全 文 ：盘花垂头菊中两种新型倍半萜类化合物诱导
人肝癌细胞 SMMC-7721凋亡
陈瑛 ,张琪 ,王勤＊　(兰州大学生命科学学院 ,甘肃兰州 730000)
摘要　[目的]为开发新型肿瘤治疗药物提供依据。[方法]通过单细胞电泳和流式细胞分析法等技术 ,研究 2种从盘花垂头菊中分离的
高含氧甜没药烯型倍半萜化合物(HOBS)对人肝癌细胞 SMMC-7721 的抑制作用。[结果] 2种HOBS处理 48 h后 ,SMMC-7721细胞体积变
小 ,且出现膜泡化和凋亡小体。单细胞电泳试验表明 SMMC-7721细胞经不同浓度HOBS处理后 , DNA碎片在电场中呈彗星状向阳极移
动 ,且彗星样尾迹随药物浓度的增大而增长。HOBS能以剂量依赖的方式诱导 SMMC-7721细胞凋亡。当 2种HOBS浓度为 8μg/ml时 ,细
胞凋亡率分别达 36.7%和 38.9%。凋亡率随药物浓度的增大而升高 , 与对照组相比有显著差异 ,并出现典型的凋亡峰。2种HOB可使
细胞内[Ca2+] i水平升高。[结论]HOBS能诱导 SMMC-7721细胞凋亡。
关键词　盘花垂头菊;HOBS化合物;SMMC-7721细胞;细胞凋亡;
中图分类号　S 567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)10-04140-04
Apoptosis of Human Hepatoma Cells SMMC-7721 Inducedby Two Kinds of New Sesquiterpenoid from Cremanthodium discoideum Maxim
CHEN Ying et al　(College of Life Science of Lanzhou University, Lanzhou , Gansu 730000)
Abstract　[ Objective] The research aimed to provide basis for developing new medicines for tumor treatment.[Method] Through the technologies of sin-
gle cell electrophoresis and flow cytometry analysis , the inhibition of 2 kinds of highly-oxygenous bisabolene sesquiterpenoid(HOBS)isolated from Cre-
manthodium discoideum Maxim on human hepatoma cell SMMC-7721was studied.[ Result] After being treated with 2 kinds of HOBS for 48 h , the volume
of SMMC-7721 cells became smaller, and cell membrane vesicles and small apoptotic bodies appeared.Single cell electrophoresis showed that DNA frag-
ment moved towards the anode in the comet shape and the comet-shape wake became longer with the increasing of the drug concn.HOBS could induce
SMMC-7721 cell apoptosis in the dose-dependent manner.When both of HOBS were at 8 ug/ml , the cell apoptotic rates reached 36.7%and 38.9% re-
sp.The apoptotic rates were enhanced with the increasing of drug concn.and had significant differencewith that in control group and typical apoptosis peak
appeared.Both of HOBS made the [ Ca2+] I level in cell enhanced.[ Conclusion] HOBS could induce the apoptosis of SMMC-7721 cells.
Key words　 Cremanthodium discoideumMaxim;HOBS compounds;SMMC-7721 cell;Cell apoptosis
基金项目　甘肃省国际科技合作重点项目(4WS054-A75-036)。
作者简介　陈瑛(1982-),女 ,甘肃兰州人 ,硕士研究生 ,研究方向:肿
瘤免疫学。 ＊通讯作者。
鸣　　谢　兰州大学功能有机分子国家重点实验室贾忠建和祝英提
供受试化合物。
收稿日期　2008-02-19
　　垂头菊属植物(Cremanthodium)系菊科千里光族 ,主产喜
马拉雅山及其相邻地区 ,全世界约 64种 ,在我国均有分布。
它们集中分布于青藏高原和西南山区 ,生长于高山灌丛 、高
山草甸及高山流石滩环境中。盘花垂头菊(Cremanthodium
discoideumMsxim)为菊科垂头菊属多年生草本植物 ,须根肉
质 、较细 ,花果期为 6～ 8月 ,主要分布于甘肃 、青海 、四川 、西
藏等省 ,生长在海拔 3～ 5 km的山间草坡或林中[ 1] 。民间为
传统藏药 ,全草入药 ,有消炎解毒 、消肿 、健胃 、止咳等疗
效[ 2-3] 。1β ,8-二当归酰氧基-2β-已酰氧基-3β , 10-二羟基-4α-
氯-11-甲氧基-没药-7(14)-烯(化合物 1)和 1β , 8-二当归酰氧
基-2β-乙酰氧基-3β ,4β-环氧-10羟基-11甲氧基-没药-7(14)-烯
(化合物 2)是由兰州大学应用有机化学国家重点实验室贾忠
建教授和祝英博士等从盘花垂头菊中提取出来的[ 4]高含氧
甜没药烯型倍半萜(Highly oxygenated bisabolance sesquiter-
pense ,HOBS)化合物 ,其结构式见图 1。笔者研究了这 2种化
合物的抗癌活性 ,旨在探讨它们对人肝癌细胞 SMMC-7721的
抑制活性。
1　材料与方法
1.1　试剂　化合物 1和化合物 2用二甲基亚砜助溶 ,再用
培养基稀释(使 DMSO终浓度小于 0.4%);培养基 RPMI-1640
和小牛血清分别购自 Sigma公司和杭州四季青公司;除常规
药品外 ,如无特殊说明其余药品均购自 Sigma公司。
1.2　细胞培养和处理　人肝癌细胞系 SMMC-7721细胞 ,由
兰州大学生命科学学院生物物理所提供。将其培养于 RPMI-
1640培养基中 ,外加灭活小牛血清 10%、青霉素 100 U/ml 、
NaHCO3 2.0g/ml ,链霉素 100μg/ml ,置于 37 ℃、饱和湿度 、5%
CO2的细胞培养箱中。消化收集处于对数生长期的细胞 ,以
5×105 cells/ml 密度接种 ,每 24 h更换新鲜培养液并加药 。
对照组细胞用正常培养基进行培养 ,每 24 h更换培养液 。
注:(1)为化合物 1的结构 ,(2)为化合物 2的结构。
Note:(1),(2)denote structure of compound 1 and 2, respectively.
图1　2种 HOBS化合物的化学结构
Fig.1　The chemical structures of two HOBS compounds
1.3　形态观察　将生长在清净盖玻片上的细胞直接用吖啶
橙(在PBS溶液中的浓度为 10 μg/L ,pH值 4.2)染色 15 min ,
PBS液脱色后 ,在Olympus BH-2荧光显微镜下观察并照像 。
1.4　单细胞电泳定性检测DNA损伤[ 5-7] 　单细胞电泳是一
项用于检测 DNA损伤的技术。包埋于琼脂糖中的细胞群体
经过电泳后 ,DNA 未损伤的细胞呈圆形的小球状迁移 ,DNA
损伤导致细胞产生明显的彗尾 ,因此也称之为彗星电泳[ 8] 。
消化收集经不同浓度(2、4 、8μg/ml)化合物 1和化合物 2处理
的细胞用PBS溶液洗 3次 ,细胞用 1 ml PBS溶液悬起 ,吸取
90μl 0.5%常熔点琼脂糖(煮沸)均匀涂于洁净载玻片上 ,水
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 ,36(10):4140-4143　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　陈玉敏　责任校对　马君叶
平状室温成胶 3～ 5 min ,作为底层固定胶。吸取 50μl细胞液
(约 104 个细胞),按 1∶3与低熔点琼脂糖在 37 ℃下混匀 ,吸取
90 μl均匀涂布在底层胶上 ,冰上成胶 5 min 。将凝固好的凝
胶玻片浸入裂解液(0.03mmol/L Tris ,1 mmol/L Na2EDTA),冰
浴裂解 1.5 h 后取出 ,呈水平状浸入电泳槽中 ,电泳液(40
mmol/L Tris ,5mmol/L EDTA ,20mmol/L乙酸 ,pH值 8.3)浸泡
20 min ,在 60 V电压条件下电泳 20 min 后取出 ,用洗涤液冲
洗。采用 EB(20μg/ml)染色 ,在Olympus BH-2荧光显微镜下
观察并照像 。
1.5　流式细胞术测定细胞凋亡[ 9-10] 　经不同浓度(2、4、8
μg/ml)化合物 1和化合物 2处理 48 h 的 SMMC-7721细胞消
化收集后离心 , PBS 溶液洗 2次 ,细胞沉淀用预冷的 70%乙
醇固定 ,置于-20 ℃冰箱内 24h以上 。上机前用PBS溶液洗
去固定液 ,沉淀重悬于 100 U/ml RNaseA液(含 0.1%TritonX-
100)和 50μg/ml PI染液中 ,室温放置 30 min ,洗去多余染液。
经300 目尼龙网过滤后 ,在流式细胞仪(EPICS XL型 , U.S
COULTER.)上进行测定 ,激发波长为 488 nm ,滤光片波长为
630 nm。每组计数 104 个细胞的DNA含量。
1.6　[ Ca2+] i浓度测定[ 11] 　细胞内 Ca2+浓度采用最广泛应
用的钙荧光染料Fura-2/AM(DMSO配制)进行测定 。未处理
的 SMMC-7721 细胞离心后 , PBS 溶液洗 2 次。终浓度 5
μmol/L Fura-2/AM 37 ℃孵育 20 min。离心 ,PBS溶液洗 2次 ,
最后细胞悬于Hepes buffer (150 mmol/L NaCl、5mmol/L KCl 、
1.2mmol/LMgSO4 、1.2 mmol/L Na2HPO4 、1.8 mmol/L CaCl2 、25
mmol/L Hepes、10mmol/L葡萄糖 , pH 值 7.4)中 ,调整细胞浓
度为 1×106 cells/ml。将该细胞悬液分为对照组和处理组 ,于
荧光分光光度计(M850型 ,Hitachi)37 ℃恒温检测 ,荧光发射
波长为 510 nm ,激发波长为 340和 380 nm 。由下式计算细胞
内游离钙离子浓度:
[Ca2+] i=Kd·(F-Fmin)/(Fmax-F) (1)
其中 , Kd 为 Fura-2 与 Ca2+之间的解离常数(224
nmol/L);在计算Ca2+浓度前 ,应减去细胞的自发荧光;F为细
胞的基本荧光值 ,Fmax为由裂解细胞膜后带来的过剩的钙离
子的荧光值 , Fmin为由EGTA 完全螯合 Ca2+后的荧光值。
1.7　数据处理　数据用Microsoft Excel软件进行统计处理 ,
数据均以 x±s表示。
2　结果与分析
2.1　化合物 1和化合物 2处理后 SMMC-7721细胞的形态特
征　荧光显微镜观察结果表明 ,正常 SMMC-7721细胞常为多边
形扁平细胞 ,体积大。经 2、4、8μg/ml的化合物 1和2处理48 h
后 ,细胞体积变小 ,细胞发生膜泡化 ,出现了凋亡小体(图 2)。
注:A 为对照;B1和B2分别为 2μg/ml 化合物 1和 2处理的 SMMC-7721细胞;C1和C2为 4μg/ml化合物 1和 2处理的SMMC-7721细胞;D1和D2
为 8μg/ml化合物 1和 2处理的 SMMC-7721细胞。下图同。
Note:A , cont rol;B1 and B2 , 2μg/ml compound 1 and compound 2;C1 and C2 , 4μg/ml compound 1 and compound 2;D1 and D2, 8μg/ml compound 1 and
compound.The same as follow f igure.
图2　荧光显微镜观察结果(×330)
Fig.2　The observed results under fluorescencemicroscope
2.2　单细胞电泳定性检测 DNA损伤　对照组中单个未经
药物处理的 SMMC-7721细胞的DNA ,在荧光显微镜下呈圆形
亮团;细胞经不同浓度(2、4、8μg/ml)的化合物 1和化合物 2
处理后 ,在DNA碎片电场中向阳极移动 ,在荧光显微镜下形
同“彗星(Comet)” ,很小的彗星头 ,长而大的彗星尾 。随着药
物浓度的增大 ,细胞彗星样尾迹相应增长(图 3)。
2.3　流式细胞术定量检测细胞凋亡　SMMC-7721细胞经不
同浓度的 2种化合物处理 48 h后 ,用流式细胞术观察药物诱
导 SMMC-7721细胞凋亡。用 2和 4μg/ml浓度化合物 1和化
合物 2 处理后 , SMMC-7721 细胞的凋亡率分别为 18.0%、
19.3%、23.9%和 27.5%;经浓度为 8μg/ml化合物 1和化合
物 2处理后 ,SMMC-7721细胞的凋亡率达到 36.7%与 38.9%
(表 1)。凋亡率随药物浓度的增大而升高 , 与对照组显著差
异 ,并出现典型的凋亡峰(图 4)。
2.4　化合物 1和化合物 2诱导 SMMC-7721细胞[ Ca2+] i上
升　细胞内Ca2+作为第二信使 ,对许多的生命活动起着调控
作用 。研究表明 ,化合物 1和 2可以通过某种方式使细胞内
Ca
2+浓度升高 ,加入 4 μg/ml 化合物 1 和 2 后细胞内的
414136卷 10期　　　　　　陈瑛等　盘花垂头菊中两种新型倍半萜类化合物诱导人肝癌细胞 SMMC-7721凋亡
[ Ca2+] i水平在 20 min内迅速上升并维持在一定的水平(表 2 ,图 5)。
图 3　单细胞电泳检测 SMMC-7721细胞的 DNA损伤(荧光显微镜 , 660×)
Fig.3　DNAdamage of SMMC-7721 cell by single cell electrophoresis(fluorescence microscope 660×)
表 1　不同浓度化合物1和化合物 2诱导的 SMMC-7721细胞凋亡
Table 1　Apoptosis induced by two compounds in SMMC-7721 cell line
浓度
Concentration∥μg/ml
凋亡率Apoptotic rate%
化合物 1 Compound 1 化合物2 Compound 2
control 　　　　1.7 　　　　1.7
2 18.0 19.3
4 23.9 25.1
8 30.6 34.6
3　小结与讨论
(1)细胞凋亡是由基因编码控制的程序性细胞死亡 ,以
清理不必要的 、衰老的 、损伤的细胞 ,具有典型的形态学和生
物化学的特征。它通过细胞的自杀机制完成 ,并且能够通过
环境刺激 ,包括氧胁迫 、毒素 、病毒等引发DNA 损伤[ 12-13] 。
细胞凋亡包括一系列明显的连续的形态学变化 ,染色质在核
膜处聚集成大块紧凑的颗粒 ,细胞质膜皱缩 ,核和细胞质膜
呈锯齿状 ,核裂解 ,胞浆内出现空泡 ,凋亡小体的出现
图4　流式细胞技术检测由化合物 1和 2处理 48 h后的 SMMC-7721细胞凋亡
Fig.4　Flow cytometric analysis of apoptosis induced by two compounds after 48 h treatment
等[ 14-15] 。经过 2 、4、8 μg/ml化合物 1和 2处理过后 ,通过荧
光显微镜观察发现 SMMC-7721确实发生了凋亡。
　　(2)凋亡应答的一个方面是通过多级的核酸内切酶诱导
DNA损伤。近年来 ,凋亡的 DNA损伤已经能在固定的染色
质结构水平上被检测[ 16] ,这些DNA损伤的碎片可通过 SCGE
被检测。该方法也叫彗星电泳 ,是一种快速检测DNA 破碎
的方法[ 17] ,比传统有毒的试验技术更为方便 、灵敏 ,并可以在
任何真核细胞群体中定量定性测定DNA的损伤[ 18] 。该研究
中 SCGE结果表明 ,经过 2 、4 、8 μg/ml 化合物 1和 2处理后 ,
DNA的确发生了片断化。流式细胞术通过荧光激发分选细
胞 ,可大量 、快速地测定单个细胞 ,已广泛应用于定量检测细
胞凋亡[ 17 , 19] 。流式细胞术检测结果表明 ,经 2、4、8μg/ml的
化合物 1和 2处理后 ,细胞有凋亡特征峰出现 ,发生了凋亡 ,
并具有浓度效应 。研究表明 ,化合物 1和 2可将细胞周期阻
滞在G1期 ,说明细胞的凋亡与细胞周期的改变有关 。
　　(3)据报道 , [Ca2+] i持续的升高是细胞凋亡过程中一个
4142 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
表 2　2种化合物对 SMMC-7721细胞中[ Ca2+] i的影响
Table 2　Effect of two compounds on intracellular [ Ca2+] i concentration in
SMMC-7721 cells
时间
Time∥min
[ Ca2+] i∥nmol/ L
化合物 1 Compound 1 化合物2 Compound 2
　　　0 　　　102.5±1.03 　　　102.5±1.03
10 165±2.15 160.2±3.54
20 203.4±1.62＊＊ 205.6±2.34＊＊
30 185±1.35＊ 190.2±1.35
40 162.5±2.14＊ 170.2±1.56
50 155±2.65 161.5±2.34＊
60 150±0.98 160±3.12
　注:＊表示与对照在 0.05水平上差异显著 , ＊＊表示在 0.01水平上差
异显著。
　Note:＊ signif icant ly different at 0.05 , ＊＊ signif icantly different at 0.01.
图 5　化合物1和2对 SMMC-7721中 Ca2+浓度的影响
Fig.5　Effect of compound 1 and compound 2 on intracellular Ca2+
in SMMC-7721 cells
早期的 、关键的事件[ 20] 。笔者通过荧光分光光度法检测
Fura-2/AM标记的胞内Ca2+浓度 ,发现经 4 μg/ml的化合物 1
和 2处理后 , [ Ca2+] i迅速增高。这说明化合物 1和 2诱导细
胞凋亡可能与胞内 Ca2+浓度的升高有关 。笔者首次探索了
由盘花垂头菊中提取出的 2种新型高含氧的甜没药烯型倍
半萜类化合物对于人肝癌细胞 SMMC-7721凋亡的诱导 ,它们
可能成为肿瘤治疗的一种新型药物。这有力证明了传统中
草药和现代医学在肿瘤预防和治疗方面的结合。这种中药
对靶分子的作用和细胞信号通路的影响仍需进一步研究。
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