和 75%(表 1)。目前，我们未见 gfp 标记细菌后，其重金
属抗性水平降低的报道。但一些研究指出，细菌的
重金属抗性往往与其质粒相关［34-35］。因此，我们推
测在菌株Ⅱ8L4 被质粒 pDSK-GFPuv 标记以后，其细
胞内原有的质粒可能丢失或破坏，所以其抗 Zn、Cd
的能力降低。有趣的是，标记菌Ⅱ8L4-GFPuv-AⅡ8L4
的溶磷作用、分泌 IAA 和高铁载体能力与野生型菌
株的差异不大(表 1)。任嘉红等［36］也报道，GFP 基
因导入对细菌的溶磷作用影响不大。这说明标记菌
株Ⅱ8L4-GFPuv仍具有促植物生长特征，这为今后内
生菌强化植物修复重金属污染土壤的理论和实践过
程中，探讨内生细菌促进植物生长和吸收积累重金
属的机理、以及侵染和定殖东南景天的特征提供了
很好的研究材料。
2. 4 标记菌株侵染东南景天的途径
东南景天主要依靠茎扦插苗进行无性繁殖，其
茎上的芽点可以长出新叶或者根系，因此，研究内生
菌在东南景天的茎和根系中的浸染和定殖模式在具
有重要的理论和现实意义。接种培养 1 d后，东南景
天扦插苗的茎表面(图 3(a))、伤口(图 3(b))和芽
点(图 3(c))有大量绿色发光菌体;培养 2 d 后，可在
茎横断面的维管束中可观察到少量的Ⅱ8L4-GFPuv-A
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环 境 工 程 学 报 第 11 卷
的定殖;培养 3 d 后，即可见其在维管束中有较大量定殖(图 3(d))。这说明标记菌Ⅱ8L4-GFPuv-A不仅可
以在茎表形成菌膜，而且在伤口处大量聚集，从伤口处直接侵入到东南景天茎组织，并大量定殖。此外，标
记菌Ⅱ8L4-GFPuv-A大量聚集在东南景天茎上的芽点，并通过芽点侵入和迁移到东南景天的茎维管束组
织中，这与其他的报道结果十分吻合［37-39］。BALDOTTO等［40］报道内生菌可以直接定殖于微管组织、表皮
细胞和薄壁细胞中。在观察标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A 在东南景天茎组织中的迁移过程中，我们发现内生
菌在茎的新鲜伤口(横切面)处沿维管束向上迁移的速率较快，在茎的较上部位依然可以发现大量荧光，
这说明内生菌可以通过扦插苗的茎伤口快速迁移东南景天的其他组织中。
图 4 标记菌株Ⅱ8L4-GFPuv-A从根系侵染东南景天的途径
Fig． 4 Infection pathway of marked strain of Ⅱ8L4-GFPuv-A from the stem tissue of S． alfredii
研究表明，大部分内生菌来源于土壤，土壤细菌可以从根部侵入植物，到达根部皮层后，利用某些酶类
或物理作用通过皮层间隙纵深进入，在内皮层壁未加厚的位置侵入中柱，随后进入导管，借着蒸腾作用向
植物其他部位扩展［40-41］。为了探明内生菌是否也可以通过根系进入东南景天体内，我们将东南景天诱导
出根系后，再接种标记菌株。结果发现，接种培养的第 1 天，东南景天的根表面黏附有少量的标记菌
Ⅱ8L4-GFPuv-A(图 4(a)) ;第 2 天时，标记菌株在超累积东南景天根表面聚集增多(图 4(b)) ，并有少量从
根毛侵入根系;第 3 天，标记菌株大量迁移至超累积东南景天根的维管束内(图 4(c))。这说明标记菌
Ⅱ8L4-GFPuv-A既可以从根表直接侵入根系，也可以由根毛侵入根内，并能定殖于根的维管束内。
3 结论
本研究应用热激法成功地将 GFPuv 基因转入东南景天的内生菌假单胞菌Ⅱ8L4 的细胞中，且遗传稳
定，导入的 GFPuv基因对宿主菌的生长没有影响。与野生型菌株比较，GFPuv 基因标记菌株的分泌 IAA、
分泌高铁载体、溶解无机磷的能力没有显著差异，但标记菌株对锌、镉的抗性水平均有所降低。标记菌株
Ⅱ8L4-GFPuv-A不仅可从东南景天的茎扦插苗的伤口处和芽点侵入，并大量迁移至维管束木质部的细胞
间隙;还可以从根表直接侵入根系或由根毛侵入根内，并能定殖于根系的维管束内。标记菌株Ⅱ8L4-GF-
Puv-A可用于实时地监测内生菌在东南景天的根际和组织中的侵染和定殖变化动态等一系列后续研究。
参 考 文 献
［1］杨肖娥，龙新宪，倪吾钟，等． 东南景天(Sedum alfredii H):一种新的锌超积累植物［J］． 科学通报，2002，47(13):
1003-1006
［2］YANG X X，LONG X X，YE H B，et al． Cadmium tolerance and hyperaccumulation in a new Zn-hyperaccumulating plant spe-
cies (Sedum alfredii Hance) ［J］． Plant and Soil，2004，259(1 /2) :181-189
［3］胡杨勇，马嘉伟，叶正钱，等． 东南景天 Sedum alfredii修复重金属污染土壤的研究进展［J］． 浙江农林大学学报，2014，
31(1):136-144
2391
第 3 期 郭荣荣等:促生内生菌假单胞菌Ⅱ8L4 的 GFPuv标记及其侵染东南景天的特征
［4］周建利，邵乐，朱凰榕，等． 间套种及化学强化修复重金属污染酸性土壤:长期田间试验［J］． 土壤学报，2014，51(5):
1056-1065
［5］BAＲZANTI Ｒ，OZINO F，BAZZICALUPO M，et al． Isolation and characterization of endophytic bacteria from the nickel hyper-
accumulator plant Alyssum bertolonii［J］． Microbial Ecology，2007，53(2) :306-316
［6］MASTＲETTA C，TAGHAVI S，VAN DEＲ LELIE D，et al． Endophytic bacteria from seeds of Nicotiana tabacum can reduce
cadmium phytotoxicity［J］． International Journal of Phytoremediation，2009，11(3) :251-267
［7］LUO Shenglian，CHEN Liang，CHEN Jueliang，et al． Analysis and characterization of cultivable heavy metal-resistant bacterial
endophytes isolated from Cd-hyperaccumulator Solanum nigrum L． and their potential use for phytoremediation［J］． Chemo-
sphere，2011，85(7) :1130-1138
［8］ZHU Lingjia，GUAN Dongxing，LUO Jun，et al． Characterization of arsenic-resistant endophytic bacteria from hyperaccumulators
Pteris vittata and Pteris multifida［J］． Chemosphere，2014，113:9-16
［9］ＲAJKUMAＲ M，AE N，FＲEITAS H． Endophytic bacteria and their potential to enhance heavy metal phytoextraction［J］．
Chemosphere，2009，77(2) :153-160
［10］WEYENS N，VAN DEＲ LELIE D，TAGHAVI S，et al． Phytoremediation:Plant-endophyte partnerships take the challenge
［J］． Current Opinion in Biotechnology，2009，20(2) :248-254
［11］MA Y，PＲASAD M N V，ＲAJKUMAＲ M，et al． Plant growth promoting rhizobacteria and endophytes accelerate phytoremedi-
ation of metalliferous soils［J］． Biotechnology Advances，2011，29(2) :248-258
［12］马莹，骆永明，滕应，等． 内生细菌强化重金属污染土壤植物修复研究进展［J］． 土壤学报，2013，50(1):195-202
［13］LONG Xinxian，CHEN Xuemei，CHEN Yagang，et al． Isolation and characterization endophytic bacteria from hyperaccumulator
Sedum alfredii Hance and their potential to promote phytoextraction of zinc polluted soil［J］． World Journal of Microbiology
and Biotechnology，2011，27(5) :1197-1207
［14］LONG Xinxian，CHEN Xuemei，WONG J W C，et al． The feasibility of enhanced phytoextraction of Zn contaminated soil with
Zn mobilizing and plant growth promoting endophytic bacteria［J］． Transactions of Nonferrous Metals Society of China，2013，
23(8) :2389-2396
［15］张新成． 东南景天内生菌分离鉴定及其强化重金属超积累效应与机制［D］．杭州:浙江大学，2012
［16］潘风山，陈宝，马晓晓，等．一株镉超积累植物东南景天特异内生细菌的筛选及鉴定［J］．环境科学学报，2014，34(2):
449-456
［17］李世贵，吕天晓，顾金刚，等． 绿色荧光蛋白在微生物根际定殖研究中的应用［J］． 生物技术通报，2009(2):34-37
［18］VILLACIEＲOS M，POWEＲ B，SNCHEZ-CONTＲEＲAS M，et al． Colonization behaviour of Pseudomonas fluorescens and Si-
norhizobium meliloti in the alfalfa (Medicago sativa)rhizosphere［J］． Plant and Soil，2003，251(1) :47-54
［19］GILBEＲTSON A W，FITCH M W，BUＲKEN J G，et al． Transport and survival of GFP-tagged root-colonizing microbes:Impli-
cations for rhizodegradation［J］． European Journal of Soil Biology，2007，43(4) :224-232
［20］张素琴，赵姬勇，马国华，等． 污染环境中细菌质粒的研究［J］． 生态学报，1990，10(4):338-342
［21］MALIK A，JAISWAL Ｒ． Metal resistance in Pseudomonas strains isolated from soil treated with industrial wastewater［J］．
World Journal of Microbiology and Biotechnology，2000，16(2) :177-182
［22］顾奇萍，李钧敏，金则新，等． 铅锌尾矿重金属耐受细菌分析和质粒检出率［J］． 环境科学与技术，2009，32(4):
107-111
［23］唐飞． 内生菌-东南景天联合修复重金属污染土壤及其土壤微生物效应［D］． 广州:华南农业大学，2013
［24］杨秀荣，田涛，孙淑琴，等． GFP标记生防细菌 B579 及其定殖能力检测［J］． 植物病理学报，2013，43(1):82-87
［25］TOMBOLINI Ｒ，UNGE A，DAVEY M E，et al． Flow cytometric and microscopic analysis of GFP-tagged Pseudomonas fluores-
cens bacteria［J］． FEMS Microbiology Ecology，1997，22(1) :17-28
［26］马文文，姚拓，蒲小鹏，等． 东祁连山 7 种禾草根际溶磷菌筛选及其溶磷特性［J］． 草业科学，2015，32(4):515-523
［27］LIBBEＲT E，KAISEＲ W，KUNEＲT Ｒ． Interactions between plants and epiphytic bacteria regarding their auxin metabolism．
VI． The influence of the epiphytic bacteria on the content of extractable auxin in the plant［J］． Physiologia Plantarum，2006，
3391
环 境 工 程 学 报 第 11 卷
22:432-439
［28］SCHWYN B，NEILANDS J B． Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores［J］． Analytical
Biochemistry，1987，160(1):47-56
［29］赵峰，张颖，李慧，等． 3 种假单胞菌 CaCl2 法感受态细胞制备及转化条件［J］． 应用生态学报，2013，24(3):788-794
［30］STUUＲMAN N，BＲAS C P，SCHLAMAN H Ｒ M，et al． Use of green fluorescent protein color variants expressed on stable
broad-host-range vectors to visualize rhizobia interacting with plants［J］． Molecular Plant-Microbe Interactions，2000，13(11) :
1163-1169
［31］WANG K，KANG Li，ANAND A，et al． Monitoring in planta bacterial infection at both cellular and whole-plant levels using
the green fluorescent protein variant GFPuv［J］． New Phytologist，2007，174(1) :212-223
［32］黄其玲，高小宁，赵志博，等． GFPuv标记猕猴桃溃疡病菌的生物学特性及其在土壤、根系中的定殖［J］． 中国农业科
学，2013，46(2):282-291
［33］冯永君，宋未． 水稻内生优势成团泛菌 GFP标记菌株的性质与标记丢失动力学［J］． 中国生物化学与分子生物学报，
2002，18(1):85-91
［34］窦敏娜． 两株抗镉细菌鉴定及抗性研究［J］． 甘肃科学学报，2014，26(4):40-43
［35］范丽平，王亚峰，霍贵成． 乳酸乳球菌镉抗性质粒的鉴定及镉抗性功能片段的获取［J］． 中国食品学报，2010，10
(3):205-212
［36］任嘉红，刘辉，姜楠，等． GFP标记溶磷草木樨中华根瘤菌 CHW10B及其定殖［J］． 林业科学，2015，51(1):74-79
［37］LAMB T G，TONKYN D W，KLUEPFEL D A． Movement of Pseudomonas aureofaciens from the rhizosphere to aerial plant tis-
sue［J］． Canadian Journal of Microbiology，1996，42(11) :1112-1120
［38］魏春燕，邢永秀，莫遥，等． 绿色荧光蛋白基因标记的固氮菌 DX120E 在甘蔗植株内的定殖［J］． 作物学报，2014，40
(6):1132-1139
［39］MOCALI S，BEＲTELLI E，DICELLO F，et al． Fluctuation of bacteria isolated from elm tissues during different seasons and
from different plant organs［J］． Ｒesearch in Microbiology，2003，154(2) :105-114
［40］BALDOTTO L E B，OLIVAＲES F L，BＲESSAN-SMITH Ｒ． Structural interaction between GFP-labeled diazotrophic endophyt-
ic bacterium Herbaspirillum seropedicae ＲAM10 and pineapple plantlets‘Vitória’［J］． Brazilian Journal of Microbiology，
2011，42(1) :114-125
［41］安千里，杨学健，董越梅，等． 用共聚焦激光扫描显微镜观测 GFP标记的内生固氮菌 Klebsiella oxytoca SA2 侵染水稻根
［J］． 植物学报，2001，43(6):558-564
4391