全 文 :第 33卷第 3期
2006年 5月
浙 江 大 学 学 报(理学版)
Journal of Zhej iang University(Science Edition)
http:/ /www. journals. zju. edu. cn /sci Vol. 33 No . 3M ay 2006
收稿日期:2005-03-07.
基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(399203).
作者简介:李钧敏(1973 -),女 ,副教授 ,硕士 ,主要从事分子生态学研究.
*通讯作者:金则新 , Em ail:j zx@t zc. edu. cn.
七子花林下土壤细菌数量及 DNA含量
与环境因子的相关性
李钧敏 , 金则新*
(台州学院 生态研究所 , 浙江 临海 317000)
摘 要:利用吖啶橙荧光染色法检测不同海拔高度七子花林下土壤细菌的数量 ,利用 CTAB-溶菌酶-蛋白酶 K 法抽
提土壤细菌 DNA ,分析两者之间及与土壤环境因子之间的相关性. 不同海拔高度七子花林下土壤细菌数量及土壤
细菌 DNA 的数量均有很大差异 ,两者之间呈显著性正相关. 1μg 土壤细菌 DNA 相当于 2×108 个土壤细菌.土壤
细菌数量受含水量 、有机质和海拔的影响 , 土壤细菌 DNA 含量主要受土壤细菌数量 、海拔 、有机质及含水量的影
响 ,环境因子主要通过影响土壤细菌数量而间接影响土壤细菌 DNA 的含量.
关 键 词:土壤细菌;数量;DNA 含量;环境因子
中图分类号:X171 文献标识码:A 文章编号:1008 - 9497(2006)03 - 333 - 05
LI Jun-min , JIN Ze-xin(Ecology Institute of Taizhou University , L inhai 317000 , China)
Correlation of the soil bacteria count and DNA content and their relationship with environmental factors under Heptaco-
dium miconioides forest. Journal o f Zhejiang Univ ersity(Science Edition), 2006 , 33(3):333 ~ 337
Abstract:Using acridine orange direc t counts(AODC) method , the count of so il bacteria under Hep tacodium mico-
nioides fo rest with differ ent altitude w as determined. The soil bac te rial DNA w as ex tr ac ted by using CTAB-ly so-
zyme-pro tease K method and the content w as determined. The co rrelation between them and their r elationship with
the environmental facto rs was analy zed. The soil bacterial DNA content and the soil bacteria count unde r H. mico-
nioides fo rest with diffe rent altitude w ere different and significantly positiv e co rr elation w as detected between them.
1μg soil bacterial DNA co rr esponded to 2×108 bacteria. The bacteria count w as influenced by w ater content , o rgan-
ic ma tte r and altitude , w hile the bacterial DNA content wa s influenced by soil bacteria count , altitude , o rg anic mat-
te r and w ater content. Environmental factor s directly influence the so il bacteria count , and then indir ectly influence
the soil bacterial DNA content thr ough the soil bacteria count.
Key words:soil bacteria;count;DNA content;env ir onmental factor
土壤中含有许多微生物 ,包括细菌 、真菌 、放线
菌与原生动物等 ,其中细菌是土壤微生物的主要类
群 ,个体小 ,数量多 ,繁殖快 ,在物质循环 、能量流动
和生物地化循环中起着重要作用.国内多采用平板
稀释法来测定土壤中细菌的数量 ,但大多数的细菌
(99. 5%~ 99. 9%)在传统培养基中不可生长 ,不可
被检测.大量微生物的不可培养性是传统微生物生
态学在揭示自然界微生物群落结构 、生态功能及其
相互关系研究中的最大障碍. 近些年来 ,国内外先后
应用吖啶橙荧光染色法(Acridine O range Direct
Counts , AODC)对饮用水中的细菌总数及活菌数
进行快速 、直接的镜检计数 ,取得良好的效果 ,具有
广泛的应用前景[ 1 , 2] .
七子花(Heptacodium miconioides)为我国特
有的落叶小乔木 ,属忍冬科(Caprifoliaceae)的单种
属植物 ,现资源很少 ,已列为国家 2级重点保护植
物.在浙江省天台山分布着一小片十分罕见的以七
子花为优势种的群落[ 3 , 4] . 目前有学者对七子花林
下的土壤微生物进行了一些研究[ 5 ~ 7] ,但多限于传
统的平板稀释法 ,致使细菌计数结果偏低.为了进一
步了解土壤微生物在七子花群落物质循环和能量流
动中的作用 ,本研究利用 AODC 法对 3个不同海拔
高度七子花林下土壤总细菌的数量进行检测 ,并利
用CTAB-溶菌酶-蛋白酶 K 法提取土壤细菌 DNA ,
进一步分析土壤细菌 DNA 含量 、细菌数量与土壤
环境因子的相关性 ,为全面了解七子花林生态系统
的结构和功能提供基础资料. 土壤微生物的活动可
以间接影响生态系统的功能 ,开展七子花林下土壤
微生物的研究可以为深入探讨七子花的濒危机理提
供理论依据.
1 材料与方法
1. 1 供试土壤
样地位于浙江天台山主峰华顶山北侧狮子岩
坑 ,地理位置 29°15′N ,121°06′E. 在七子花群落中 ,
按不同海拔高度设置 3 个样地 ,有关该群落的自然
概况已有较多的报道[ 3 , 4] ,这里不再重复.于 2001年
6月 15日采集七子花林下表层 0 ~ 10 cm 土壤 ,每
个样地各取 3个重复. 将土壤分别装入聚乙烯塑料
袋 ,带回实验室进行分析 ,采集的土壤样品放置时间
不宜超过 24 h. 用环刀和铝盒同时取土 ,用于土壤
含水量的测定. 土壤理化背景值按常规的土壤化学
分析方法进行测定[ 8 , 9] ,见表 1.
表 1 不同海拔高度七子花林下土壤的环境因子
Table 1 The environmental conditions o f three soils unde r
Hep tacodium miconioi des fo rest with diffe rent a ltitude
环境条件
env ir onmental conditions
样地 Plot
P1 P2 P3
海拔高度 altitude(m) 990 780 500
坡向 a spect NW30°NE15°NW20°
坡度 slope 30° 25° 35°
pH 值 pH value 5. 02 5. 18 5. 13
含水量 w ater content(%) 26 28 24
总氮 to tal nitrog en(mg kg - 1) 5. 38 5. 66 4. 88
总磷 to tal phospho rus(mg kg - 1) 0. 519 0. 256 0. 398
有机质 o rg anic ma tte r(mg kg - 1) 46. 57 48. 34 41. 23
植被类型 vegetation form 落叶阔叶林 deciduous
broadleaved fo rest
优势种 dominant species 七子花 Heptacodium
miconioides
1. 2 土壤细菌的收集
取土壤 0. 75 g ,以 2%偏磷酸钠(pH8. 5)为溶
液 ,采用差速离心法收集土壤细菌[ 10] ,重复差速离
心 3次 ,获得略带黄色的沉淀.
1. 3 土壤细菌计数
取上述细菌沉淀溶于 1. 5 mL 2%偏磷酸钠
(pH8. 5)中 ,混匀 ,再取 50 μL 转入 1 mL 0. 05%琼
脂中 ,混匀 ,取 10μL 涂布于载玻片上(预先绘 1 cm2
的方格 ,重复 6个),滴加 0. 1%吖啶橙溶液数滴 ,染
色 5 min ,Leica 荧光显微镜下计数 ,计算平均值.
1. 4 土壤细菌 DNA的抽提
取沉淀 ,重悬于 2 mL 提取缓冲液中 ,按文献
[ 10] 进行 DNA 的提取 , DNA 溶于 500 μL TE
(pH8. 0),备用.
1. 5 土壤细菌 DNA的定量
DNA 定量采用紫外分光光度计(岛津 UV-
7401PC 紫外可见分光光度计)与琼脂糖凝胶电泳双
重分析. 紫外分光光度法以 λDNA 为标准品 , 以
A 260对 DNA 进行定量;电泳图谱经 GIS 凝胶成像
分析系统(上海天能科技服务公司)与标准 DNA 分
子量参照物比较定量而得.
1. 6 数据处理
相关系数及通径分析利用 DPS统计软件[ 11]完成.
2 结果及分析
2. 1 不同海拔高度七子花林下的土壤细菌 DNA
含量及细菌数量
不同海拔七子花林下的土壤细菌 DNA 的电泳
图谱如图 1所示. 由紫外分光度计与琼脂糖凝胶电
泳双重定量的土壤细菌 DNA 含量及由吖啶橙荧光
染色法测定的土壤细菌数量见表 2.由表 2可知 ,海
拔为 780 m 的七子花林内的土壤的细菌 DNA 含量
及细菌数量均为最低 ,而海拔为 500 m 的七子花林
缘的土壤细菌 DNA 含量及细菌数量均为最高.
图 1 不同海拔高度七子花林下土壤细菌 DNA 琼脂糖凝胶电
泳结果
1~ 3:海拔 990 、780和 500 m 七子花林下土壤细菌 DNA;M:λDNA /
Hind III 标准分子量参照物
Fig. 1 The agaro se gel analy sis of soil bacterial DNA ex tracted
f rom soil unde r Heptacodium miconioides fore st with
different altitude
1~ 3:soil bacterial DNA ext racted under Heptacodium miconioid es f or-
es t w ith al titude 990m , 780m and 500m , respect ively. M :λDNA /Hin d
III standard molecu lar markers
334 浙 江 大 学 学 报(理学版) 第 33 卷
表 2 不同海拔高度七子花林下土壤细菌
DNA含量及细菌数量
Table 2 The bacterial DNA content and bacterial amount
of soil under Heptacodium miconioides fo rest
w ith different altitude
海拔 /m
altitude(m)
细菌 DNA 含量 /
(μg g - 1湿土)
bacterial DNA content /
(μg g - 1 Wet soil)
细菌数量 /
(×108 个 g - 1湿土)
bacte ria count /
(×108 个 g -1 Wet soil)
500 1. 565 4. 21
780 0. 916 1. 76
990 1. 302 3. 81
2. 2 土壤细菌 DNA含量与土壤环境因子的相关
性分析
从表 3可知 ,不同海拔高度的七子花林下土壤
细菌 DNA含量与土壤含水量 、总氮和有机质均呈
极显著性负相关;与土壤细菌数量呈极显著性正相
关 ,其直线回归方程为 y=4×108 x - 2×108 .由公式
可知 ,1μg 土壤细菌DNA相当于 2×108 土壤细菌.
2. 3 土壤细菌 DNA含量与土壤环境因子的通径
分析
由 DPS 软件通过直线回归计算得到的通径系
数如表 4所示. 直接影响土壤细菌 DNA含量最显
表 3 不同海拔高度七子花林下土壤细菌
DNA 含量与环境因子的相关系数
Table 3 The cor rela tion coefficient of the soil bacte rial
DNA content and the environmental facto rs of soil under
Heptacodium miconioides fore st w ith different altitude
环境因子 environmental facto rs
相关系数
cor relation
coefficient
P 值
P va lue
海拔 altitude(m) - 0. 476 7 0. 194 5
pH 值 pH value - 0. 407 2 0. 276 7
含水量 w ater content(%) - 0. 994 1 <0. 01
总氮 total nitrog en(mg kg - 1) - 0. 963 7 <0. 01
总磷 to tal phospho rus(mg kg - 1) 0. 628 0 0. 070 3
有机质 o rg anic ma tte r(mg kg - 1) - 0. 920 0 <0. 01
细菌数量 bacteria count
(×108 个 g - 1 Wet soil土) 0. 965 9 <0. 01
著的环境因子为土壤细菌数量 ,直接通径系数达
0. 985 0 ,显示了土壤细菌 DNA 含量与数量之间的
相关性.其它环境因子中 ,主要的影响因子为海拔 、
有机质及含水量. 由表 4的间接通径系数可知 ,环境
因子主要通过影响土壤细菌数量而间接影响土壤细
菌 DNA的含量 ,间接通径系数的绝对值之和达到
4. 194 5.
表 4 不同海拔高度七子花林下土壤细菌 DNA 含量与环境因子的通径系数
Table 4 The path coefficient of the soil bac te rial DNA content and the env ir onmental factor s o f so il unde r
Heptacod ium miconioides for est w ith different altitude
作用因子
factor s
直接作用
dir ec t
通过 X1
through X1
通过 X2
through X 2
通过 X 3
through X 3
通过 X 4
thr ough X 4
通过 X 5
through X5
通过 X 6
through X6
通过 X7
through X 7
X 1 - 0. 387 3 - 0. 007 0 - 0. 062 9 0. 002 5 0. 003 3 0. 204 0 - 0. 229 4
X 2 0. 011 5 0. 235 8 - 0. 033 7 0. 000 5 - 0. 008 4 0. 007 4 - 0. 620 3
X 3 - 0. 110 4 - 0. 220 5 0. 003 5 0. 003 5 - 0. 004 7 0. 252 5 - 0. 918 0
X 4 0. 003 6 - 0. 268 8 0. 001 7 - 0. 108 9 - 0. 003 4 0. 261 0 - 0. 848 7
X 5 0. 008 7 - 0. 149 1 - 0. 011 1 0. 059 5 - 0. 001 4 - 0. 074 6 0. 795 7
X 6 0. 262 9 - 0. 300 5 0. 000 3 - 0. 106 0 0. 003 5 - 0. 002 5 - 0. 782 3
X 7 0. 985 0 0. 090 2 - 0. 007 2 0. 102 9 - 0. 003 1 0. 007 0 - 0. 208 8
注 X 1 ,海拔;X 2 , pH 值;X3 ,含水量;X4 ,总氮;X 5 ,总磷;X 6 ,有机质;X 7 ,细菌数量
2. 4 土壤细菌数量与土壤环境因子的通径分析
由 DPS 软件通过直线回归计算得到的通径系
数如表 5所示 ,影响土壤细菌数量的主要环境因子
为含水量 、有机质及海拔.由表 5的间接通径系数可
知 ,环境因子主要通过影响含水量和有机质含量而
间接影响土壤细菌数量.
3 讨 论
张崇邦等[ 6] 利用平板稀释法对天台山 8种林型
下的土壤细菌数量进行了测定 ,七子花林型下土壤
细菌数量为 2. 11 ×107 个 g - 1干土. 本文利用
ADOC 法测定七子花林型下土壤总细菌数量平均
为 3. 26×108 个 g - 1湿土 ,约为 4. 4×108 个 g -1
干土 ,比常规方法提取的高出 1. 5个数量级.预期吖
啶橙染色法应比常规方法多出 2 个数量级 ,分析原
因可能是由于差速离心收集土壤细菌时会损失部分
细菌.
土壤细菌的差异与其生境条件存在密切的关
系 ,在一定程度上反映了该生境土壤有机质转化状
况 、土壤肥力水平和生产能力. 由通径分析可知 ,七
子花林下土壤细菌数量的主要限制因子为土壤含水
335 第 3 期 李钧敏 , 等:七子花林下土壤细菌数量及 DNA 含量与环境因子的相关性
表 5 不同海拔七子花林下土壤细菌数量与环境因子的通径系数
Table 5 The path coefficient of the soil bacterial amount and the environmental fac to rs of soil under
Heptacod ium miconioides for est w ith different altitude
作用因子
facto rs
直接作用
direct
通过 X1
through X 1
通过 X2
through X2
通过 X 3
through X 3
通过 X4
through X 4
通过 X5
through X5
通过 X6
through X6
X1 - 0. 237 2 - 0. 123 7 - 1. 659 8 0. 021 8 0. 061 3 1. 704 7
X2 0. 203 2 0. 144 4 - 0. 890 1 0. 004 7 - 0. 153 9 0. 062 0
X3 - 2. 914 5 - 0. 135 1 0. 062 1 0. 030 9 - 0. 085 9 2. 110 4
X4 0. 031 3 - 0. 164 7 0. 030 2 - 2. 876 6 - 0. 063 2 2. 181 3
X5 0. 159 2 - 0. 091 3 - 0. 196 4 1. 571 9 - 0. 012 4 - 0. 623 1
X6 2. 197 3 - 0. 184 0 0. 005 7 - 2. 799 2 0. 031 1 - 0. 045 1
注 X 1 ,海拔;X 2 , pH 值;X3 ,含水量;X4 ,总氮;X 5 ,总磷;X 6 ,有机质
量 ,且为负影响 ,表明在沟谷的生境中 ,因太多的水
分 ,会限制土壤细菌的生长 ,进而影响着系统的生产
力.从以上分析可看出 ,七子花目前资源极少 ,通常
零星分布于沟谷的水沟旁 ,这种生境并非七子花的
适宜生境 ,而是一种无奈的选择.这是由于七子花喜
光 ,不耐荫蔽 ,也不耐强光 ,对光适应的生态幅度较
窄 ,在生存竞争中处于不利地位 ,在立地条件较好的
山坡等地有让位于其它常绿阔叶树种的趋势 ,不得
不退到土层瘠薄 、岩石裸露的沟谷等恶劣的生境
中[ 13] . 通过分析七子花林下土壤细菌数量与环境因
子的相关性 ,可以间接为七子花的致濒机理提供理
论依据 ,因而具有重要意义.
影响土壤细菌数量的第二个因子为有机质 ,是
正影响 ,这与其它文献报道相符[ 6] .土壤细菌数量的
第三个影响因子为海拔高度 ,且为负影响.一般地随
着海拔的升高 ,气温下降 ,土壤细菌的数量将会减
少.因而较低海拔(500 m)处的七子花林下土壤细
菌数量与细菌 DNA 含量均最高. 但海拔 780 m 处
的七子花林下的土壤细菌数量比海拔 990 m 处低 ,
成为 3个样地中土壤细菌数量最少的一个. 分析原
因除该样地土壤含水量较高之外 ,还与组成该样地
的植物群落类型有关 ,虽然 3 个样地均为落叶阔叶
林 ,但海拔 500 、990 m 两个样地位于林缘 ,除七子
花外 ,其它伴生植物 ,尤其是灌木层的植物种类很丰
富.而海拔 780 m 的样地 ,位于七子花林内 ,组成群
落的植物种类较少 ,七子花的优势突出 ,呈单优势群
落 ,植物群落的多样性较低 ,能为土壤微生物群落提
供的营养物质和微生物种群生长所需的资源相对较
为单一 ,因而土壤微生物数量较少.植物群落类型初
步决定了微生物群落的组成 ,土壤微生物群落多样
性与覆盖于土壤上的植物群落多样性呈正相关[ 14] .
不同海拔七子花土壤细菌 DNA 含量与土壤细
菌数量呈极显著性正相关 , 1μg 土壤细菌 DNA 相
当于 2×108 土壤细菌. 利用土壤细菌 DNA 含量可
定量地推算土壤细菌数量 ,同时也间接证明了土壤
细菌数量 ADOC法计数的可行性.七子花林下土壤
细菌 DNA 含量的主要影响因子为土壤细菌数量 ,
直接通径系数达 0. 985 0 ,其次为海拔 ,有机质及含
水量.而环境因子主要通过影响土壤细菌数量而间
接影响土壤细菌 DNA 的含量.
核酸作为生物体内最基础的大分子 , 核酸含量
的变化直接反映了核酸合成和复制的正常性.本文
结果显示在正常情况下 ,土壤细菌 DNA 含量与土
壤细菌数量之间具有明显的相关性 ,在分析土壤细
菌物种多样性 、数量多样性等的同时分析土壤细菌
DNA 含量的差异 ,具有一定的意义.在特殊环境下
如重金属污染等 ,核内遗传物质的改变会导致细菌
DNA 数量发生改变 ,从而使细菌 DNA 与细菌数量
之间不再呈现简单的相关 ,因此细菌 DNA 含量也
可作为一项指标用于监测环境细菌的多样性及指示
特殊环境下的变化. Bhunia 发现马拉森(Marathi-
on)和西维因(Carbary l)能迅速降低喜钙念珠藻
(Nostoc muscorum)的核酸含量[ 12] ,因此把核酸含
量的变化作为植物体抗污染胁迫的一个指标具有重
要意义.
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(责任编辑 涂 红)
337 第 3 期 李钧敏 , 等:七子花林下土壤细菌数量及 DNA 含量与环境因子的相关性