全 文 ：分子植物育种，2012年，第10卷，第6期，第740-746页
MolecularPlantBreeding,2012,Vol.10,No.6,740-746
研究报告
ResearchReport
转硅转运蛋白(OsLsi1和 OsLsi2)基因美女樱及抗寒性分析
胡翠平 赵然 张焕 张美恒 王秀刚 樊金萍 *
东北农业大学园艺学院,园林植物与观赏园艺重点实验室,哈尔滨,150030
*通讯作者,fan_xuer2000@yahoo.com.cn
摘 要 蔗将硅转运蛋白基因 OsLsi1和 OsLsi2转入美女樱中，研究该基因对美女樱抗寒性的影响。对经
PCR鉴定的阳性转基因美女樱植株进行RT-PCR检测，结果表明转运蛋白基因 OsLsi1和 OsLsi2在转基因
美女樱中能够正常转录并表达，说明这两个基因已经整合到美女樱中；在0℃低温下进行0、4d和7d低温
处理，测定丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)，结果发现,转基
因植株的抗寒性比非转基因的高，且转 OsLsi1基因植株比 OsLsi2基因抗寒能力强，为创建美女樱抗寒种质
资源奠定了基础。
关键词 美女樱,转基因植株,PCR检测,RT-PCR检测,生理指标测定
Transgenic Verbena Nybrida with Silicon Transporter Protein (OsLsi1,
OsLsi2)GeneandItsFreezingResistance
HuCuiping ZhaoRan ZhangHuan ZhangMeiheng WangXiugang FanJinping*
KeyLaboratoryofGardenPlant&OrnamentalHorticulture,HorticultureColleges,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,150030
*Correspondingauthor,fan_xuer2000@yahoo.com.cn
DOI:10.3969/mpb.010.000740
Abs tract The Silicon transporter proteinOsL i1 andOsLsi2 gene were transformed intoVerbena nybrida to
study the impacts onVerben nybrida. The PCR results showed that the Silicon transporter proteinOsLsi1 and
OsLsi2geneweresuccessfullytransferredintoVerbenanybridaandtheNormaltranscriptionandexpressionofthe
Silicon transporter proteinOsLsi1 andOsLsi2 gene transgenicVerbena nybrida were indentified by RT-PCR.
The MDA (malondialdehyde), proline content, and SOD, POD activity ofVerbena nybrida were respectively
testedon0,4d,7dundertheconditionof0℃treatment.Theseresultsstronglysuggestedthatthecoldresistance
of the transgenicVerbena nybrida was higher than non-transgenicVerbena nybrida., and the cold tolerance of
OsLsi1genetransformedplantshigherthantheplantstransformedwithOsLsi2,whichprovidedfreezing-resistance
germplasmofVerbena nybrida.,tosomeextent.
Keywords Verbena nybrida,PCRdetection,RT-PCRdetection,Physiologicalindexdetection
基金项目：本研究由黑龙江省研究生创新科研项目(YJSCX2011-072HLJ)资助
低温胁迫是植物栽培中常遇到的一种灾害。由
于低温在植物整个生育过程中均会造成不利影响，
严重影响植物的正常生长，降低植物的品质及观赏
性。因此，提高植物抗低温的能力成为解决如冷害
造成的植株苗弱、生长迟缓、品质下降等问题的重要
方法之一。
目前，随着现代生物技术的发展，通过植物基因
工程将特异基因导入植物，在不改变原有优良性状
的基础上提高植物的抗逆性，已经在多种植物上获
得成功，但关于花卉抗性基因工程方面的研究报道
并不多(李静和车代弟,2004;李美如等,2003)。
美女樱(Verbena nybrida)是马鞭草科马鞭草属多
年生草本花卉，其恣态优美，花色丰富，色彩艳丽。美
女樱株丛矮密，花繁色艳，花期为5~11月，由于花期
长可用作花坛、花境材料,也可作盆花大面积栽植于
园林隙地、树坛中(包满珠, 2005,中国农业出版社,
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
pp.193-194)。但是美女樱的耐寒能力较弱，且高温高
湿的环境下易发生如白粉病、霜霉病的病害、抗性较
弱，本研究通过基因工程的方法来改良其抗寒性。
硅是地壳和土壤中含量第二丰富的元素，被认为
是植物生长发育的准必需元素。绝大多数的植物组
织中都含有硅(李莉等,2010)。植物体中可溶性硅能
提高植株抗寒抗旱、防治病虫害和抗倒伏的能力，激
发多个防御反应机制(房江育和马雪泷,2005)。据报
道，在水稻中克隆出一类硅转运蛋白基因(陈虞超等,
2009)，与硅在植物中的转运及利用有关。其中Lsi1
(Lowsiliconrice1)基因主要负责编码参与植物对土
壤中硅的吸收的硅转运蛋白；Lsi2(Lowsiliconrice2)
基因主要负责编码硅从植物中释放到外界的硅转运
蛋白，这两个基因相辅相成维持植物体内硅的平衡。
本研究将硅转运蛋白基因 OsLsi1 和 OsLsi2 转
入美女樱中,研究该基因对美女抗寒性的影响。对经
PCR鉴定的阳性转基因美女樱植株进行RT-PCR检
测，结果表明硅转运蛋白基因 OsLsi1和 OsLsi2在美
女樱中能够正常转录并表达，说明这两个基因已经
整合到美女樱中，之后进行低温处理并测定相关生
理指标，研究转基因美女樱的抗寒性，也为创建美女
樱抗寒种质资源奠定基础。
1结果与分析
1.1转 OsLsi1基因抗性植株的 PCR及 RT-PCR检测
对获得的51株再生植株用CTAB法提取DNA,
以待测转基因植株叶片DNA为模板，OsLsi1基因质
粒为阳性对照，未转化的美女樱叶片DNA和水分别
为阴性对照和负对照，使用 OsLsi1基因特异引物进
行PCR扩增,转基因植株可扩增出约1200bp的目
的片段，而未转化植株的无扩增条带(图1)，其中检
测出26株为阳性植株，阳性率为70%，初步证明了
OsLsi1基因已经整合到美女樱中。
RT-PCR检测结果如图2所示，观察到阴性对照
无扩增带，而阳性对照和转基因PCR呈阳性的植株
图2PCR阳性植株的RT-PCR检测
注:M:DL2000marker;1:阳性对照;2:阴性对照;3~8:抗性植株
Figure2RT-PCRanalysisofPCR-positiveplants
Note: M: DL2000 marker; 1: Positive control; 2: Negative con-
trol;3~8:Regeneratedplants
均能扩增出约1200bp的目的片段，与之前PCR检测
的结果一致，说明 OsLsi1基因已经整合到美女樱中。
1.2转 OsLsi2基因的 PCR及 RT-PCR检测
对获得的60株再生植株用CTAB法提取DNA，
以待测转基因植株叶片DNA为模板，OsLsi2基因质
粒为阳性对照，未转化的美女樱叶片DNA和水分别
为阴性对照和负对照，使用 OsLsi2基因特异引物进行
PCR扩增，转基因植株可扩增出约1715bp的目的
片段，而未转化的植株无扩增条带(图3)，其中检测出
42株为阳性植株，阳性率为70%，初步证明了 OsLsi2
基因已经整合到美女樱中。
RT-PCR检测结果如图4所示，在对PCR检测
初步证明42株阳性植株中，有32株转基因美女樱
叶片的RNA在1715bp附近扩增出与质粒对照一
致的条带，证明了目的基因已经整合到美女樱中。但
有10株美女樱叶片的RNA没有得到转录，这说明
在PCR在检测时出现了假阳性，同时也说明PCR检
测只能作为转基因分子检测的初筛，进一步检测证
明基因的转入是非常有必要的。
1.3低温胁迫下转基因美女樱相关生理指标的测定
1.3.1低温胁迫下转基因美女樱丙二醛(Maleicdialdeh
-yde,MDA)含量的分析
低温胁迫下丙二醛(MDA)能使酶失活并且对细
741
图4PCR阳性植株的RT-PCR检测
注:M:DL2000marker;1:阳性对照;2:阴性对照;3~8:抗性植株
Figure4RT-PCRanalysisofPCRpositiveplants
Note: M: DL2000 marker; 1: Positive control; 2: Negative con-
trol;3~8:Regeneratedplants
胞膜等生物膜造成损伤，使其透性增大透性增大(李
合生,2002,高等教育出版,pp.415-419)。因此，MDA
含量的高低反应出植物细胞抗氧化能力的强弱，间
接反映出植物细胞受损程度和植物抗寒能力。
检测发现，低温胁迫 0~4 d时，CK、L2株系的
MDA含量一直呈上升趋势，而L1株系呈先上升后
下降趋势，1d时L1株系MDA含量达到最高值，出
现这种情况可能是由于，低温胁迫1d时，转化美女樱
的自身抵抗机制还没能完全启动，而在胁迫4d时由
于 OsLsi1基因的转化对土壤中硅的大量吸收，使硅起
到保护植物的作用，胁迫4~7d时，CK、L1、L2株系的
MDA含量也一直呈上升趋势，但CK、L2株系MDA
含量都明显高于L1株系(图5)。与对照相比较，L2株
系的MDA含量明显高于L1株系，由此可以推测，转
OsLsi1基因美女樱的抗寒能力比转 OsLsi2基因美女
樱抗寒能力高。
通过多重比较分析发现(表1)，在低温胁迫 0 d
时，CK与L2株系差异并不显著，而L1株系与CK、
L2株系相比差异性显著。在胁迫1d时，三个株系差
异性均不显著，而在胁迫4d以后一直保持着显著
地差异性。
由此说明，OsLsi1 基因的导入可以显著降低低
温胁迫的美女樱MDA的含量，植物的抗寒能力有所
提高；相反，OsLsi2基因的导入可以提高低温胁迫美
图5低温胁迫不同时间各株系MDA含量比较
注:a:胁迫0天;b:胁迫1天;c:胁迫4天;d:胁迫7天
Figure5ComparisonofMDAcontentindifferenttransgeniclines
underthestressoflowtemperatureatdifferenttimes
Note: a: Stress zero day; b: Stress one day; c: Stress four day; d:
Stresssevenday
女樱的MDA的含量，使植物抗寒能力降低，间接证
明硅可以提高植物抗寒能力。
1.3.2低温胁迫下转基因美女樱脯氨游离酸含量的分析
游离脯氨酸是一种小分子渗透调节物质，是水
溶性最大的氨基酸。植物在逆境胁迫条件下，均积累
高水平的脯氨酸(朱虹等,2007)。
胁迫7d
sevendays
Stress
11.619±0.432a
6.008± .021b
14.516±0.522c
表1低温胁迫不同时间各株系MDA含量的差异性分析
Table1DifferentialanalysisofMDAcontentsamonglinesatdif-
ferenttimesunderthestressoflowtemperature
株系
Lines
ck
L1
L2
胁迫0d
zeroday
Stress
2.573±0.188a
3.302± .219b
2.563±0.170a
胁迫1d
oneday
Stress
4.919±0.098a
4.583±0.444a
4.625±0.268a
胁迫4d
fourdays
Stress
7.412±0.292a
2.563±0.130b
7.855±0.1 0c
MDA含量(μmol/L)
MDAcontent(μmol/L)
注:有相同字母的组合差异不显著(p>0.05);无相同字母的组
合差异显著(0.01Note: The same letters mean no significant difference (p>0.05);
Thedifferentlettersmeansignificantdifference(0.01转硅转运蛋白(OsLsi1和OsLsi2)基因美女樱及抗寒性分析
TransgenicVerbenaNybridawithSiliconTransporterProtein(OsLsi1,OsLsi2)GeneandItsFreezingResistance
742
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
检测发现，低温胁迫0~4d时,CK、L1株系的游
离脯氨酸的含量一直呈上升趋势，4d时CK株系达到
最高值，之后呈下降趋势；胁迫4~7d时,L1株系的
游离脯氨酸含量一直是上升趋势，且在7d出现峰值，
而 L1、L2株系的游离脯氨酸的含量则呈下降趋势
(图6)。与对照组相比较，L1株系的游离脯氨酸含量
明显高于L1株系，由此可以推测，转 OsLsi1基因美
女樱的抗寒能力比转 OsLsi2基因美女樱抗寒能力高。
图6低温胁迫不同时间各株系游离脯氨酸含量比较
注:a:胁迫0天;b:胁迫1天;c:胁迫4天;d:胁迫7天
Figure 6 Comparison offree proline content in different linesun-
derthestressoflowtemperatureatdifferenttimes
Note: a: Stress zero day; b: Stress one day; c: Stress four day; d:
Stresssevenday
经过多重比对发现(表2)，低温胁迫0d时，CK
株系与L1、L2株系呈现显著差异，L1与L2之间差
异性不显著；在胁迫1d、4d、7d时，三个株系都达到
差异显著水平。由此推断 OsLsi1基因可以提高美女
樱体内游离脯氨酸的含量，从而提高植物的抗寒能
力；OsLsi2基因的转入降低了游离脯氨酸的含量，使
植物抗寒能力降低。
1.3.3低温胁迫下转基因美女樱SOD活性的分析
超氧化物歧化酶(SOD)是一种植物体内重要的
酶类，其活性与植物的抗寒能力密切相关，可以反映
出植物对逆境的适应(史雨刚等,2007)。
图7低温胁迫不同时间各株系SOD活性比较
注:a:胁迫0天;b:胁迫1天;c:胁迫4天;d:胁迫7天
Figure 7 Comparison of SOD activity in differentlines under the
stressoflowtemperatureatdifferenttimes
Not : a: Stress zero day; b: Stress one day; c: Stress four day; d:
Stresssevenday
检测发现，低温胁迫0~4d时，CK、L1、L2株系
的SOD活性都呈上升趋势；胁迫4~7d时L1株系一
直是上升趋势，且在7d出现峰值，而L1、L2株系的
SOD活性则呈下降趋势。与对照相比较，L1株系的
SOD活性明显高于 L2株系，由此可以推测，转
OsLsi1基因美女樱的抗寒能力比转 OsLsi2基因美女
樱抗寒能力高(图7)。
经过多重比对发现(表3)，低温胁迫0d时，CK与
L1、L2株系呈现显著差异；低温胁迫1、4、7d时，CK
与L1、L2株系也呈现显著差异，L1和L2株系在低
温胁迫4d后SOD活性均呈现下降趋势。由此分析
可以说明，OsLsi1基因可以使美女樱SOD酶系统不
受破坏，从而提高美女樱对低温的抵抗力；而 OsLsi2
基因导致SOD活性降低，使美女樱抗寒能力降低。
1.3.4低温胁迫下转基因美女樱POD活性的分析
POD与SOD相似，也是植物防御膜质过氧化机
制中其重要作用的保护酶，有研究表明，POD的活性
与植物抗寒能力呈正相关。
检测发现，低温胁迫0~4d时，CK株系POD活
性呈先上升后下降趋势，L1株系的POD活性呈上升
趋势，而L2株系则一直保持下降趋势；胁迫4~7d时
L1株系一直呈上升趋势，且在7d出现峰值，而L1、
L2株系的POD活性则呈下降趋势。与对照相比较，
L1株系的POD活性明显高于L2株系，由此可以推
测，转 OsLsi1基因美女樱的抗寒能力比转 OsLsi2基
因美女樱抗寒能力高(图8)。
经过多重比对发现(表4)，低温胁迫0d时，L1与
CK、L2这两个株系差异并不显著，CK与L2差异性
显著；但随着低温胁迫天数的增加，三个株系POD活
性均出现差异性显著，在胁迫4d时达到极显著水
平。由分析可推测，OsLsi1可能保护了植物体内的抗
表2低温胁迫对植株游离脯氨酸含量的差异性分析
Table 2 Differentialanalysis offree proline content among line-
satdifferenttimesunderthestressoflowtemperature
株系
Lines
ck
L1
L2
胁迫0d
Zeroday
stress
4.228±0.194a
3.824±0.075b
3.553±0.136b
胁迫1d
Oneday
stress
4.541±0.137a
5.133±0.111b
4.057±0.156c
胁迫4d
Fourdays
stress
5.980±0.099a
6.403± .242b
2.842±0.109c
胁迫7d
Sevendays
stress
5.980±0.099a
6.403± .242b
2.842±0.109c
游离脯氨酸含量(U/gFW)
Freeprolinecontent(U/gFW)
743
图8低温胁迫不同时间各株系POD活性比较
注:a:胁迫0天;b:胁迫1天;c:胁迫4天;d:胁迫7天
Figure8ComparisonofPODactivityin differentlinesunderthe
stressoflowtemperatureatdifferenttimes
Note:a: Stress zero day; b: Stress one day; c: Stress four day; d:
Stresssevenday
氧化系统不受破坏，从而增加了植物体内SOD、POD
等保护酶类对活性氧清除能力；相反 OsLsi2促使抗
氧化系统的伤害，降低植物抗寒能力。
2讨论
在对抗性植株分子检测时，PCR一直是重要检
测方法之一。其反应体系较小，成本低而且灵敏性
好，但是PCR是在DNA水平上对外源基因进行检
测极易出现假阳性，本文利用根癌农杆菌介导的方
法将 OsLsi1基因和 OsLsi2基因转化到美女樱中，转
OsLsi1基因的美女樱RT-PCR检测与PCR检测结果
一直。但是转化 OsLsi2基因的60株美女樱中经过
PCR检测其中42株为阳性植株，后期运用RT-PCR
对呈阳性的42株植株进行检测，发现只有32株呈
阳性，这说明在PCR检测时出现了假阳性。由此可以
看出，对转化植株进行分子检测时，还需要 Southern
杂交、Northern杂交、Western杂交等更精确的检测
手段进行更进一步的检测，来确定目的基因是否已
经整合到受体植株中(贺熙勇等,2008)。
低温是限制植物分布影响产量的主要原因，对
植物冷害机理的研究表明：低温直接损伤膜结构，使
膜脂及功能蛋白受到损伤，从而破坏细胞正常的生理
生化过程，因此膜结构的稳定性与植物抗寒性直接
相关，POD和SOD作为内源活性氧清除剂能够在低
温逆境中清除体内过量的活性氧，维持活性氧代谢
平衡，保持膜结构的稳定性。从而消除或减轻伤害;低
温锻炼可使酶的活性增强，使植物免受低温伤害，因
而在低温逆境中POD和SOD活性的水平与植物的
抗寒性强弱有着十分密切的关系，并可作为植物抗
寒性检测的生理指标(张钰等,1998)。
实验结果显示，转硅转运蛋白基因 OsLsi1植株
的SOD和POD的活性均高于对照植株,从而在低
温胁迫下能够有效地清除细胞内过量的活性氧，保
持膜结构的稳定性，表明转基因植株在生理生化水
平上获得了有益的变异，并从生理生化水平上验证
转基因植株抗寒性的增强。同时通过检测发现转
OsLsi1基因的植株抗逆性明显强于转化 OsLsi2基因
的植株，可能是由于 OsLsi1基因与植物从外界土壤
环境中吸收硅有关，可以提高植物吸收硅的效率，增
表3低温胁迫对植株SOD活性差异性分析
Table3DifferentialanalysisofSODactivityamonglinesatdefferenttimesunderthestressoflowtemperature
SOD活性(U/gFW)
SODactivity(U/gFW)
株系
Lines
ck
L1
L2
胁迫1d
Onedaystress
12.532±0.783a
16.063± .167b
7.447±0.367c
胁迫4d
Sevendaysstress
11.700±0.308a
27.607±0.414b
5.130±0.085c
胁迫4d
Fourdaysstress
15.087± .215a
21.610±0.361b
11.677±0.299c
胁迫0d
Zerodaystress
9.037±0.074a
13.353±0.787b
7.433±0.496c
表4低温胁迫对植株POD活性差异性分析
Table4DifferentialanalysisofPODactivityamonglinesatdifferenttimesunderthestressoflowtemperature
株系
Lines
ck
L1
L2
POD活性(U/gFW)
PODactivity(U/gFW)
胁迫0d
ZerodayStress
4.347±0.112a
2.533±0.178ab
4.033±0.091b
胁迫1d
OnedayStress
6.517±0.319a
8.067±0.144b
3.167±0.265c
胁迫4d
FourdaysStress
6.087±0.146a
8.320±0.192b
2.047±0.083c
胁迫7d
SevendaysStress
5.577±0.505a
11.690±0.284b
1.287±0.168c
转硅转运蛋白(OsLsi1和OsLsi2)基因美女樱及抗寒性分析
TransgenicVerbenaNybridawithSiliconTransporterProtein(OsLsi1,OsLsi2)GeneandItsFreezingResistance
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
强植物抗逆能力；而 OsLsi2基因与植物将自身的硅
向外界环境释放有关，使植物抗逆能力减弱。
随着分子生物学技术的飞速发展，运用基因工
程手段提高植物的抗逆性为抗性育种开辟了新途径
(王侠礼,2005,北方园艺,6:14-15)。在大豆、玉米、棉
花等农作物上(俞超等, 2008,江苏农业科学, 4: 31-
33;曹桂艳和刘艳,2001)，本研究利用农杆菌介导法
将 OsLsi1、OsLsi2基因转入美女樱中，经过分子检测
之后测定相关生理指标，表明转基因美女樱的抗寒
能力得到了进一步提高，对培育抗寒美女樱品种。
3材料与方法
3.1植物材料、质粒及农杆菌菌株
美女樱(Verbena nybrida nybrida)，取自东北农业
大学园艺实验站。农杆菌GV3101，质粒pBI121由东
北农业大学园林育种研究室保存。pGEM-T Easy
Vector购自Promega公司。
3.2 转基因植株(OsLsi1, OsLsi2)基因 PCR、RT-PCR
检测
移栽于温室的转基因再生植株长至10cm高时,
采用CTAB法提取转基因植株的叶片总DNA，根据
基因序列引物进行PCR扩增，OsLsi1基因序列引物，
P1：5-AGGGATCCTAGCCAGCCAGTGTTAGA-3
和 P2：5-TACGAGCTCACACGAACCACCAAGCA-
A-3，OsLsi2 基因序列引物 P3：5-AGG GATCCAG-
GTGGTGGTCGATCGAA-3和 P4：5-TACGAGCT-
CGCCAATTCAATTTCAAGCT-3，PCR反应体系总
体积为25μL：模板DNA1μL(约100ng)2μL，上、下
游引物各1μL，Taq(5U/L)03μL，dNTP(2.5mmol/L)
2.5μL，Mg2+(25 mmol/L) 2.4μL，10×Buffer 2.5μL，
ddH2O补足25μL。
PCR反应程序：94℃预变性7min，然后94℃变
性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最
后72℃延伸10min，4℃保存。扩增后取10μL产物
进行电泳检测。
RT-PCR检测：采用硼砂SDS法提取RNA并进
行检测，以反转录后产物为模板，对转 OsLsi1基因、
OsLsi2基因的植株进行RT-PCR检测，反应体系及
反应条件同PCR检测体系相同。
3.3 转 OsLsi1、OsLsi2基因美女樱植株的低温胁迫抗
性检测
3.3.1待测材料的低温处理
将未转基因与转基因植株分别栽种于营养钵
中，待幼苗长至4~6片真叶时，进行0℃低温处理分
别为0、1d、4d、7d采样，每处理重复三次,然后测其
相关生理指标。
3.3.2生理指标的测定
(a)丙二醛(MDA)含量的测定：硫代巴比妥酸法
(邹琦,2000,中国农业出版社,173-174)。
(b)游离游离脯氨酸(Pro)含量的测定：酸性茚三
酮法(邹琦,2000,中国农业出版社,161-162)。
(c)超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：采用 NBT
法(李合生,2003,高等教育出版社,191-205)。
(d)过氧化物酶(POD)活性测定：采用愈创木酚法
(李合生,2003,高等教育出版社,191-205)。
上述实验均重复3次，并进行统计分析。
作者贡献
胡翠平、赵然和张美恒是本研究的实验设计和
实验研究的执行人；王秀刚、赵然和张焕完成数据分
析；张美恒参与实验设计，试验结果分析；胡翠平和
樊金萍是项目的构思着和负责人，指导实验设计，数
据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最
终的文本。
致谢
本研究由黑龙江省研究生创新科研项目(YJSC-
X2011-072HLJ)资助。感谢两位匿名的同行评审人的
评审建议和修改建议。
参考文献
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