全 文 ：书基础与临床医学
doi:10． 16846 / j． issn． 1004-3101． 2016． 04． 001
火绒草对 2 型糖尿病大鼠海马神经元 tau蛋白磷酸化及
学习记忆的影响
王鲁娟
* 1，刘红兵2，王凤斌2，朱光旭3，孙俊芳3，阎会春3
(1 潍坊医学院实验诊断学教研室，山东 潍坊 261053;
2潍坊医学院生理学教研室;3 潍坊医学院临床医学院 2012 级)
［摘 要］ 目的 观察火绒草水提取物对 2 型糖尿病(T2DM)大鼠海马区神经元 tau 蛋白过度磷酸化水平
和学习记忆的影响。方法 采用高糖高脂饮食诱导联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立 T2DM大鼠模型。将健
康 Wistar雄性大鼠 30 只，随机均分为对照组、T2DM组和火绒草组。水迷宫实验检测大鼠学习记忆功能;免疫组
化法检测海马 CA1，CA3，DG区神经元磷酸化 tau蛋白 p-tau(ser396)表达水平。结果 与对照组比较，T2DM 组
水迷宫逃避潜伏期延长(P ＜ 0． 01) ，跨过原平台位置次数减少(P ＜ 0． 01) ;免疫组织化学检测海马 CA1，CA3，DG
区神经元胞浆内 ser396 表达水平显著上调。与 T2DM组比较，火绒草组水迷宫逃避潜伏期缩短(P ＜ 0． 05) ，跨过
原平台位置次数增多(P ＜ 0． 05) ;海马区神经元 ser396 表达水平下降。结论 火绒草能减少海马区神经元过度
磷酸化 tau蛋白的表达，改善学习记忆功能。
［关键词］ 火绒草;2 型糖尿病;学习记忆;海马;p-tau(ser396)
［中图分类号］ Ｒ 338 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1004-3101(2016)04-0241-04
The Effect of Leontopodium on the Hyperphosphorylation of Tau Protein in the Hippocampus Neurons and the
Learning Memory of Type 2 Diabetes Mellitus Ｒats
WANG Lu-juan1，LIU Hong-bing2，WANG Feng-bin2，ZHU Guang-xu3，SUN Jun-fang3，YAN Hui-chun3
(1Department of Laboratory Diagnosis，Weifang Medical University，Weifang 261053，China;2Department of Physiology，
Weifang Medical University;3Clinical Medicine Department Grade 2012，Weifang Medical University)
［ABSTＲACT］ Objective To observe the effect of Leontopodium on the hyperphosphorylation of tau protein in the hippocampus neu-
rons and the learning memory of T2DM rat． Methods T2DM rat model was established by intraperitoneal injection with streptozotocin and
highglucose-high-fat diet． 30 cases of male Wistar rats were randomly divided into three groups:control group，T2DM group and Leontopodium
group． The Learning memory function was examined by morris water maze． The expression of p-tau(ser396)in hippocampus(CA1，CA3，DG)
was observed by immunohistochemical method． Ｒesults Compared with control group，the water maze escape latency time in T2DM group in-
creased significantly(P ＜ 0． 01)and the times striding over the platform decreased(P ＜ 0． 01);Expression of ser396 increased significantly in
hippocampus neurons． Compared with T2DM group，the escape latency time of Leontopodium group decreased(P ＜ 0． 05)and the times stri-
ding over the platform increased(P ＜ 0． 05)，expression of ser396 decreased significantly in hippocampus neurons． Conclusion Leontopodi-
um can significantly decrease the expression of ser396，and improve the learning and memory function in T2DM rats．
［KEY WOＲDS］ Leontopodium;T2DM;Learning and memory;Hippocampus;p-tau(ser396)
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* ［基金项目］ 潍坊市科学技术发展计划资助课题(课题编号:2014WS041) ;潍坊医学院大学生科技创新基金项目资助课题(课题编号:
KX2014016)
［作者简介］ 王鲁娟(1978 年 ～) ，女，讲师。主要研究方向:神经退行性疾病。
［通讯作者］ 王凤斌，E-mail:wfb1962@ 163． com
2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是由
多种原因引起的、以慢性高血糖为主要特征的代谢紊
乱疾病，其主要病理生理特征为胰岛 β 细胞功能失调
和胰岛素抵抗，学习记忆功能障碍是糖尿病中枢神经
系统并发症的重要表现。T2DM 显著增加阿尔茨海默
病(Alzheimer＇s disease，AD)发生的危险性［1，2］，脑内
Tau蛋白过度磷酸化以及 β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积是
AD的特征性变化。T2DM 和 AD 之间相互关联的复
杂发病机制尚不明确，也缺乏有效的防治手段，因此探
讨 T2DM患者 AD发病风险增高的原因和寻找防治的
药物具有重要意义。火绒草(Leontopodium)系菊科火
绒草属植物，早期临床试验发现，糖尿病患者服用火绒
草后血糖降低，尿糖明显减少［3］。火绒草能否减轻糖
尿病所致脑组织 AD样病变，保护神经细胞，尚未见报
道。本实验以 T2DM 大鼠为研究对象，观察火绒草对
T2DM大鼠学习记忆功能、海马区神经元 tau 蛋白在
ser396 位点磷酸化水平的影响，以深入探讨火绒草对
损伤神经的保护作用。
1 材料和方法
1． 1 材料 Wistar 大鼠，雄性，体重 150 ～ 200g，由山
东济宁抗生素厂提供，动物许可证号:SCXK2013000。
火绒草(新疆阿拉泰山) ;链脲佐菌素(Sigma公司) ;兔
抗大鼠 p-tau(ser396)抗体(Sigma公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 火绒草提取物的制备 火绒草 200g，加适量
水浸泡 12h，温火煮沸 1h，倾出煎液过滤，共煮 2 次，合
并滤液，旋转蒸发仪浓缩至 700ml，相当于 285． 7g /L
生药(以下均称火绒草)。
1． 2． 2 实验分组和 T2DM 大鼠模型的建立 参考文
献［4］。
1． 2． 3 Morris水迷宫实验 水迷宫主要由圆形水池、
摄像装置和电脑系统组成。①定位航行实验:连续
4d。每次将大鼠面向池壁，分别从 4 个象限放入水中。
电脑自动记录大鼠从入水至找到平台所用的时间，即
逃避潜伏期，每次实验时间上限为 120s，若大鼠在
120s内未找到站台，则逃避潜伏期为 120s，并由试验
者用木棒将其引导至平台上休息 30s，测试结果以逃
避潜伏期(s)表示，作为判断大鼠空间学习能力的指
标。②空间探索实验:在测试的第 5 天撤走平台，在同
一入水点将大鼠放入水池中，通过电脑测试系统观察
并记录大鼠在 120s内跨过原平台相应位置的次数，以
此作为判断其空间记忆能力的指标。
1． 2． 4 免疫组织化学检测海马 CA1，CA3，DG 区神经
元磷酸化 tau 蛋白 ser396 的表达水平 大鼠常规取
脑，4%多聚甲醛固定过夜，梯度沉糖后行冰冻切片。
室温下 4% 多聚甲醛固定 15 ～ 20min 后 PBS 冲洗 3
遍，正常羊血清封闭，37℃孵育 30min，倾去多余血清，
分别滴加兔抗大鼠(1∶ 500)p-tau(ser396)一抗，4℃过
夜，滴加生物素化二抗，37℃孵育 50min，滴加辣根过
氧化物酶(HＲP)标记的链霉卵白素，37℃孵育 60min，
DAB避光显色，苏木素复染细胞核。各步骤之间用 0．
01mol /L PBS 冲洗，5min × 3 次，中性树胶封片。在光
镜下观察大鼠海马 CA1，CA3，DG 区神经元 p-tau
(ser396)的阳性表达。
1． 2． 5 统计学处理 实验结果以 x ± s 表示，应用
SPSS10． 0 统计软件进行统计学处理，多组间数据比较
采用单因素方差分析，两组间数据比较应用方差分析，
采用 q检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有显著性。
2 结果
2． 1 水迷宫实验 T2DM组与对照组比较，逃避潜伏
期延长，跨过原平台位置次数减少;火绒草干预组与
T2DM组比较，逃避潜伏期缩短，跨过原平台位置次数
增多(表 1) ，结果表明火绒草能改善 T2DM 大鼠学习
记忆功能。定位航行试验第 4 天，各组大鼠典型游泳
轨迹(图 1)。
表 1 大鼠逃避潜伏期和空间探索通过平台次数(x ± s，n = 10)
组 别
潜伏期(s)
1d 2d 3d 4d
通过平台次数(次)
对照组 67． 85 ± 20． 09 52． 15 ± 11． 71 30． 97 ± 11． 59 22． 62 ± 8． 14 3． 00 ± 0． 67
T2DM组 98． 02 ± 28． 02* 81． 33 ± 14． 81＊＊ 49． 32 ± 10． 03＊＊ 40． 56 ± 9． 89＊＊ 1． 70 ± 0． 82＊＊
火绒草组 64． 15 ± 29． 47△ 59． 50 ± 19． 08△△ 38． 22 ± 10． 65△ 29． 31 ± 4． 03△△ 2． 50 ± 0． 71△
F 值 5． 03 9． 59 7． 34 13． 66 7． 95
P 值 0． 0139 0． 0007 0． 0028 0． 0001 0． 0019
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;与 T2DM组比较，△P ＜ 0． 05，△△P ＜ 0． 01
2． 2 ser396 免疫组织化学结果 海马 CA1，CA3 和
DG区免疫组织化学染色结果显示(图 2) ，对照组神经
元 ser396 呈阴性或弱阳性表达;T2DM 组较对照组阳
性细胞增多，ser396 表达增强，胞浆中可见大量棕黄色
242 Acta Acad Med Weifang Vol． 38 No． 4 2016
阳性表达颗粒;火绒草组较 T2DM 组 ser396 表达明显 减少，胞浆棕黄色表达颗粒减少。
图 1 各组大鼠典型游泳轨迹
图 2 各组海马区神经元 ser396 表达(免疫组织化学染色 × 400)
3 讨论
T2DM和 AD 都是与衰老相关的疾病，在老年人
中都有较高的发病率，越来越多的实验及临床数据表
明 T2DM 可以加速老年人的认知功能障碍，目前
T2DM损伤学习和记忆的机制还不是十分清楚，可能
有高血糖的直接毒性、胰岛素抵抗、胰岛素不足及胰岛
素细胞信号转导异常、炎性作用等。在中枢神经系统，
胰岛素不仅是脑组织糖代谢的重要激素，还通过
PI3K /蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB or AKt)和丝
裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，
MAPK)等信号途径影响 Aβ 的代谢和 tau 蛋白磷酸化
水平，对神经元产生保护作用。胰岛素抵抗和缺乏导
致信号转导通路功能受损，可加重脑组织 Aβ 沉积和
Tau 蛋白过度磷酸化，促进神经元退行性病变，加速
AD的进程［5 ～ 7］，过度磷酸化的 Tau 蛋白是 AD 神经元
纤维缠结的主要成分，具有神经毒性，导致神经细胞骨
架破坏、神经突回缩以及突触连接断裂、神经细胞功能
障碍甚至细胞死亡。实验证明［8，9］，T2DM 的动物血浆
葡萄糖水平及胰岛素水平显著升高，脑脊液胰岛素水
平显著降低，海马组织胰岛素信号传导途径 PI3K /Akt
活性均显著下降，GSK-3β 活性升高，Aβ 沉积和包括
342潍坊医学院学报 2016 年 第 38 卷 第 4 期
ser396 在内的 tau蛋白过度磷酸化显著加重。以上结
果提示 T2DM动物脑组织 AD样病变与大脑胰岛素水
平变化和信号转导功能的异常密切相关。
目前临床采取降血糖、改善胰岛素抵抗及信号转
导等糖尿病治疗方案实验性治疗 AD，并取得一定的
结果［10，11］。我们前期的实验已经观察到火绒草能降
低血糖和减少 T2DM 大鼠海马区神经元 Aβ1-42 的表
达，减轻神经元形态学损伤［4］。本实验观察到火绒草
能减少 T2DM大鼠海马区元神经元 ser396 的表达，改
善 T2DM大鼠学习记忆功能，提示火绒草可通过降低
血糖，减少脑组织 Aβ的沉积和 Tau 蛋白过度磷酸化，
对 T2DM大鼠神经元产生保护作用。
火绒草含有多种有效化学成分，在民间作为药用
植物，有降血糖、抗炎镇痛、利尿、抗氧化等药理作用。
研究发现，火绒草提取物含有苯乙双胍，可能通过抑制
肝脏糖异生，降低肝糖输出以及减少小肠对葡萄糖的
吸收，提高外周组织对胰岛素的敏感性，增加葡萄糖的
摄取和利用，在一定程度上改善胰岛素抵抗，从而起到
降糖降脂的疗效［12，13］。近期的动物实验发现，火绒草
降低 T2DM大鼠腺垂体内神经肽 Y(NPY)及 mＲNA的
表达，改善 NPY高表达所诱发的脂肪堆积和胰岛素抵
抗，同时火绒草下调 leptin蛋白及 mＲNA的表达，进而
减轻 leptin高表达对胰岛素的负反馈作用，减轻 leptin
高表达对 NPY的抑制作用，增加组织对胰岛素的敏感
性，有效减轻胰岛素抵抗［14］。以上结果提示，火绒草
能够通过多途径改善胰岛素抵抗和调节胰岛素信号转
导通路功能，有效降低血糖，减轻 T2DM 大鼠脑组织
Aβ的沉积和 Tau蛋白过度磷酸化。
另外，火绒草提取物，还可以抑制脑内乙酰胆碱酯
酶活性［15］，使胆碱能神经末梢释放的乙酰胆碱不致被
AchE水解，提高脑内 Ach 浓度，使 Ach 作用延长并增
强，经典的神经递质乙酰胆碱，在学习记忆中的作用发
挥着重要作用。吴楠贞等［16］实验证明，火绒草中存在
有黄酮、酚类、生物碱、强心甙等天然抗氧化活性成分，
具有清除机体内自由基，抗脂质氧化，延缓机体衰老，
抗肿瘤等作用，抗氧化途径出现障碍或产生过多自由
基时，就会导致细胞损伤，引起肿瘤、AD 等多种疾病
发生。
目前 T2DM 和 AD 的发病机制仍未完全阐明，但
两种疾病之间存在着密切联系，深入探讨它们的共同
致病机制、相互联系和防治有着重要的意义。火绒草
是天然植物，对机体无毒性，是具有较好研究开发价值
的中草药，有关火绒草保护 T2DM 神经元损伤作用的
相关机制仍需要进行深入探索和进一步研究。
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