全 文 ：福建农业学报 19 ( 3) : 149一 5 1 1, 2 0 0 4
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, ic u lt u ar l S
c ie n e e s 文章编号 : 1 0 0 8一 0 3 8 4 ( 2 0 0 4 ) 0 3一 0 1 4 9一 0 3
侵染大丽花的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定
明艳林
(厦门华侨亚热带植物引种园国家植物引种隔离检疫基地 , 福建 厦门 3 61 0 0 2)
摘 要 :根据病毒生物学特性 、 粒体形态和血清学性质 ,初步鉴定在厦门地区种植的大丽花上表现花叶症状的病株
上分离的 1个病毒分离物属于黄瓜花叶病毒 . 在供试的 n 科 39 种 (或品种 )植物中 ,该分离物通过摩擦接种能侵染
其中的 9 科 35 种 (或品种 ) ;失活温度为 50 ~ 5 ℃ ,稀释终点为 10 一 3 ~ 10 一 ` ,体外存活期为 24 一 28 h ;病毒粒体球
状 ,直径约 28 ~ 30 n m 。 经间接 E IL s A 测定 ,该分离物与烟草花叶病毒 、南瓜花叶病毒 、烟草环斑病毒 、 番茄不孕病
毒 、 西番莲木质病毒的抗血清均无反应 。 与黄瓜花叶病毒抗血清具有强阳性反应 ,鉴定该病毒是黄瓜花叶病毒 。
关键词 : 大丽花 ; 黄瓜花叶病毒 ; 鉴定
中图分类号 : 5 682 . 2 6 1 ; 5 4 3 2 . 4 1 文献标识码 : A
I d e n t i f i e a t i o n o f e u e u m b e r m o s a i e v i r u s i s o l a t e f r o m D a h l ia P i n n a t a
M IN G Y
a n 一 li n
(X i a m e n vO
e sr e a s C h i n e s e S u b t r OP i c a l P la n t I n t r o d cu t `o n G a dr e n , N a t i o 摊 a l P la n t nI tor d “ e r i o n
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a 切 e n , F幼 a n 3 6 1 0 0 2 , C 九i n a )
A b s tr a e t
:
O n e v i r u s is o la t e d fr o m aD h it
a P i n n a r a C a v
.
g r o w n i n X ia m e n a r e a w a s id e n t i fi e d a s a n is o la t e o f
C“ c u 脚 b e r m o s a i c c u e u 阴 o u i ur s b a s e d o n i t s b i o l o g i e a l e h a r a e t e r i s t i e , p a r t ie l e mo
r p h o lo g y a n d s e r o lo g y o f t h e v i r u s
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s o l a t e
.
T h e v ir u s i s o la t e e o u ld i n fe e t 35 s P e e ie s ( o r v a r i e t i e s ) o f 9 f a m i li e s f r o m 3 9 s P e e i e s ( o r v a r ie t ie s ) o f 1 1
t e s t e d f a m il ie s
.
T h e th e r m a l i n a e t i v a t io n p o in t f o r t h e v ir u s is o la t e w a s 5 0 一 5 5℃ , t h e d i lu t io n e n d p o i n t w a s 1 0一 3
一 1 0一 4 , a n d th e l o n g e v it y w a s 2 4一 4 8 h . T h e e l e e t r o n m ie r o s e o p i e e x a m in a t io n s h o w e d t h e p u r if ie d v ir u s p a r t ie le
p r e p a r a t i
o n s w a s i
s o m e t r ie p a r t ie l e s o f a b o u t 2 8一 3 0 n m i n d i a m e t e r . T h e v ir u s i s o la t e h a d s t r o n g p o s i t iv e r e a e t io n
t o m o n o e lo n a l a n t i b o d i e s o f C M V b y
e n z y m e
一
l in k e d im m u n o s o r h b e n t a s s a y
, a n d n o r e a e t i o n t o m o n o e l o n a l
a n t i b o d ie s o f T M V
,
S q M V
,
T R S V
,
T A V
,
P FWV
.
K e y w o r d s :
aD
h li a P i n n a t a C a v
.
; C u e u m b e r m o s a i e v ir u s ( CM V ) ; I d
e n t i f ie a t io n
大丽花 ( aD 人zi a P i n n a t a C a v
.
)
, 又称天竺牡丹 ,
属菊科 ,大丽花属 , 多年生草本植物 , 具粗大纺锤状
肉质块根 ,并能入药 。大丽花可种植于花坛或庭前丛
栽 ,矮生品种亦可盆栽用作室 内装饰及会场布置 。 大
丽花花叶病是大丽花中为害最为严重的一种病毒性
病害 , 主要症状表现为花叶 、 叶子畸形 、 植株黄化矮
小 ,我国广东 、广西 、 内蒙古等省 (自治区 )及银川 、南
京 、沈阳和上海等市均有发生 l[, 2〕。迄今 ,报道能引起
大丽 花花叶病的病原 主 要有大丽花花 叶病毒
( D M V )和黄瓜花叶病毒大丽菊株系 ( CM V 一D : ) 。 除
此之外 , 亦有烟草花叶病毒 ( T M V )和番茄斑萎病毒
( T SW V )侵染大丽花形成花叶的报道 .s[ 们 。 有时由于
蚜虫 、 叶蝉 、 蓟马或蜡类等昆虫的刺激 , 也会使大丽
花产生花叶或畸形等症状 , 但这种症状与病毒症状
不同 , 它不能随大丽花块根传播到下一年 。
近年来 , 厦门地区种植的大丽花严重发生花叶
病 , 田间病株严重矮化 , 叶片上有明显的花叶症状 ,
严重时叶片发育受阻 , 呈畸形 , 花朵小 , 色不鲜 , 产
量质量都受到影响 。 本文报道该病毒分离物的分离
鉴定结果 。
1 材料与方法
1
.
1 毒源及其纯化 毒源从厦门华侨亚热带植物
引种园种植的大丽花病株上分离得到 。 该病株严重
矮化 , 叶片上有明显的花叶症状 , 部分病叶呈畸形 。
病毒经觅色黎 (以 e n 吵。己i u m 。 m a ar n t i c o lo r ) 3次单
斑 分 离 纯 化 后 , 繁 殖 在 心 叶 烟 ( N i c o t i a n a
g lu t’ n os a) 上 , 置于隔离检疫温室内 .
收稿日期 : 2 0 0 3一 0 3一 0 2
作者简介 : 明艳林 ( 1 9 7 4一 ) , 男 , 硕士 , 从事植物病毒学研究 .
1 50 福建农业 学报 第 91卷
1
.
2寄主范围测定 感病心叶烟叶片 , 按 1 / 1。~
1 / 2 0 (W / V ) 比例 , 加入 0 . 0 2 5 m o l · L 一 , P B ( 0 . 0 2
m o l
·
L 一 , N a D IE C A 、 p H 7
.
2 ) 研磨 , 汁液摩擦接种
n 科 39 种 (或品种 ) 植物 , 置于隔离检疫温室内
(温度为 20 ~ 26 ℃ ) , 观察记载症状表现 。 每种供试
植物接种 3 ~ 5 株 , 重复 3次 , 每次观察 1 个月 , 不
表现症状的回接觅色黎 , 验证是否属于隐症感染 。
1
.
3 理化性质测定 按常规方法测定病毒钝化温
度 、 稀释终点 、 体外成活期 。 毒源材料为心叶烟显
症叶片 , 测定寄主植物为觅色黎 , 重复 3次 。
.1 4 电镜观察 用接种两周的普通烟叶作为病毒
的粗提纯材料 , 采用 0 . 5 m ol · L 一 `柠檬酸缓冲液
(含 5 m m o l · L 一 ` N a ZE D T A 、 0 . 5%琉基乙醇 、 p H
6
.
5 ) 氯仿抽提 , 用 P E G (M W 6 0 0 0 ) 沉淀与 2 0 %蔗
糖垫离心 ( H i t a e h i P 4 z A r o t o r 、 4 2 o o o r · m i n 一` ) 相
结合提纯程序来制备病毒部分提纯液 , 作为电镜观
察材料 。 沾取病毒悬浮的铜网经 2%醋酸铀染色后 ,
EJ M
一
10 0 C X I 型透射电镜观察病毒粒体形态 。
1
,
5 血清学性质测定 黄瓜花叶病毒 (C M V )抗血
清由本室徐平东博士制备 ,烟草花叶病毒 ( T M V )抗
血清由福建农林大学植物病毒研究所惠赠 , 南瓜花
叶病毒 ( S q M V ) 、 烟草环斑病毒 ( T R S V ) 、 番茄不
孕病毒 ( T A V ) 、 西番莲木质病毒 (P FW V ) 抗血清
均由台湾中兴大学叶锡东教授惠赠 。 D A S 一 E IL S A
测定参照 P O R T A 等方法进行 s[] 。 抗血清均以 1 :
1 0 0 0包板 ;单克隆抗体稀释 1 0 0 倍 ;辣根过氧化
标记 羊抗鼠为 iS g m a 产 品 , 稀释 1 0 0 倍 。 D G -
3 0 2 2 A 型酶联免疫检测仪 (波长 4 50 n m )检测 。
表 1 分离物的寄主范围及症状反应
aT b l e 1 Th
e h o s t Pl a n ts a n d s ys t e m ie s y m P t o m
供试植物 局部症状 整株症状
觅色蔡 (以 e二妙 iod u m a m a ar n t ic l o ; )
昆诺黎 ( e . 奋u i n o a )
灰黎 ( C . a如 m )
墙黎 ( C . m o ar de )
甜菜 ( D e t a u u l卯八: )
紫果西番莲 ( P as sifl o r a ed ul is )
黄果西番莲 (p . e d u l is v a r 7j a u i c a学 a )
杂文种西番莲 (尸 . 。血 l :` 只 尸 . 。 d “ z` : v a r .
刀“ “ caz rP a )
龙珠果 ( P . fo e t i己a )
毛西番莲 (尸 . m 口“ 汇“ 滋m a)
转心莲 ( P . c a e、 le a )
心叶烟 (从 c ot a n a gl u t i n o s a )
普通烟 ( N . t a b a c。二 )
C V
.
H a v a n a 3 8
C V
.
S a m s u m
一
N N
C V
.
T u r k i s h
C V
.
W h i t e Bu r le y
C V
.
X a n t h i
一
N C
C V
. 黄苗榆
C V
. 亮黄烟
本氏烟 ( N . b e o t h a , i a 。 。 ) 、
德氏烟 ( N . de bn 州 i)
克氏烟 (N . cle v el 朋 id i)
黄花烟 ( N . 、 s` ic a )
假酸浆 (站 ca n d r a 户勺as ol ids )
蔓陀罗 ( aD t u。 : tar m on i u m )
番茄 (勿 c妙 e sr ic o n o e o。 , 。 s e 二 ze o r二二 )
C V M o m o r
洋酸浆 (尸人夕 J口 ils 扬 ir da an )
矮牵牛 ( P e t u n ia h夕b犷 i d a )
龙葵 ( S o l a n u二 , . g r “ m )
豌豆 ( P i ` 。二 : a t i。 “ 二 )
C V
.
G r e e
一
fo a s t
肛豆 ( V i g ” a u , g “ i cu za t e )
C V
.
B la e k e y e
C V
. 黑种二尺
C V
. 长泰肛豆
大豆 ( G lyC in e v o z g a ` s )
C V
. 诱变 33
菜豆 ( P h a s e olu : 。以 g a isr )
C V
.
a j u n t if ul
绿豆 ( V `g ” a ar ` ia t a )
望江南 ( aC s `a 。 icC de n t a lis )
黄瓜 (uC e u , i: : a t i v u s )
CV
. 长青黄瓜
C V
. 二青黄瓜
N L L
N L L
N L L
N L L
一 M
一 T N
一 T N , Y , M , M a l
T N
,
M
,
M
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丁N
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C L L
C L L
T N
,
M
T N
,
M
C L L
C L L
M
M
M
M
M
M
M
T N
,
S
,
D
M
M
M
,
D
M
,
M a l
M
2 结果与分析
2
.
1 病毒的寄主范围 摩擦接种 n 科 39 种 (或品
种 ) 植物 , 分离物能侵染西番莲科 、 黎科 、 茄科 、 豆
科 、 葫芦科 、 觅科 、 番杏科等 9科的 35 种 (或品
种 ) (表 1 ) 。
2
.
2 病毒理化性质 分离物的病毒钝化温度为 50
~ 5 5℃ , 稀释终点为 1 0 一 3~ 1。一 4 , 体外成活期为 24
~ 4 8 h
。
2
.
3 电镜下病毒粒体 提纯病毒在 JEM 一 1 0 o C X I
型透射电镜下观察 , 粒体球状 , 直径约 28 ~ 30 n m 。
2
.
4 病毒的血清学性质 经 D A S 一 E L is A 测定 , 该
分离物与 T M V 、 s qM v 、 T R s v 、 T A v 、 P F w v 等
5 种病毒抗血清均无反应 ; 与 CM V 抗血清具有强
阳性反应 (表 2 ) 。
L N N
,
S
M
M
M
N LL
N L L
N L L
C L L
C L L
M
M
.
D
第 3 期 明艳林 :佼染大 丽花的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定 15 1
(续表 1)
供试植物 局部症状 整株症状
西葫芦 (八c u 站 i t a P eP o ) C L L M , s , o
笋瓜 ( C材` 二 r 玩细 二 a~
a ) 一 M , S , D
丝瓜 ( L “力电价i o d r i c a ) C L L D
大白菜 ( B ar s i c a e a呻 e s t r is s s p . p e乏i , e n s i s )
C v
. 夏洋白菜 _ _
千日红 ( oG mP h er n a g lob o a ) N L L M , M a l
葛登 ( aL c t u ca : a t i o a ) 一 M , M a l
百 日菊 ( Z i n 二 i a e l e邵 n s ) 一 M
番杏 ( eT tar go n必 “ 户a n sa ) C L L 一
长春花 ( C a t h a o n t h u : or s e u s ) 一 M
罗勒 ( O c i , “ , ab s i l i c u . ) 一 M , M a l , D
老枪谷 ( A m a ar n t h u : 。 a u d a t u s ) 一 一
大椒 ( c a P Jicu 二 a 二二二二 ) 一 M , M a l
注 : C L L 示局部褪绿斑 . D 示全株死亡 , L N N 示叶片变窄 , M 示
花叶 , M al 示晴形 , N L L 示局部坏死斑 , S 示矮化 , T N 示顶枯 (死
顶 ) , Y 示黄化 , 一示不侵染 。
图 1 电镜下病毒粒体 ( x 14 0 0 0 )
F i g
.
1 V i r亩o n s o f P u r i f ie d v i r us “ n d e r e l e c 止or n
m i e r os c 0 P e ( X 14 0 0 0 )
表 2 分离物 D A S 一E L I S A 测定结果 (O D ; s。 )
T曲l e 2 D A S一E L I SA d e t e e t i o n r e s u l t o f t h e v i r us i s o lat e
抗 原 C M V T M V S qM v T R S V T A V P FW V
感染病毒的烟草叶片 0 . 8 5 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 00 0 . 0 1
感染病毒的黄瓜叶片 1 . 2 1 0 . 0 0 0 . 0 2 0 . 0 0 0 , 0 1 0 . 0 1
健康烟草叶片 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 . 0 0 0 , 00 0 · 0 2
P B S 级冲液 0 . 0 0 0 . 0 1 0 . 0 1 0 . 0 0 0 · 00 0 · 0 0
注 : ①抗原为感病各叶片按 1 : 10 (w /V ) 研磨。 ② 5 种病毒抗血
清作一扰时均稀释 1 0 0 倍 ,作二抗时稀释 1 0 0 倍 ;抗原稀释 1 0
倍 (稀释液为 P咫 , 含 0 . 0 5% T w e e n 一 2 0 、 2% p v p 、 p H 7· 4 ) 。
3 结论与讨论
根据病毒生物学特性 、 粒体形态 、 血清学性质 ,
该病毒为 C M V 的一个分离物 。
大丽花病毒病主要有花叶型 、 矮缩型 、 环斑型
3 种 。 迄今 , 报道能引起大丽花花叶病的病原主要
有 D M V 和 CM V 一 D : 。 其中 , D M V 可以通过汁液及
嫁接传染 , 叶蝉及多种蚜虫也能传毒 。 一般情况下 ,
D M V 难以用汁液在大丽花上接种成功 , 该病毒粒
体为球状 , 正 20 面体 , 直径为 50 n m , 致死温度 75
~ 80 ℃ , 体外保毒期为室温下 4 d 。 D M V 在 自然种
植情况下 , 只为害大丽花 ; 通过人工接种 D M V 还能
侵染其它如茄科 、 葵科和觅科等植物 3[, `〕 。 c M v 一 D Z
寄主范围较窄 , 经人工测定的 34 种植物中 , 其仅能
侵染 4 科 15 种 , 局部侵染芜色黎 、 昆诺黎 、 甜菜 、
蚕豆等 , 系统侵染黄瓜 、 心叶烟 、 白烟和矮牵牛等 。
其钝化温度 70 ℃以上 , 稀释终点 1 0一 ` ~ 10 一 “ , 体外
存活期 Z d , 病毒粒体球形 , 大小 27 n m [’] 。 根据本
试验结果 , 该分离物在寄主范围内及理化性质上与
CM V
一
D : 及 D M V 分离物存在 比较大的差异 。 用
CM V 多克隆抗体进行的测定结果表明 , 该分离物
与 CM V 具有强 阳性反应 , 而与 T M V 、 S qM v 、
T R SV
、
T A V 和 P FW V 等 5 种多抗无阳性反应 。 根
据上述结果 , 该分离物可能是不同于黄瓜花叶病毒
大丽菊株系的一种新的 CM V 病毒分离物 , 推测侵
染大丽花的 C M V 分离物可能有亚组 工和亚组 l 之
分 。
参考文献 :
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V i r o l
,
1 9 8 9
,
1 0 4
:
2 7 1一 2 85 .