全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 17(2):55～ 59 , 2005
火绒草水提取液对牛乳中多形核白细胞体外杀菌功能的影响
黄利权1 ,伍义行2
(1 浙江大学动物科学学院 ,浙江 杭州 310029 ;2浙江大学药学院 ,浙江 杭州 310031)
摘　要:采用平板计数法和 MTT法 , 检测火绒草水煎液 、水提醇沉液 、醇提水溶部分 3 种水溶性组分对牛乳中
多形核白细胞(PMN)体外吞噬金黄色葡萄球菌 Newbould S-305 功能的影响 , 每种提取试验药物分 4 种浓度
(10.0 , 5.0 , 2.5 , 1.0 mg/ml),通过比较火绒草药物孔与对照孔 PMN 杀菌百分率 ,确定试验药物对奶牛乳腺免
疫功能的调节作用。结果表明:平板计数法测定中 ,除醇提水溶部分(1 mg/ml)外, 3种提取物杀菌百分率与对
照组比较 ,呈显著(P <0.05)或极显著差异(P <0.01)。MTT法中 ,除水提醇沉液(1 mg/ml)外 , 3 种提取物均能
显著(P <0.05)或极显著(P <0.01)地提高牛乳中 PMN的体外吞噬活性。两种方法检测的结果 ,随药物浓度
升高 ,牛乳多形核白细胞(PMN)体外杀菌功能有增强趋势。且两种方法测定结果基本一致 , t检验差异不显著
(P >0.05)。表明火绒草 3种提取组分对奶牛乳腺多形核白细胞的体外吞噬活性具有良好的调节作用。
关键词:火绒草;水提物;奶牛多形核白细胞;平板计数法;MTT法;体外杀菌活性
中图分类号:S858.23　　　　　　　　文献标识码:A 文章编号:1004-1524(2005)02-0055-05
Effect of water extract of Leontopodium leontopodioides on the bactericidal activity of
bovine polymorphonuclear leukocytes in vitro
HUANG Li-quan1 ,WU Yi-hang2
(1College of Animal Science , Zhejiang University , Hangzhou 310029 , China;2College of Pharmaceutical Science , Zhe-
jiang University , Hangzhou 310031 , China)
Abstract:The Effects of three water-soluble fractions(solution of water-extraction , alcohol precipitation , and the water-sol-
uble fraction of the alcohol extraction)of Leontopodium leontopodioides on the bactericidal activity of bovine polymorphonu-
clear leukocytes from milk in vitro were determined by colony-counting method and MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)as-
say.There were 4 concentrations(1.0 , 2.5 , 5.0 , and 10.0 mg/ml)in each fraction.The results determined by the two
methods showed that the three water-soluble fractions significantly increased the bactericidal activity of bovine polymor-
phonuclear leukocytes from milk in vitro and the increase improved with increasing the drug concentrations.The results de-
termined by the two methods were consistent , which suggesting that the three water-soluble fractions had a good adjusting ef-
fect on the bactericidal activity of bovine polymorphonuclear leukocytes from milk in vitro.
Key words:Leontopodium leontopodioides;water extract;bovine polymorphonuclear leukocytes;colony-counting method;
MTT assay;bactericidal activity in vitro
　　火绒草系菊科火绒草属植物火绒草
(Leontopodium leontopodioides)[ 1] , 分布在我国
北部和西部 ,特别是青藏高原 ,其野生资源极为
收稿日期:2004-02-15
作者简介:黄利权(1957-),男 , 浙江慈溪人 , 副教授 , 从事动物
繁殖和疾病研究。
丰富[ 2 ～ 4] 。民间用药经验和药理研究显示:火绒
草具有疏风解表 、清热解毒 、凉血止血 、益肾利
水 、消炎利尿之功效[ 5] ;其水提物具有降血糖和
利尿作用 ,70%和95%的乙醇提取物具有抗炎作
用[ 6～ 9] 。临床试验发现 ,其复方和乙醇制剂对急
性 、慢性肾炎有较好疗效[ 10 ,11] 。至今已有学者
从火绒草中分离出咖啡酸(caffeic acid)、香草酸
(vanillic acid)、原儿茶醛(protocatechuic)、反式桂
皮酸(thans-cinnamicacid)、阿魏酸(ferulic acid)、β-
谷甾醇(β-sitosterol)和苯乙双胍(phenformin)等 7
个结晶单体[ 12 ～ 15] 。为了进一步探讨火绒草的药
用价值 ,作者对火绒草水煎液 、水提醇沉液 、醇提
水溶(液)部分的免疫活性作用进行初步研究 ,现
将结果报道如下 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验药液
火绒草水煎液 、水提醇沉液 、醇提水溶(液)
部分。火绒草全株采自甘南草原 ,经农业部新兽
药工程重点开放实验室天然药物研究室鉴定后 ,
实验室提取。
1.1.2　试验菌株
金黄色葡萄球菌 Newbould S-305 标准株由
瑞典国家兽医研究所奶牛乳房炎研究室提供 。
培养后稀释成含菌量为 2×108 cfu/ml 的菌液备
用。以下简称菌液。
1.1.3　多形核白细胞(PMN)
分离自 10头健康奶牛的乳汁(杭州近江奶
牛场)。通过台盼兰染色及细胞计数 ,细胞悬液
中吞噬细胞(PMN)90%以上 ,活细胞比例在 95%
以上。然后用 RPMI-1640 培养液调整细胞浓度
为1.0×107 cfu/ml(细胞悬液Ⅰ)和2.0×107 cfu/
ml(细胞悬液 Ⅱ),4℃保存备用[ 16 , 17] 。
1.1.4　正常奶牛血清
分离自 10头健康奶牛血液(杭州近江奶牛
场)。
1.2　测定方法
采用甲月赞沉淀法测定 PMN杀菌百分率[ 18] 。
经被试药物处理奶牛 PMN后 ,以平板计数法[ 19]
和MTT 法[ 20]检测其对 PMN杀菌功能的影响。
1.2.1　细菌含量与OD值相关曲线的建立
根据各稀释度的细菌数与其相应的 OD值 ,
通过线性回归分析 ,求得回归方程和相关系数 ,
从而建立细菌数与其 OD值的相关曲线。
1.2.2　试验药物对试验菌活性的测定
根据实验室抗菌试验结果 ,3种试验药物的
最低杀菌浓度(MBC)分别为:水煎液 15.63 mg/
ml(生药浓度 ,下同);水提醇沉液 125.00 mg/ml;
醇提水溶部分 21.62 mg/ml。在进行 PMN 体外
吞噬活性试验时 ,为了消除药物本身对细菌的杀
灭影响 ,对药液进行适度稀释。先将 3种提取试
验药物过滤并灭菌后 ,用灭菌 PBS 分别稀释成
20 ,10 ,5 ,2 mg/ml浓度备用 。
在培养板各孔中分别加入 50 μl菌液 ,然后
在含菌液的孔中加入上述稀释药液 50 μl ,对照
孔用 PBS 代替药液 ,每一稀释度药液做 5 个重
复 。37℃培养 2 h。随后进行平板菌落计数 ,并
比较加药孔和对照孔菌液培养前后细菌数的变
化 ,检验其差异的显著性[ 21 ,22] 。
1.2.3　用平板计数法测定试验药物对 PMN 体
外杀菌功能
⑴PMN体外杀菌功能测定
在培养板上 ,设 5个重复 ,各孔加入 50 μl菌
液和 50 μl细胞悬液 Ⅰ ,使细胞数与细菌数之比
为 1∶10;另设对照组 ,不加细胞悬液 ,改加 50 μl
RPMI-1640培养液。37℃培养 1 h。分别于培养
前后各取 2 个重复的培养液 100 μl用灭菌 PBS
递比稀释 ,至最后溶液估算细菌浓度分别为 1×
104 ,1×103 , 1×102 cfu/ml ,再分别取这 3个浓度
细菌悬液各 20μl ,接种于琼脂平板 ,每种浓度做
2个重复。待菌液被琼脂完全吸收后 ,37℃培养
18 h ,进行菌落计数 。比较培养前后细菌数的变
化 ,从而计算出 PMN的杀菌百分率。
⑵试验药物对 PMN体外杀菌功能测定
分别在培养板上按如下顺序加样:
试验孔:各孔加入 25 μl菌液 、25 μl细胞悬
液 Ⅱ和 50μl试验药液;
阳性对照孔:各孔加入 25 μl细胞悬液 Ⅱ和
75μl RPMI-1640培养液(代替菌液和药液);
阴性对照孔:各孔加入 25 μl 菌液和 75 μl
RPMI-1640培养液(代替细胞悬液和药液);
空白对照孔:各孔加入 25 μl菌液 、25 μl细
胞悬液 Ⅱ和 50 μl RPMI-1640 培养液(代替药
液);
每一药物每种稀释度做 5个重复 ,37℃培养
1 h。分别于培养前后各取 2 个重复的培养液
100μl按前面叙述方法进行菌落计数 ,比较培养
前后细菌数的变化 ,计算出 PMN 在试验药物作
·56· 浙江农业学报　第 17卷(2005)
用下的杀菌百分率 , 并检验试验孔和对照孔
PMN杀菌百分率差异显著性。从而测定药物对
PMN体外杀菌功能的影响。
1.2.4　用MTT 法测定试验药物对 PMN 体外杀
菌功能
(1)PMN体外杀菌功能测定
在培养板上 ,按如下顺序加样 ,每个测定设
2个重复 。
试验孔:加入 50 μl细胞悬液 Ⅰ和 50 μl菌
液 ,使细胞数与细菌数之比为 1∶10 ,于 37℃培养
1 h。培养后 ,每孔加入 50μl皂素(2 mg/ml),作
用5 min ,破坏 PMN。再在每孔加入 50μl MTT溶
液(2 mg/ml), 37℃作用 1 h。3000 r/min离心 10
min ,去上清液 ,以滤纸吸尽残留液体 。每孔中加
入150 μl二甲亚砜(DMSO), 37℃作用 30 min 。
然后用酶联免疫仪在 578 nm处测OD值。
对照孔:各孔加入 50 μl RPMI-1640培养液 ,
替代试验孔的细胞悬液 ,其余步骤同试验孔。
根据不同菌液稀释度的 OD 值与相应的杀
菌百分率间的关系 ,用直线回归分析法建立杀菌
标准曲线 ,从而计算 PMN杀菌功能。
(2)试验药物对 PMN体外杀菌功能测定
试验孔组各孔:加入 25μl细胞悬液 Ⅱ、25μl
菌液和50 μl不同浓度的试验药物 。于 37℃培
养1 h后 ,以同样方法测定试验药物对PMN体外
杀菌功能的影响 。
阴性对照孔:各孔加入 50 μl RPMI-1640培
养液(代替细胞悬液和菌液)和 50 μl RPMI-1640
培养液(代替药液)。
空白对照孔:各孔加入25 μl细胞悬液Ⅱ 、25
μl菌液和50 μl RPMI-1640培养液(代替药液)。
于37℃培养 1 h后 ,以同样方法测定试验药
物对 PMN体外杀菌功能的影响 。
2　结果与分析
2.1　不同稀释浓度下的细菌数与 OD值的相关
性
对细菌悬液的含菌量及其 OD 值进行线性
回归分析 ,建立标准曲线(图 1)。从图 1可见细
菌数与其OD值呈良好的线性关系(相关系数为
r=0.9968),其线性回归方程为 y =3.6956x +
0.0325。本试验通过甲月赞沉淀法测定 PMN 杀菌
百分率 ,亦发现 PMN 杀菌百分率与二甲亚砜溶
解甲月赞沉淀后测得的 OD值呈良好的线性关系 ,
说明甲月赞形成的量在一定范围内与 PMN 杀菌后
幸存的活菌数呈线性关系 ,与母安雄的研究结果
一致[ 18] 。
图 1　细菌数与 OD值相关曲线
Fig.1　Relation curve between bacterial counts and the OD
values
2.2　火绒草3种提取方法的药物对试验菌活性
的影响
火绒草 3种提取方法的不同浓度药物与试
验菌一起培养2 h后 ,比较培养前后细菌数的变
化 ,并对加药孔和对照孔培养后的细菌数进行统
计分析(表 1)。结果显示 ,尽管培养后加药孔细
菌数有一定程度的减少 ,但与对照孔比较 ,其差
异均不显著(P >0.05)。说明这 3种提取法的
试验药物在试验浓度范围内对试验菌活性影响
无显著差异 。
表 1　3 种提取剂对金黄色葡萄球菌活性的影响(n1=n2
=5)
Table 1　Effects of three extracting reagents on the survival of
Staphlococcus aureus 305 strain
药物浓度/
mg·ml-1
细菌浓度/ 1.0×108cfu·ml-1
水煎液 水提醇沉液 醇提水溶部分
　0(CK) 0.95±0.051 0.95±0.051 0.95±0.051
1.0 0.94±0.113 0.92±0.037 0.88±0.097
2.5 0.89±0.091 0.87±0.085 0.93±0.102
5.0 0.92±0.089 0.90±0.071 0.87±0.099
10.0 0.79±0.159 0.81±0.148 0.84±0.135
注:各药物试验组与空白组(CK)比较差异均不显著(P >
0.05)。
·57·黄利权等:火绒草水提取液对牛乳中多形核白细胞体外杀菌功能的影响
2.3　试验药物对 PMN体外杀菌功能的影响
平板计数法和MTT 法检测PMN杀菌百分率
差异的统计分析结果见表 2。结果表明 ,平板计
数法测定的PMN杀菌百分率与MTT 法测定结果
比较 ,差异均不显著(P >0.05)。
从表 2亦可知 ,在平板计数法检测 PMN的
体外杀菌百分率 , 醇提水溶部分(1 mg/ml)对
PMN杀菌百分率无显著影响(P >0.05);水煎
液(1.0 ,2.5 mg/ml)、水提醇沉液(5.0 mg/ml)和
醇提水溶部分(2.5 , 5.0 , 10.0 mg/ml)能显著提
高PMN 的杀菌百分率(P <0.05);而水煎液
(5.0 ,10.0 mg/ml)和水提醇沉液(1.0 , 2.5 ,10.0
mg/ml)能非常显著地提高 PMN 的杀菌百分率
(P <0.01)。表明试验药物除 1.0 mg/ml的醇
提水溶部分外(其水煎液 、水提醇沉液 、醇提水
溶部分)其它不同浓度对牛乳中 PMN 体外杀菌
功能具有显著(P <0.05)或极显著(P <0.01)
差异 。
表 2　平板计数法与 MTT法测定 PMN杀菌功能的差异
Table 2　Comparison of bactericidal activity of PMN(polymor-
phonuclear leukocytes) from milk by the colony counting
method with MTT assay method
试验药物 浓度/
mg·ml-1
PMN 杀菌百分率/ %
平板法 MTT 法
阳性对照 0 100
阴性对照 0 0 0
空白对照 0 41.8±3.24 40.5±4.25
水煎液 1.0 51.2±7.17＊ 47.9±4.10＊
2.5 49.6±4.14＊ 48.1±2.85＊
5.0 52.3±6.19＊＊ 51.4±3.71＊＊
10.0 52.9±5.71＊＊ 52.7±5.12＊＊
水提醇沉液 1.0 48.2±2.75＊ 46.5±4.32
2.5 48.7±3.10＊ 47.1±3.41＊
5.0 50.3±4.93＊ 48.4±3.74＊
10.0 51.5±5.21＊＊ 51.3±5.81＊＊
醇提水溶部分 1.0 45.9±3.12 52.0±6.73＊＊
2.5 47.3±3.20＊ 50.9±5.40＊＊
5.0 49.7±4.55＊ 51.3±4.35＊＊
10.0 50.8±5.38＊ 53.4±5.86＊＊
注:试验药物孔与药物空白对照比较 , ＊表示差异显著(P <
0.05), ＊＊表示差异极显著(P <0.01)。
而MTT法检测 PMN的体外杀菌百分率结果
中 ,水提醇沉液(1.0 mg/ml)对 PMN杀菌百分率
无显著影响(P >0.05);水煎液(1.0 , 2.5 mg/
ml)、水提醇沉液(2.5 ,5.0 mg/ml)和醇提水溶部
分(1.0 mg/ml)能显著提高 PMN的杀菌百分率
(P <0.05);而水煎液(5.0 , 10.0 mg/ml)、水提
醇沉液(10.0 mg/ml)和醇提水溶部分(2.5 , 5.0 ,
10.0 mg/ml)能极显著地提高PMN的杀菌百分率
(P <0.01)。表明在MTT 法中 ,除1 mg/ml的水
提醇沉液外 ,其它不同浓度药液均能显著(P <
0.05)或极显著(P <0.01)地提高乳中 PMN的
体外杀菌功能。
2.4　不同试验药物浓度对 PMN 杀菌功能的影
响
从图 2可见 ,在平板计数法测定中 ,除水煎
液外 ,其余随着药物浓度升高 , PMN 杀菌作用增
强 。从图 3可见 ,在 MTT 法检测中 ,除醇提水溶
部分稍有偏离外 ,其余随试验药物浓度升高 ,
图 2　平板计数法检测不同浓度药物对 PMN杀菌功
能的影响
Fig.2　Effects of the different reagent concentrations on the
bactericidal activity of PMN detected by the colony counting
method
图 3　MTT法检测不同浓度药物对 PMN 杀菌功能的
影响
Fig.3　Effects of the different reagent concentrations on the
bactericidal activity of PMN detected by MTT assay
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PMN的杀菌百分率增大 。平板计数法和MTT法
对PMN体外杀菌功能虽然存在一定的差异 ,但
差异不显著(P >0.05),而且均证明试验药物
能显著提高PMN体外吞噬细菌的能力。随药物
浓度升高 ,两种试验方法检测的杀菌效果在总体
上都表现出增强的趋势。通过这两种方法的比
较 ,药物对 PMN体外杀菌效果测定的方法学选
择上 ,得到了有效的验证 ,为以后开展该方面的
实验分析提供了依据 。
本试验不同的试验方法得到相似的试验结
果 ,进一步说明了 3种试验药液(水煎液 、水提醇
沉液 、醇提水溶部分)对奶牛乳腺多形核白细胞
的体外吞噬具有良好的活性。
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(责任编辑　袁醉敏)
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