全 文 ：香青兰提取物对体外培养乳鼠心肌细胞缺氧 /复氧损伤的保护
作用
赵 　杰 1)■ ,薛文华 1),梁淑红 2)
1)郑州大学第一附属医院药剂科 郑州 450052　2)新疆维吾尔自治区药物研究所 乌鲁木齐 830004
■男 , 1969年 5月生 , 博士 ,副主任药师 ,研究方向:临床药理学 , E-mail:zhaojie@zzu.edu.cn
　　关键词　香青兰;缺氧 /复氧;心肌细胞;乳鼠
　　中图分类号　R284
　　摘要　目的:研究香青兰提取物对心肌细胞缺氧 /复氧(H/R)损伤的保护作用及机制。方法:提取香青兰的有
效成分 , 用原代培养的 SD大鼠乳鼠心肌细胞建立 H/R的损伤模型 , 实验分 6组:正常对照组 、H/R组 、总提取物
组 、氯仿组 、乙酸乙酯组及正丁醇组。采用 MTT法测定细胞的存活率 , 乳酸脱氢酶试剂盒(LDH)测定培养液中
LDH的含量 ,黄嘌呤氧化酶法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活性以及硫代巴比妥酸显色法测定活细胞丙二
醛(MDA)的含量。结果:各组细胞活力 、吸光度值以及 LDH、MDA和 SOD含量间比较 ,差异均有统计学意义(F=
102.312、51.007、24.136、 70.281和 14.335, P<0.05)。与正常对照组比较 , 模型组 LDH、MDA的含量及细胞活力
明显升高 , SOD活性降低(P<0.05);与模型组比较 , 香青兰提取物各组的细胞活力降低 , LDH和 MDA含量增加;
氯仿和乙酸乙酯组的吸光度值升高;氯仿 、乙酸乙酯和正丁醇组的 SOD含量增加(P均 <0.05)。结论:香青兰提取
物对 H/R心肌细胞的损伤具有保护作用 , 此作用可能与抑制脂质过氧化和减少心肌细胞的凋亡有关。
Protectiveefectsofdracocephalummoldavicaextractsonhypoxia/reoxy-
genationinjuryofcardiomyocytesinculturedneonatalrat
ZHAOJie1), XUEWenhua1), LIANGShuhong2)
1)DeparmentofPharmacy, theFirstAfilitedHospital, ZhengzhouUniversity, Zhengzhou450052　2)Me-
dicinalInstituteofXinjiangAutonomousRegion, Urumchi830004
　　Keywords　dracocephalummoldavica;hypoxia/reoxygenation;cardiomyocyte;neonatalrat
　　Abstract　Aim:Toinvestigatetheprotectiveeffectandthemechanismofdracocephalummoldavicaextractsonthe
damageinducedbyhypoxia/reoxygenation(H/R)inculturedneonatalratcardiomyocytes.Methods:Themodelsofhypoxi-
a/reoxygenationweremadewiththefirstgenerationofculturedcardiomyocytes.Theywereallocatedintosixgroups:normal
controlgroup, H/Rgroup(anoxiafor2 hours, reoxygenationfor30 min), coreopsistotalextractgroup, coreopsischloro-
formextractgroup, coreopsisethylacetateextractgroup, andcoreopsisn-butanolextractgroup.Theviabilitiesofcardiomyo-
cyteswereenvalutedbyMTT.TheactivityofLDHwasenvalutedbyBeckmanCX5 promachine.ThecontentofMDAand
activityofSODincelswereenvalutedbyMDAandSODkit.Results:Theviabilitiesofcardiomyocytes, absorbancevalue,
LDH, MDA, andSODwereobviousdifferentamongthe6 groups(F=102.312, 51.007, 24.136, 70.281, 14.335, P<
0.05).Comparedwithnormalcontrolgroups, thecontentofLDH, MDAandthecellviabilityinmodolgroupwereincreased
apparenthy(P<0.05)andMDAdecreasedapparently(P<0.05).Comparedwithmodelgroup, thecelviabilitydecreased
apparentlyindracocephalummoldavicaexeractsgroups, theLDHandMDAindeasedapparently, theabsorbancevaluein-
creasedincoreopsischloroformextrctgroupandcoreopsisethylacetateextractgroup.TheSODincreasedapparenthyincore-
opsischloroformextractegroup, coreopsisethylacetateextractgroupandcoreopsisn-butanolextractgroup.Conclusion:
Dracocephalummoldavicaextractshavetheprotectiveefectonhypoxia/reoxygenerationinjureofcardiacmyocyteincul-
turedneonatalrat.Themechanismmaybeinrelationtotherestraintofsurchargeofcalciumandreductionofapoptosis.
　　唇形科植物中的香青兰分布于我国东北 、西北
及华北等地区 ,特别是新疆 ,资源丰富 。香青兰药用
全草为地上干燥部分 ,气清香 ,叶微辛。香青兰在民
间用于治疗冠心病及血液质旺盛(高血压)、寒性神
·485·JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences)　May　2010　Vol.45　No.3DOI :10.13705/j.issn.1671-6825.2010.03.014
经性头痛等疾病 ,疗效确切 。冠心病是常见病和多
发病 ,心绞痛为本病的主要症状之一 。研究 [ 1]发
现 ,香青兰二级温热 ,有很强的香味 ,具有补益心脑 、
活血化淤 、通路开窍及止痛解毒之功效 ,全方位针对
治疗冠心病和心绞痛的综合症状 ,确实能改善心肌
缺血的状况 。为了进一步开发利用香青兰 ,作者分
别对香青兰进行了系统分层溶剂萃取 ,分别得到总
提取物层 、氯仿层 、乙酸乙酯层和正丁醇层 ,然后用
体外培养的乳鼠心肌细胞制备缺氧 /复氧(hypoxia/
reoxygenation, H/R)损伤模型 ,观察香青兰不同提取
部位对心肌细胞损伤的影响并探讨其可能的机制。
1　材料与方法
1.1　仪器和试剂　香青兰由新疆民族药研究所提
供;NaCl与 KCl(天津市福晨 化学试剂厂 )、
KH2PO4、Na2HPO4、NaHCO3 、NaH2PO4 、MgSO4 、CaCl2
和 NaHCO3(天津市化学试剂三厂);EDTA、二甲基
亚砜 、MTT、DMEM培养粉(高糖 、低糖)和胰蛋白酶
(美国 Amresco公司);胎牛血清 、链霉素(华北制药股
份有限公司);注射用氨苄西林钠(中诺药业有限公
司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸
脱氢酶(LDH)试剂盒(美国 Gibco公司)。超声细胞
破碎仪(上海新芝生物技术研究所与宁海新芝科研所
生产),酶联免疫检测仪(美国 Coulter公司生产)。
1.2　香青兰有效成分的提取　香青兰全草 500 g,
粉碎 ,分别用体积分数为 95%的乙醇回流提取 2次
和体积分数 50%的乙醇回流提取 1次 ,料液体积比
1:10,每次 2h,合并 3次的提取液 ,减压浓缩回收溶
剂得浸膏 150 g。再对浸膏进行分层萃取 ,具体流程
参考文献 [ 2] 。
1.3　乳鼠心肌细胞原代培养[ 3] 　取出生 1 ～ 3 d的
SD大鼠乳鼠(雌雄不限 ,由河南省实验动物中心提
供)。无菌条件下取出心脏后用冷 PBS溶液洗净心
脏内残血 ,将心肌剪碎成 1 mm3左右的小块 ,用培
养基冲洗 2 ～ 3次后 ,置组织于 2.5 g/L胰蛋白酶中
37 ℃分次消化 ,每次 10 min,收集上清液并用冷的
体积分数 10%的胎牛血清终止消化 ,反复吹打使细
胞游离。消化液移入消毒的刻度离心管中 ,
1 000 r/min离心 10 min,收集心肌细胞 ,用含体积分
数 10%胎牛血清的 DMEM悬浮 ,在 37 ℃体积分数
5% CO2孵箱中培养 90min。以差速贴壁法去除已
贴壁的成纤维细胞和其他杂质 ,将细胞悬液接种于
培养瓶中 ,在 37℃体积分数 5%的 CO2条件下密闭
培养 , 24h后更换全部的培养液 ,以后每 2 ～ 3 d更
换培养液 1次 ,于试验前 1d换成无血清的培养基 ,
待细胞处于对数生长期的时候开始实验 。
1.4　H/R损伤模型的建立 [ 4] 　不含胎牛血清的低
糖 DMEM培养液用体积分数 99.9%氮气饱和 30
min后 ,置换培养瓶中的正常含体积分数 10%胎牛
血清的 DMEM培养液 ,再向瓶内充氮气(1 L/min)
90 s,以驱除瓶内氧气 。然后塞紧瓶塞 ,密闭培养 2
h后 ,换用经体积分数 5% CO2饱和的含体积分数
10%胎牛血清正常含糖 DMEM培养液 ,在正常培养
条件下培养 30 min,建立 H/R模型 。
1.5　实验分组　将培养的细胞于加药前 1 d移入
96孔板 ,并分为 6组(每组 10孔)。 ①正常对照组
含体积分数 10%的胎牛血清 DMEM培养液培养 4
h。 ②模型组:缺氧 2 h,复氧 30 min。③总提取物
组。 ④氯仿组 。⑤乙酸乙酯组。 ⑥正丁醇组 。各提
取物组均在 H/R后 1h后加入相应提取物 ,然后置
于 37 ℃,体积分数 5% CO2培养箱中 24h。
1.6　观测指标
1.6.1　细胞的存活情况　心肌细胞悬浮液以 2 ×
10
6 mL-1的密度接种于 96孔板 ,用含体积分数 10%
的胎牛血清培养 24 h后 ,用缓冲液冲洗 2遍 ,后加
入培养基和香青兰的不同提取物 ,从单纯培养液作
对照 ,在 37 ℃体积分数 5%的 CO2培养箱中密闭培
养 24 h后 ,每孔加 20μL的 MTT, 37 ℃孵育 4 h,吸
去上清液 ,每孔加二甲基亚砜 100 μL,振荡数分钟
使其充分混匀 ,在酶联检测仪上于 570nm处测定吸
光度(A)值 。
1.6.2　细胞活力　取少量心肌细胞悬液以 0.4%的
台盼蓝染料染色 ,着色细胞为死细胞 ,而活细胞拒染 ,
在倒置显微镜下 ,用血球计数板分别计活细胞的数目
和死细胞数 。根据下式求细胞活力:细胞活力 =活细
胞总数 /(活细胞总数 +死细胞总数)×100%。
1.6.3　LDH活性　收集各组培养基 ,严格按照试
剂盒说明书测定 LDH释放量 。
1.6.4　细胞内 MDA和 SOD含量测定　MDA的测
定采用硫代巴比妥酸显色法 , SOD的测定采用黄嘌
呤氧化酶法 ,操作严格执行试剂盒说明书步骤。
1.7　统计学处理　采用 SPSS10.0进行分析 ,各组
所有数据经正态性检验方差齐性检验;然后采用单
因素方差分析及 LSD-t检验 ,检验水准 α=0.05。
2　结果
2.1　香青兰提取物对 H/R损伤的心肌细胞活力的
影响　各组细胞活力和吸光度值均服从正态分布且
总体方差齐 , 因此采用单因素方差分析 , 结果见
表 1。
·486· 郑州大学学报(医学版)　2010年 5月　第 45卷　第 3期
表 1　香青兰提取物对 H/R损伤心肌细胞活力的影响
组别 n 细胞活力 /% A值
正常对照组 10 94.13±1.22 0.29±0.03
模型组 10 57.70±3.91＊ 0.18±0.04＊
总提取物组 10 63.82±2.99# 0.15±0.03
氯仿组 10 79.91±4.00# 0.26±0.04#
乙酸乙酯组 10 81.27±3.81# 0.27±0.05#
正丁醇组 10 62.03±5.22# 0.18±0.07
F 102.312 51.007
P <0.001 <0.001
＊与正常对照组比较 , P<0.05;#与模型组比较 , P<0.05。
2.2　香青兰提取物对 H/R损伤心肌细胞 LDH、
MDA和 SOD活性的影响 　各组 LDH、MDA和
SOD数据均服从正态分布且总体方差齐 ,因均采用
单因素方差分析 ,结果见表 2。
表 2　香青兰提取物对 H/R
损伤心肌细胞 LDH、MDA和 SOD指标活性的影响
组别 n LDH/(μmol· g-1)
MDA/
(μmol· g-1)
SOD/
(kU· g-1)
正常对照组 10 20.83±4.37 1.43±0.35 35.04 ±2.44
模型组 10 37.42±4.68＊ 4.25±0.61＊ 29.76 ±1.37＊
总提取物组 10 33.17±3.18# 2.86±0.54# 32.30 ±1.15
氯仿组 10 25.30±3.00# 2.50±0.44# 33.99 ±1.48#
乙酸乙酯组 10 22.00±1.98# 2.59±0.52# 34.23 ±1.25#
正丁醇组 10 30.92±2.18# 2.65±0.49# 32.41 ±1.08#
F 24.136 70.281 14.335
P <0.001 <0.001 0.004
＊与正常对照组比较 , P<0.05;#与模型组比较 , P<0.05。
3　讨论
在细胞水平上 ,常以乳鼠心肌细胞缺氧 /复氧损
伤模型模拟在体心肌缺血 /再灌注损伤。作者在大
鼠乳鼠心肌细胞原代培养的基础上 ,构建了心肌细
胞 H/R损伤的模型 ,心肌细胞缺氧 2 h,后复氧 30
min后 ,搏动减弱甚至停止 ,脂质过氧化反应增强 ,
心肌细胞这些结构和功能的改变与心脏缺血 /再灌
注损伤几乎一致 ,可以较为真实的模拟缺血 /再灌注
损伤的病理生理过程 [ 5] 。
SOD是重要的抗氧化酶 ,其活性的高低反映心
肌细胞抗氧化损伤的能力 , MDA则是生物膜脂质过
氧化反应的产物 ,其含量的变化反应生物膜是否遭
到过氧化损伤。缺氧时心肌细胞膜损伤 ,细胞膜的
完整性遭到破坏 ,导致膜流动性下降 ,通透性增加 ,
心肌细胞 LDH将大量外漏 。因此 ,测定细胞内 SOD
活性 、MDA含量和培养液 LDH的释放量可以反映
细胞的受损程度。
作者的结果显示:缺氧 /复氧模型组与正常组比
较 , SOD活性下降 , MDA含量 、LDH活性明显增加 ,
提示造模成功;香青兰不同提取物给药组与 H/R模
型组比较 , SOD活性升高 , MDA含量 、LDH活性降
低 ,说明香青兰提取物具有抑制 H/R所引起的脂质
过氧化反应 ,保护心肌细胞膜结构完整性的作用。
氯仿组和乙酸乙酯组 SOD活性升高 , MDA含量 、
LDH活性降低 ,其他组之间相比较而言差异显著 ,
总提取物组与正丁醇组对此没有明显的作用。此
外 ,该研究香青兰氯仿组和乙酸乙酯组可显著提高
细胞的存活率 ,减轻 H/R所致的细胞损伤 ,提示这
2个萃取部位含有某种化学物质能够减轻 H/R对
组织的损伤 。有研究[ 6]报道称氯仿萃取部位和乙
酸乙酯萃取部位含有大量的黄酮类物质 ,黄酮类物
质具有降血脂等治疗心脑血管疾病的作用。以上说
明香青兰氯仿组和乙酸乙酯组可能是通过黄酮类物
质降低 H/R对组织的损伤。 MTT进入活细胞 ,被氧
化后形成蓝色的结晶物 , MTT法的 A值即反应心肌
细胞的存活情况 ,又反应心肌细胞内线粒体脱氢酶
的活性。该实验中 , H/R损伤模型组的心肌细胞的
A值明显下降 ,而预先加入香青兰提取物后 , MTT结
晶量明显增加 ,也提示香青兰提取物对心肌细胞具
有保护作用。
综上所述:香青兰的不同提取部位可以对抗 H/
R所引起的脂质过氧化损伤 ,从而保护心肌细胞 ,尤
其以氯仿提取部位和乙酸乙酯提取部位的作用最强。
参考文献
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(2009-10-21收稿　责任编辑李沛寰)
·487·JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences)　May　2010　Vol.45　No.3