全 文 ：世界科学技术—中医药现代化★专题讨论之一：中药资源与鉴定
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2013-05-24
修回日期：2013-06-04
＊ 新疆维吾尔自治区科技厅科技基础条件平台建设项目（PT1211）：新疆传统药物 DNA条形码鉴定技术平台建设，负责人：李晓瑾；乌鲁木齐市科技
厅科技攻关项目（G121120004）：新疆民族药材鉴定 DNA条形码数据库建设与关键技术研究，负责人：李晓瑾。
＊＊ 通讯作者：李晓瑾，研究员，主要研究方向：中药资源学研究。
维吾尔药材香青兰DNA条形码
鉴定方法的研究＊
□樊丛照 李晓瑾＊＊ 朱 军 王果平 阿依别克 宋海龙
（新疆中药民族药研究所 乌鲁木齐 830002）
摘 要：目的：建立维吾尔药材香青兰的 DNA 条形码鉴别方法。方法：采用 ITS2 序列对香青兰
Dracocephalum moldavica L. 及其 10 种近缘种的 25 份样品进行 PCR 扩增并测序，比较种内和种间变
异，采用 K2P 模型构建 NJ 系统树，并比较二级结构差异。结果：产自新疆的香青兰（KF041160、
KF041163、KF041168、KF041169）种内无变异，来源于 GenBank 的香青兰（AY506659）种内存在 2 个变
异位点；NJ 树显示香青兰可以与其近缘种区分开；垂花青兰 D. nutans L.、羽叶青兰 D. bipinnatum
Rupr.、全叶青兰 D. integrifolium Bge.等也可以与其他近缘种区分。结论：ITS2 条形码序列可以鉴定香
青兰及其近缘种植物，提供了维吾尔药材香青兰分子鉴定的有效途径。
关键词：香青兰 ITS2 近缘种 鉴定
doi: 10.11842/wst.2013.03.014 中图分类号：R282.5 文献标识码：A
维吾尔药材香青兰（Dracocephalum moldavica
L.）属于唇形科一年生草本植物，维吾尔名为巴迪
然吉布亚，始载于维吾尔古典医籍《阿里卡农》，以
其干燥的地上部分入药，为《中华人民共和国卫生
部药品标准（维吾尔药分册）》所收载，二级干热，可
治疗心血管疾病；《维吾尔药志》记载，其味甘、苦，
性凉，归肝、脾经，有泻火、清热、止血的功能 [1,2]。新
疆青兰属植物有 14 种，1 个变种，香青兰主要近缘
种有垂花青兰 Dracocephalum nutans L.、羽叶青兰
Dracocephalum bipinnatum Rupr.、异叶青兰 Draco－
cephalum heterophyllum Benth.、刺齿青兰 Draco－
cephalum peregrinum L.、全叶青兰 Dracocephalum
integrifolium Bge.等。其中异叶青兰、全叶青兰亦作
药用，但药理作用与香青兰不同，为保证药材质量
及安全用药，对香青兰及其同属近缘种的鉴定研究
具有重要意义。目前国内外学者多集中在香青兰的
化学成分和药理作用 [3~7]等方面的研究，有关其DNA
条形码鉴别的研究尚未见报道。
DNA 条形码技术是指用一段短的、标准的 DNA
片段作为标记来进行生物物种鉴定 [8]，已成为生物
分类鉴定的研究热点和方向。陈士林等基于大样本
量分析证实 ITS2 序列可以作为植物物种鉴别的通
用条形码 [9~18]。提出 ITS2 序列可以作为标准 DNA 条
形码鉴别药用植物及其近缘物种。辛天怡等 [19]使用
ITS2 序列对中药材羌活及其混伪品进行鉴定，罗焜
等 [20,21]对不同基原秦艽和贝母药材及其混伪品进行
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鉴别，均取得了良好的鉴定效果。本研究拟使用
ITS2 序列对维药香青兰及其近缘物种进行鉴别，以
建立快速、准确、便捷的分子鉴定方法，确保香青兰
药材基原的准确性，保障用药安全。
一、材料与方法
1. 植物材料
青兰属实验材料 11 种，共 19 份样品采自新疆
不同县市，野外采集的新鲜药材基原植物硅胶干燥
后使用。其中香青兰 4 份，青兰属其他植物 15 份。
实验材料均由新疆中药民族药研究所副研究员王
果平鉴定，凭证样本保存于新疆中药民族药研究所
标本馆，详细信息见表 1。从 GenBank 数据库（数据
下载日期为 2013 年 5 月 9 号）获得青兰 1 属 6 种 6
条序列，见表 2。
2. 方 法
（1）样品 DNA 的提取及检测。
称取药材干燥叶片样品 30 mg，用 DNA 提取研
磨仪 1 000 rpm 研磨 2 min，使用植物 DNA 提取试
剂盒（Tiangen Biotech Co., China） 提取总 DNA，用
表 1 实验样品信息
学名 标本号 GenBank No. 采集地点 采集人
D. moldavica 65230421 KF041160 吉木萨尔二工乡 昌吉队
D. moldavica 65230573 KF041163 吉木萨尔二工乡 昌吉队
D. moldavica 20120718375 KF041168 于田县先拜巴扎镇 朱军
D. moldavica 20120724481 KF041169 墨玉县芒钉乡 朱军
D. nutans 65230127 KF041157 奇台万泉 昌吉队
D. nutans 65230175 KF041158 吉木萨尔泉子街镇 昌吉队
D. nutans 65230329 KF041159 吉木萨尔泉子街镇 昌吉队
D. nutans 65230476 KF041161 阜康天池 昌吉队
D. nutans 65230694 KF041164 奇台碧流河宽沟 昌吉队
D. heterophyllum 652827-120628-598 KF041167 和静巴音布鲁克镇 巴州队
D. heterophyllum 20120905605 KF041170 民丰县叶亦克乡 朱军
D. integrifolium 65230536 KF041162 阜康三工河 昌吉队
D. integrifolium 652827-120621-467 KF041166 和静巩乃斯林场 巴州队
D. integrifolium 654021120619004 KF041175 伊宁县吉尔格朗沟 程波
D. bipinnatum 654026120813006 KF041176 昭苏县昭苏镇 何江
D. bipinnatum 654028120806003 KF041178 尼勒克县胡吉尔台乡 潘兰
D. bipinnatum 654028120807004 KF041179 尼勒克县乌拉斯台乡 李国强
D. grandiflorum 654025120627002 KF041177 新源县 217国道边 潘兰
D. origanoides 652827-120616-221 KF041165 和静至火烧桥间 巴州队
注：昌吉队、巴州队、阿勒泰队为全国第四次资源普查新疆试点普查队。
表 2 从 GenBank 中下载的青兰属 ITS2 序列信息
学名 GenBank No.(ITS2) 序列信息来源
D. moldavica AY506659 Miami, USA
D. grandiflorum AJ420999 Richmond, UNITED KINGDOM
D. argunense GQ456140 Taejeon, Korea
D. parviflorum JQ669097 Madison, USA
D. kotschyi AJ420998 Richmond, UNITED KINGDOM
D. bullatum JQ669096 Madison, USA
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1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小及质量。
（2）PCR 扩增及测序。
PCR 扩增：扩增所用引物 ITS2 序列由生工生物
工程合成，其正向序列 ITS2F：5’-GCGATACTTGGT－
GTGAAT -3’， 反 向 ITS3R：5’-GACGCTTCTCCA－
GACTACAAT-3’。
反应体积 25 μL，dNTP 0.4 μL（10 mmol·L-1），
PCR 缓冲液 2.5 μL （10 ×），引物各 1.0 μL（2.5
μmol·L-1）（Sangon Co., China），聚合酶 1.0 U（TIAN－
GEN），总 DNA 1 μL（约 30 ng）；扩增程序：94℃变
性 5 min；94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸
45 s（40 个循环）；72℃延伸 10 min；扩增结果由上
海美吉生物测序公司测序。
3. 数据处理
测 序 峰 图 利 用 CodonCode Aligner V 4.0.4
（CodonCode Co., USA）校对拼接，去除引物区，将所
有序列用软件 MEGA5.0（Molecular evolutionary ge－
netics analysis）分析比对 [22]，ITS2 序列基于隐马尔可
夫模型的 HMMer 注释方法，去除两端 5.8S 和 28S
区段获得 ITS2 间隔区序列 [23]，基于 K2P 模型进行遗
传距离等分析，用邻接（NJ）法构建系统聚类树，利
用 Bootstrap（1 000 次重复）检验各分支的支持率。
根据 Schuhz 等 [ 24]建立的 ITS2 数据库及网站预测
ITS2 二级结构。
二、结果与分析
1. 香青兰药材样品 DNA 提取与 PCR 扩增
用硅胶法干燥的样品 DNA 提取后经电泳检测，
结果显示电泳条带较亮、清晰，少数有非特异条带，
从 PCR 扩增和测序结果来看，未对 ITS2 序列的
PCR 扩增产生影响。
2. 香青兰药材种内及近缘种变异分析
5 份香青兰样品 ITS2 长度均为 219 bp，其种内
样本间共存在 2 个变异位点，分别为 57 bp 处的 T-
C 变异和 64 bp 处的 G-C 变异，分为 2 个单倍型
（表 3），只有 AY506659 序列单倍型为 A1，其余 4 个
KF041160、KF041163、KF041168、KF041169 均相同，
单倍型为 A2。香青兰与其近缘种之间的变异位点
共有 18 个。基于 K2P 模型计算遗传距离，5 份香青
兰样品 ITS2 序列种间平均 K2P 距离为 0.003，种间
最大 K2P 距离为 0.009。香青兰与其同属近缘种
ITS2 序列种间平均 K2P 距离为 0.226，种间最小
K2P 距离为 0.014。
3. 香青兰及同属近缘种 NJ 树鉴别
基于香青兰及其近缘种 19 份实验样品及 Gen－
Bank 下载的 6 条 ITS2 序列，构建香青兰及其同属
近缘种 NJ 树（图 1），结果表明 5 份香青兰样品单独
聚为一支，呈现明显的单系性，可以与其近缘种区
分开。此外，垂花青兰、羽叶青兰、全叶青兰也都单
独聚为一支，能够与香青兰和以及其余青兰属近缘
种 区 分 开 ， 来 源 于 GenBank 的 5 份 样 品 中
GQ456140 与 JQ669097 聚在一起，其余均单独聚为
一支。由此可见，ITS2 序列作为条形码可准确鉴别
香青兰药材及其近缘种。
4. 香青兰及近缘种 ITS2 序列二级结构比较
本研究选取香青兰及其近缘物种进行 ITS2 结
构预测，结果如图 2 所示，香青兰与其同属近缘种
垂花青兰（KF041164）、大花青兰（AJ420999）、羽叶
青兰（KF041178）ITS2 二级结构在螺旋Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和
Ⅳ区均存在差异；香青兰与近缘种在螺旋Ⅰ、Ⅲ间
的翻转角度也存在明显差异，因此，ITS2 二级结构
也可作为维吾尔药材香青兰及近缘种的一种方法。
此外，垂花青兰、大花青兰、羽叶青兰之间 ITS2 二级
结构在螺旋Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ区均存在差异，他们之间
也可以用 ITS2 二级结构加以区分。
三、讨 论
香青兰的药用部位为地上全草部分，因此，直
接从药用部位叶片中提取 DNA 进行条形码研究对
中药材香青兰的鉴定更具现实意义 [25]。本实验基于
DNA 条形码技术对香青兰进行研究，结果显示：实
验中所使用的来源于新疆不同产地的 4 份香青兰
样品均扩增得到 ITS2 序列，种内无变异，另外从
GenBank 中下载 1 份香青兰 ITS2 序列 AY506659，
来源于美国迈阿密，与实验中的香青兰存在 2 个变
异位点。如果仅对新疆地产香青兰及其近缘种进行
鉴别，由于香青兰种内暂未发现变异位点，其种内
K2P 遗传距离为 0，会使其鉴定准确率更高。
表 3 香青兰 ITS2 序列种内变异位点
GenBank No. Haplotype 57 bp 64 bp
AY506659 A1 T G
KF041160、KF041163、
KF041168、KF041169 A2 C C
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NJ 树显示，D. grandiflorum（KF041177）、D. ar－
gunense（GQ456140）与 D. parviflorum（JQ669097）聚
为一支，其 ITS2 序列长度为 233 bp，而其余长度在
214~220 bp 之间，这说明三者可能亲缘关系较近。
D. hobuksarensis（KF041174）与 D. Nutans 聚在一起，
表明其具有一定亲缘关系。由此可见，ITS2 不仅能
将维药香青兰与其近缘种进行区别，同时也可以将
青兰属中的植物做很好的区分，为植物分类提供了
理论依据。
香青兰及其近缘种的 ITS2 二级结构都存在 4
个螺旋区域，各螺旋上的茎环，以及彼此间的夹角
存在明显的不同，说明 ITS2 二级结构有助于更直观
的鉴定物种；以上结论都能很好的说明 ITS2 序列能
够用于维药香青兰及其同属近缘种的鉴别。
图 1 基于 ITS2 序列采用最近距离法构建青兰属系统发育树
注：分支支持率≥50%，1 000次重复。
Dracocephalum moldavica KF041168
Dracocephalum moldavica AY506659
Dracocephalum moldavica KF041163
Dracocephalum moldavica KF041160
Dracocephalum moldavica KF041169
Dracocephalum integrifolium KF041166
Dracocephalum integrifolium KF041162
Dracocephalum integrifolium KF041175
Dracocephalum kotschvi AJ420998
Dracocephalum bipinnatum KF041176
Dracocephalum bipinnatum KF041178
Dracocephalum bipinnatum KF041179
Dracocephalum bullatum JQ669096
Dracocephalum origanoides KF041165
Dracocephalum grandiflorum AJ420999
Dracocephalum nutans KF041157
Dracocephalum nutans KF041158
Dracocephalum nutans KF041159
Dracocephalum nutans KF041161
Dracocephalum nutans KF041164
Dracocephalum grandiflorum KF041177
Dracocephalum argunense GQ456140
Dracocephalum parviflorum JQ669097
Dracocephalum heterophyllum KF041167
Dracocephalum heterophyllum KF04117097
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图 2 香青兰与近缘种的 ITS2 二级结构比较
大花青兰 D. grandiflorum 羽叶青兰 D. bipinnatum
香青兰 D. moldavica 垂花青兰 D. nutans
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（责任编辑：李沙沙 张志华，责任译审：陈士林）
The Identification of Uygur Medicine Dracocephalum Moldavica L. and Its Sibling by ITS2 Sequence
Fan Congzhao, Li Xiaojin, Zhu Jun, Wang Guopin, AYibieke, Song Hailong
(XinJiang Institute of Chinese Traditional Medical and Ethical Materia Medica, Urumqi 830002, China)
Abstract: Objective: To establish the DNA barcode identification method of Uygur Medicine Dracocephalum mol-
davica L. Methods: D. moldavica L. and its ten sibling species of twenty five samples was amplified by ITS2 se-
quence, after sequencing and comparing the intraspecific and interspecific variation, we using K2P and NJ meth -
ods to analysis the their relationship, then compare the secondary structure. Results: D. Moldavica (KF041160,
KF041163, KF041168, KF041169) from Xinjiang without variation in intraspecies, but there are two 2 variation
sites in D. moldavica (AY506659) from GenBank. By NJ method, D. moldavica can be distinguished with their
sibling species. Also, D. nutans L., D. bipinnatum Rupr. and D. integrifolium Bge. can be distinguished with oth-
er sibling species. Conclusion: ITS2 barcode sequence was able to identify D. moldavica and its sibling species,
which provides an effective way for the molecular identification of Uygur Medicine D. moldavica.
Keywords: Dracocephalum moldavica L., ITS2, sibling species, identification
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