全 文 ：参 考 文 献
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收稿日期:2011-04-19
基金项目:四川省科技支撑计划(2010SZ0007)
作者简介:孙雁霞(1976-) ，女，在职博士，主要从事植物生物技术研究;Tel:18080020646，E-mail:sunyanxia1976@ cdu. edu. cn。
菘蓝高效遗传转化系统的建立
孙雁霞，王跃华，苟兴华，苟小军，邬晓勇
(成都大学药食同源植物资源开发重点实验室，四川 成都 610106)
摘要 目的:建立一套发根农杆菌高频转化菘蓝植物的有效方法。方法:采用 ATCC15834 和 RI1601 两种发根
农杆菌并通过超声波处理对草本植物菘蓝的下胚轴、子叶、带子叶下胚轴进行遗传转化，比较了共培养与否对毛状
根诱导的影响，并进行了不同抗生素浓度的抑菌效果筛选和毛状根增殖培养基的筛选。结果:浸染后的外植体在
不经过共培养阶段的情况下，诱导后的外植体成活率高，毛状根发根时间早，发根率高;经超声波处理后的外植体
其毛状根诱导率比未处理高一倍多;同时，筛选出抗生素浓度为 400 mg /L 时为毛状根生长的最佳抑菌浓度;毛状
根在液体培养基中的增殖速度是固体培养基的 2 ～ 3 倍，是普通根的 37 倍。结论:利用新的方法成功建立了菘蓝
的毛状根诱导体系。
关键词 发根农杆菌;菘蓝;毛状根
中图分类号:R282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)10-1486-04
Establish Efficiently Transformation System of the Isatis indigotica
SUN Yan-xia，WANG Yue-hua，GOU Xing-hua，GOU Xiao-jun，WU Xiao-yong
(The Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Exploitation of Chengdu University，Chengdu 610106，China )
Abstract Objective:To build up a method of efficiently transforming Isatis indigotica with the Agrobacterium. Methods:Two
kinds of Agrobocterium:ATCC 15834 and RI1601 were used to treat different fraction of Isatis indigotica． Explored the effect of cocul-
tured，different antibiotic concentration and the media on multiply the hairy roots. Results:The explants with out coculture had had
higher survival rate rooting rate and earlier sprout time. After ultrasonic treatment of plant，the indacement rate was two times than that
of untreated one;The best antibiotic con centration was 400 mg /L;The proportion of the grow speed of the hairy root in the liquid cul-
ture media was 2 ～ 3 times than that of solid culture media，and 37 times of common roots. Conclusion:The method is useful for estab-
lishing an efficiently transformatiem system of Isatis indigotica by Agrobacterium.
Key words Agrobacterium;Isatis indigotica Fort;Hairy root
菘蓝(Isatis indigotica Fort. )为十字花科植物，
是我国广泛种植的一种大宗中草药，其根和叶是常
用中药板蓝根和大青叶的主要来源。板蓝根因含有
青黛酮、靛蓝等多种有效成分〔1〕，是现代医学公认
的少数有较好抗病毒效果的中药之一。此外还具有
抗炎、抗内毒素、免疫调节等药理作用。发根农杆菌
可以浸染植物，并在浸染部位产生毛状根。其生长
迅速，易于培养，次级代谢物的生物合成量稳定甚至
比原植物更高，使得这项应用研究成为研究热点，显
示出极大的应用潜力〔2-5〕。
本试验旨在通过建立一套发根农杆菌高频转化
菘蓝植物的有效方法，旨在大规模的快速生产菘蓝
的有效次生代谢物质，缓解板蓝根药材的紧缺和有
效的保护菘蓝的野生资源，也为其他植株转基因提
供新的方法和试验依据。
1 材料和方法
1. 1 菌种及其活化 本实验采用的是 RI1601，
ATCC15834 两种发根农杆菌(来源于中科院成都生
物所) ，将发根农杆菌划线接种于 YEB 固体培养基
上，27 ℃活化 2 次。之后在培养基上挑取单菌落于
YEB液体培养基中，27 ℃100 r /min 无光条件下培
养 24 h，至 OD =0. 4 ～ 0. 5 时，即可用于浸染。
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.10.005
1. 2 无菌苗的获得 选取饱满的种子，用无菌水
浸泡 6 h，0. 02%的消洗灵浸泡 8 ～ 10 min，无菌水洗
涤 4 次，用 1‰的升汞洗涤 2 次，无菌水洗涤 4 次，放
于无菌超净滤纸上，待表面多余水分被滤纸吸干，放
入 MS培养基中，27 ℃下暗培养，1 d 后于光照下培
养，光照度为 1800 Lx，每天 16 h，8 d即得到无菌苗。
1. 3 转化阶段 选择健壮的无菌材料，用手术刀
将其切割成子叶、下胚轴、带子叶下胚轴 3 部分，子
叶在主脉上切伤处理。接种于固体 MS 无激素培养
基上，暗培养 1 d。将预培养 1 d 的外植体分成 2
份，分别于菌液浓度为 0. 5 左右中振荡浸泡 15 min
和超声波仪中超声 2 min，用无菌滤纸吸干植物体表
面多余的菌液。放入含有不同抗生素浓度的培养基
中，27 ℃暗培养 1 d，见光培养，光照为 12h /d。同时
作对照，除不与发根农杆菌接触外，其余操作均相
同。浸染后，如果培养基上出现明显可见的农杆菌
的菌斑，立即用无菌水洗涤 3 次，脱菌水(含 300
mg /L头孢噻肟钠)浸泡 10 min，用无菌滤纸吸干植
物体表面的多余水分，放入新鲜的抗生素培养基。
继代 4 ～ 5 次。
1. 4 毛状根增殖 将无菌的毛状根切成 3 cm 大
小的段，分别放入 1 /2MS〔6〕液体和固体培养基中，
于 27 ℃，光照为 1800 Lx 下培养 25 d。每 250 mL
的三角瓶中装 100 mL 的培养液。25 d 后测干重和
湿重。
2 结果与分析
2. 1 无菌苗的培养条件 15 d 的统计结果见表
1。可以看出菘蓝种子在有光照并且是浸泡过的情
况下萌发率较高，说明浸泡种子也是种子萌发一个
重要因素。本试验采取了光照和浸泡 2 种条件下培
养种子。由表 2 可以看出编号为 A3 的培养基发芽
率更高，但编号为 A1 的培养基培养出的无菌苗更
为粗壮，故选用培养基编号为 A1 的种子作为我们
的无菌苗材料。
表 1 菘蓝种子培养条件的选择
条件 总数 萌发数 萌发率 /%
光照 96 42 43. 75
无光照 133 76 57. 14
浸泡过的种子 299 180 60. 20
未浸泡过的种子 253 139 54. 94
2. 2 发根农杆菌的转化情况 25 d的实验结果见
表 3。两种发根农杆菌对于植物体的转化率有着很
大的差别。通过以上的比较，可以看出菘蓝对
ATCC15834 这种菌株较为敏感，转化率高，是因为
带有农杆碱型质粒的菌株(ATCC15834)比带有甘
表 2 菘蓝种子在不同培养基上的生长情况
编号 培养基 激素(6-BA) 接种数 萌发数
萌发率
/%
A1 MS 2 58 53 91. 3
A2 MS 0 39 36 92. 3
A3 1 /2MS 0 61 58 95. 08
表 3 不同发根农杆菌对菘蓝外植体(下胚轴，
子叶，带子叶的下胚轴)的转化情况
发根农杆菌 外植体 发根数 转化率 /%
ATCC15834 74 52 70. 27
RI1601 111 53 47. 74
露碱型和黄瓜碱型的质粒的菌株致病性高。
2. 3 共培养阶段对植物的影响 试验结果表明:
两种培养方式有明显的差异。主要表现在发根时
间、发根数、外植体的存活率以及诱导率。抗生素共
培养阶段的外植体其发根时间为转化后的 4 ～ 5 d，
随后的一周内均有外植体不断发根，外植体成活率
90%，发根率达到 48. 94%，而无抗生素共培养之后
的外植体只有很少数在浸染后的 4 ～ 5 d 里发根，随
后的抑菌期间外植体呈黄褐色，略显透明，抑菌培养
4 ～ 5 次后成活率只为 30%。见表 4。
表 4 共培养对菘蓝转化植株的影响
方式 外植体数 发根数 发根率 /%
无抗生素共培养 72 6 8. 33
抗生素共培养 94 46 48. 94
2. 4 不同外植体转化的情况 从表 5 可以看出，
子叶和带子叶的下胚轴 2 种外植体的转化率较高。
有些毛状根直接由伤口处长出，有些是植物体愈伤
化后再长出毛状根。与姚春娜等〔7〕用发根农杆菌
对黄瓜进行转化研究和赵东利等〔8〕用发根农杆菌
介导苦豆子遗传转化的结果相似。
表 5 发根农杆菌(ATCC15834)对菘
蓝外植体不同部位的转化率
外植体部位 浸染数 发根数 发根率 /%
子叶 28 24 85. 71
下胚轴 16 4 25. 00
带子叶的下胚轴 30 16 53. 33
2. 5 超声波介导外植体转化情况 由表 6 中可以
看出浸染中使用了超声波技术后与没有使用超声波
技术的转化率区别不大，超声波后的诱导率较普通
方式诱导率略高。该方法在苦豆子(超声时间为 5、
15、25、30 min)和黄瓜(15 min)等植物遗传转化中
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均显示了较佳的效果。而本试验看出 2 种诱导方式
的结果无很大差异，也许是超声时间短暂，也许是外
植体自身的原因。
表 6 诱导方式对菘蓝植物体转化率的影响
诱导方式 浸染外植体数 发根数
发根率
/%
常规诱导(于菌液中浸泡 15 min) 74 52 70. 27
超声波诱导 2 min 110 80 72. 72
2. 6 抗生素浓度对转化的影响 由表 7 可以看
出，随着抗生素浓度的提高，发根率也逐步提高。但
不同外植体在不同的抗生素浓度培养基中的发根率
不同。子叶为 200 mg /L最好，下胚轴是在 400 mg /
L时最好，而带子叶的下胚轴是在 500 mg /L 最好，
可以根据其特点选择不同浓度的抗生素培养基。
表 7 抗生素浓度在菘蓝植物体遗传转化中的影响
抗生素浓度 /
(mg /L) 浸染外植体数 发根数 发根率 /%
200 50 14 28. 00
300 57 30 52. 63
400 54 30 55. 55
500 46 28 60. 86
2. 7 毛状根的生长情况及其形态特征 毛状根的
整体生长情况为慢、快、慢的情况，大概 3 ～ 7d 左右
开始长根，起初没有明显的主根，毛状根长出 10 d
左右根上又开始分支，根的尖部无根毛，但其他部位
根毛密集，明显可见。刚长出时根向上生长，一段时
间后由于引力而向下弯曲。10 d 必须换培养基，否
则农杆菌开始生长，抑菌困难。3 周左右，毛状根开
始发黄。转入培养基中后培养 20 d 左右，长势最
好，毛状根密集，细长，通体透明，分支多，根尖处有
长约 2 mm 的乳白色部分，其余的部分成透明色。
由图 1 可以看出:在液体培养基中的毛状根比在固
体培养基中的毛状根生长质量好很多。经过记录，
毛状根在长出 3 d 后开始快速繁殖，在第 20 ～ 25 d
期间重量达到最大，之后如果没有营养液的供给便
会枯黄。最后称重的毛状根是原始植物的 33 倍。
具体转化及生长情况见图 2 ～图 5。
图 1 毛状根在液体和固体培养基中增殖的差异
1. 液体培养 2. 固体培养
图 2 菘蓝子叶外植体转化情况
图 3 菘蓝叶片和叶柄上长出的毛状根
图 4 菘蓝转基因植株固体培养基培养
图 5 菘蓝转基因植株液体培养基培养
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3 讨论
外植体在转化前进行预培养可以提高外植体的
转化率。本试验将预培养的天数定为 2 d，结果发现
生长的根毛较没有预培养和预培养 1 d 密集，根系
也较发达，诱导率也高。这是因为外植体产生伤口
后，在愈合过程中会形成并释放出 AS 等物质，以此
作为诱导发根农杆菌识别的信号分子。发根农杆菌
浸染前需经过一定时间预培养，使受体能形成并释
放这种信号分子，从而提高转化率。
本试验中经过无抗生素共培养后的外植体抑菌
的难度也加大，所以采用了抗生素共培养，即直接将
浸染后的外植体放入抗生素培养基中，发现直接转
入抗生素培养基的 8 d之内都不会有菌斑出现且发
根较早，而经过无抗生素共培养的植物体死亡率较
高，发根率也低。在白芥子的遗传转化过程中也出
现了类似的情况，但在其他植株的毛状根诱导没有
此种现象，也未见报道。
参 考 文 献
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468-472.
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