全 文 ：植 物 学 报 1994, 36( 8): 581— 586
Acta Bot anica Sinica
外源激素在诱导风信子花被外植体不同
部位细胞再生花芽中的作用*
陆文木梁 梁 斌
(中国科学院植物研究所 ,北京 100044)
Enomoto K Fukunaga Y
(日本学研植物工学研究所 )
摘 要
外源激素诱导风信子 ( Hyacinthus orientalis L. )同一发育时期花被外植体不同部位细胞
再生花芽的实验表明: 1. 诱导花被外植体细胞再生花芽 ,外源激素是必需的 ; 2. 仅有细胞分
裂素就可以诱导花芽再生 ,生长素并不是必需的 ; 3. 花被外植体上的不同部位的细胞再生花
芽时 ,需要不同浓度的外源激素 . 单独加 6-BAP或玉米素 2 mg /L可以诱导花被下部的细胞
再生花芽 ; 6-BAP或玉米素 2 mg /L和 2, 4-D 0. 1 mg /L的组合有利于花被中部的细胞再生
花芽 ; 6-BAP或玉米素 2 mg /L和 2, 4-D 1. 0 mg / L的组合能促进花被上部的细胞分化花芽 .
关键词 风信子 ;组织培养 ;花芽再生⒇
ROLE OF EXOGENOUS HORMONES IN INDUCING CELLS
IN DIFFERENT POSITIONS OF PERIANTH EXPLANTS
TO REGENERATE FLOWER BUDS IN
HYACINTHUS ORIENTALIS
Lu Wen-liang and Liang Bin
( Institute of Botany , Academ ia Sinica , Beijing 100044 )
Enomoto K and Fukunaga Y
(Gakken Inst itute of Plant Technolog y , Honson 1-2-14, Chigasaki-shi , Japan )
Abstract
Role of the exogenous hormone in inducing di fferent position cells of perianth explants
of hyacinth to reg enerate flow er buds w as studied. Experiments show ed that ( 1) Exogenous
⒇收稿日期: 1992-10-20 接受日期: 1993-04-15
* 国家自然科学基金资助课题 .
hormones are necessary for inducing cells of the perianth explant to regenerate the flow er
buds; ( 2) Only cytokinine alone could induce the regeneration of the flow er buds, the auxin
was no t necessary; ( 3) Exogenous hormones in different concentrations could induce cells in
the different parts of the perianth explants to dif ferentiate the flower buds: 6-BAP or zeatin
2 mg /L alone could induce cells located at the lower part of the perianth to dif ferentiate
flower buds. Combination of 6-BAP o r zeatin 2 mg /L and 2, 4-D 0. 1 mg /L was advanta-
geous to cells located middle part of the perianth to regenerate the f low er buds. Combination
of 6-BAP o r zeatin 2 mg /L and 2, 4-D 1. 0 mg /L could promote cells located at the upper
part of the perianth to dif ferentiate flow er buds.
Key words Hyacinthus orientalis; Tissue culture; Flower bud regeneration
植物组织和细胞培养中诱导器官再生仍然是当前细胞工程和基因工程中使人困扰的
问题。近些年来在花芽、花器官和性器官再生 [1— 5 ]的研究中 ,外植体本身的特点 ,如外植体
的年龄 (作为控制器官再生的一个内在因子 )已逐渐引起人们的注意。 然而对外植体不同
部位细胞的特点仍然没有足够的重视 ,迄今还不清楚外植体不同部位细胞在器官分化上
的差异。我们通过控制外植体的年龄 ,成功地控制了风信子花被外植体再生花芽、花被、雄
蕊和胚珠 [ 6]。本文进一步研究了同一年龄的花被外植体上不同部位细胞再生花芽所需要
的条件 ,揭示了不同部位的细胞在器官分化上的差异 ,成功地控制了花被上、中、下部位细
胞再生花芽。
材 料 和 方 法
(一 )植物材料
三年生风信子 ( Hyacinthus orientalis L. cv. delf t blue)鳞茎被用作实验 ,购于日本。9月
份购得的鳞茎在室温中贮藏 2个月 ,然后置于潮湿的细砂中 3℃再贮藏 2个月用于实验。
(二 )组织培养
幼花被用作外植体 ,从幼花蕾上分离时 ,花粉正处于 2核初期。消毒和分离过程如下:
解剖鳞茎 ,取出幼花序 ,从花序上取出花蕾 ,在 1 /1000的升汞中消毒 10分钟 ,无菌水冲洗
3遍 ,每朵花纵剖为 4块 ,弃去雄蕊和雌蕊 ,这 4块花被组织用作接种。基本培养基是 MS,
附加 CH 500 mg /L,糖浓度调整到 3% , pH 5. 8。按实验需要附加不同种类和浓度的外源
激素。培养物置于 25± 2℃ ,每天 9小时照光 ( 40 W荧光灯 , 3000 lx )、 15小时黑暗的条件
下培养。为了便于统计花被外植体上不同部位花芽的分化 ,人为地将长度 6— 10 mm的花
被外植体划分为上、中、下三部分 ,从花丝着生点开始向上 2 mm为中部 ,中部以上的部分
为上部 ,中部以下的部分为下部。
结 果 和 讨 论
(一 ) 6-BAP和 2, 4-D组合的影响
首先研究了不加外源激素及固定 6-BAP浓度使 2, 4-D浓度变化的影响。实验共分 5
582 植 物 学 报 36卷
组。第 1组 , 6-BAP和 2, 4-D浓度都为 0 mg /L;第 2组至第 5组 , 6-BAP固定在 2 mg /L,
2, 4-D浓度分别是 0、 0. 1、 0. 5和 1. 0 mg /L。在培养的第 1个月里再生花芽在花被外植体
的上、中、下各部分布的比例有明显的变化 , 1个月以后分布的趋势基本上保持不变 ,因此
在培养的第 14天、第 21天和第 28天对再生花芽在花被的上、中、下各部分布的百分数进
行了统计 ,结果列于表 1。 表 1显示 ,不加外源激素 ,外植体上任何部位都没有花芽分化 ,
表明外植体上任何部位的细胞分化花芽时都需要外源激素的存在。6-BAP2mg / L和
2, 4-D 0 mg /L的组合在培养 14天时只有花被下部的细胞可以分化花芽 ,中部和上部都
无花芽分化。培养到 21天时 ,中部出现花芽 ,但数量不多 ,只占花芽总数的 25% ,上部仍
然没有花芽。培养到 28天时 ,中部花芽进一步增多达 41% ,但下部仍然最多 ,达 59% ,上
部依然不分化花芽 (图版Ⅰ , 2、 3仅下部形成花芽 ) ,表明仅有外源细胞分裂素就可以诱
表 1 2, 4-D对诱导花被外植体不同部位细胞再生花芽的影响
Table l Effects of 2, 4-D on inducing cells in differ ent positions of perianth explant
to r eg enera te flow er buds
培养天数
Days in cultu re
外源激素 ( mg /L)
Ex ogenous hormones
6-BAP 2, 4-D
外植体数
No. of explan t
外植体上花芽数
No. of flow er buds on explan t
上部
Upper
part
%
中部
Midd le
part
%
下部
Lower
part
%
14
0 0 36 0 0 0 0 0 0
2 0 36 0 0 0 0 23 100
2 0. 1 36 0 0 29 100 0 0
2 0. 5 32 71) 21 26 79 0 0
2 1. 0 36 211) 43 28 57 0 0
21
0 0 36 0 0 0 0 0 0
2 0 36 0 0 9 25 27 75
2 0. 1 36 8 20 32 78 1 2
2 0. 5 32 181) 40 27 60 0 0
2 1. 0 36 471) 62 29 38 0 0
28
0 0 36 0 0 0 0 0 0
2 0 36 0 0 37 41 53 59
2 0. 1 36 8 7 98 90 3 3
2 0. 5 32 391) 40 56 58 2 2
2 1. 0 36 1241) 77 37 23 0 0
1)花芽畸变。 Flow er bud aberration.
导外植体细胞分化花芽。再生花芽在外植体上分布的特点是:下部花芽最多 ,中部其次 ,上
部没有。 6-BAP 2 mg /L和 2, 4-D 0. 1 mg /L的组合在培养 14天时只有中部分化花芽 ,上
部和下部都无花芽分化。培养到第 21天时 ,上部和下部开始分化少量花芽。培养到第 28
天时 ,再生花芽在外植体上分布的特点是:中部花芽分化最多 ,达花芽总数的 90% ,上部
次之达 7% ,下部最少仅 3% (图版Ⅰ , 4仅中部形成花芽 ) ,表明随着 2, 4-D浓度从 0增加
到 0. 1 mg /L ,花芽由主要集中在外植体的下部向主要集中在中部转化。6-BAP 2mg /L和
2, 4-D 0. 5 mg /L的组合再生花芽在外植体上分布的特点是:上部从 2, 4-D 0. 1 mg /L时
的 7%提高到 40% ,中部从 2, 4-D 0. 1 mg /L时的 90%降低到 58% ,下部则从 3%下降到
2% ,表明随着 2, 4-D浓度从 0. 1 mg /L提高到 0. 5 mg /L时 ,再生花芽有由中部逐渐转向
5838期 陆文木梁等: 外源激素在诱导风信子花被外植体不同部位细胞再生花芽中的作用
上部集中的趋势。 6-BAP 2 mg /L和 2, 4-D 1. 0 mg /L的组合在培养到第 14天时 ,中部再
生花芽最多 ,上部其次 ,下部无花芽。 随着培养天数增加 ,上部花芽迅速增加 ,到第 28天
时 ,上部花芽最多 ,占总花芽数的 77% ,中部其次为 23% ,下部仍然无花芽分化 (图版Ⅰ ,
5、 6仅上部形成花芽 ) ,表明随 2, 4-D浓度从 0. 5 mg /L增加到 1. 0 mg /L后 ,再生花芽已
由主要集中在中部转变为主要集中在上部。以上的实验结果表明 ,当 6-BAP浓度固定在 2
mg /L,附加 2, 4-D 0 mg /L主要诱导花被下部的细胞再生花芽 ;附加 2, 4-D 0. 1— 0. 5
mg /L主要诱导花被中部的细胞再生花芽 ;附加 2, 4-D 1. 0 mg /L主要诱导花被上部的细
胞分化花芽。这表明了花被外植体不同部位的细胞直接再生花芽时 ,对生长素的要求存在
着由花被下部到上部逐渐递增的有规律性的差异或称梯度差异。
其次研究了固定 2, 4-D浓度 ,使 6-BAP浓度变化的影响。实验共分 3个组 ,这 3个组
2, 4-D浓度都固定在 0. 1 mg /L, 6-BAP浓度第 1组为 0. 1 mg /L;第 2组为 1. 0 mg /L;第
3组为 5. 0 mg /L。鉴于上述同样的原因在培养的第 14天、第 21天和第 28天观察了花被
表 2 6-BAP对诱导花被外植体不同部位细胞再生花芽的影响
Table 2 Effects o f 6-BAP on inducing cells in different positio ns o f perianth explant
to r eg enera te flow er buds
培养天数
Days in cultu re
外源激素 ( mg /L)
Ex ogenous hormones
6-BAP 2, 4-D
外植体数
No. of explan t
外植体上花芽数
No. of flow er buds on explan t
上部
Upper
part
%
中部
Midd le
part
%
下部
Lower
part
%
14
0. 1 0. 1 43 0 0 27 100 0 0
1. 0 0. 1 58 0 0 42 100 0 0
5. 0 0. 1 39 0 0 27 100 0 0
21
0. 1 0. 1 43 4 5 72 94 1 1
1. 0 0. 1 58 4 7 57 93 0 0
5. 0 0. 1 39 281) 36 49 64 0 0
28
0. 1 0. 1 43 7 7 7 89 4 4
1. 0 0. 1 58 20 12 140 87 1 1
5. 0 0. 1 39 571) 43 74 56 1 1
1)花芽畸变。 Flow er bud aberration.
上、中、下三部分花芽分化的情况 ,结果列于表 2。表 2所示 ,培养到第 14天时 , 3个组花芽
的再生都集中在花被的中部 ;培养到第 21天时 3个组花芽仍然主要集中在花被中部 ,但
随着 6-BAP浓度的增加 ,花被上部再生花芽有增多的趋势。到培养的第 28天时这种趋势
更明显。这表明 ,当 2, 4-D浓度固定在 0. 1 mg /L、 6-BAP浓度从 0. 1 mg /L到 5. 0 mg /L
变化时 ,再生花芽在外植体上分布的特点是:培养 14天时再生花芽都集中在花被中部 ,在
以后的 2个星期中虽然再生花芽仍然集中在花被中部 ,但随着培养天数的增加和随着 6-
BAP浓度的增加 ,花被上部的再生花芽有增加的趋势。与上一个实验相比较可以发现: 6-
BAP浓度由低到高变化也有使再生花芽主要在花被中部集中转向上部集中的趋势 ,但这
种趋势远不如 2, 4-D浓度变化时那么明显和那么有规律。
(二 )玉米素和 2, 4-D组合的影响
玉米素和 2, 4-D不同浓度组合的实验设计与 6-BAP和 2, 4-D组合的实验设计相同 ,
将 6-BAP换成玉米素只是为了观察不同的细胞分裂素的作用。实验结果列于表 3。表 3表
584 植 物 学 报 36卷
表 3 玉米素和 2, 4-D对诱导花被外植体不同部位细胞再生花芽的影响
Table 3 Effects o f zeatin and 2, 4-D on inducing cells in different positio ns of perianth explant
to r eg enera te flow er buds
培养天数
Days in cul ture
外源激素
Exogenous h ormones
( mg /L)
Zeatin 2, 4-D
外植体数
No. of explan t
外植体上花芽数
No. of f low er buds on explant
上部
Upper
part
%
中部
Middle
part
%
下部
Low er
part
%
14
0 0 32 0 0 0 0 0 0
2 0 32 0 0 4 30 9 70
2 0. 1 26 0 0 14 100 0 0
2 0. 5 21 2 22 7 78 0 0
2 1. 0 35 181) 75 6 25 0 0
21
0 0 32 0 0 0 0 0 0
2 0 32 0 0 10 34 19 66
2 0. 1 26 8 28 20 69 1 3
2 0. 5 21 71) 47 8 53 0 0
2 1. 0 35 191) 66 10 34 0 0
28
0 0 32 0 0 0 0 0 0
2 0 32 3 5 38 60 22 35
2 0. 1 26 13 37 20 57 2 6
2 0. 5 21 101) 37 16 59 1 4
2 1. 0 35 561) 80 13 19 1 1
1)花芽畸变 Flow er bud aberration.
明 ,再生花芽在花被外植体上分布的总趋势基本上与 6-BAP和 2, 4-D不同组合的结果相
似 ,只是在玉米素 2mg / L和 2 , 4-D0mg / L时培养到第 28天 ,不像 6-BAP2mg / L和
2, 4-D 0 mg /L那样 ,再生花芽主要集中在下部 ,中部其次 ,上部无花芽 ,而是再生花芽主
要集中在花被外植体中部 ,下部其次 ,上部最少。表明玉米素与 2, 4-D结合诱导花被外植
体不同部位细胞分化花芽的作用基本上与 6-BAP和 2, 4-D组合的作用相似 ,但单独使用
时它们之间存在一定的差异。
从植株不同部位分离的外植体的研究 ,揭示了从植株基部到顶部存在着成花梯
度 [1, 7 ]。分化研究表明 ,这种梯度与不同部位外植体中某些酶活性的梯度相关 [ 8]。本研究从
6— 10 mm长的花被外植体上观察到 ,不同部位的细胞在分化花芽时对外源激素浓度的
要求存在一个自下而上增高的梯度。这就从另一个角度证实了成花梯度的广泛存在。
参 考 文 献
1 Aghion-Prat D. Floral meris tem organizing g radient in tobacco stems. N ature, 1965. 207: 1211
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4 Lu W, Enomoto K, Fukunaga Y et al . Regeneration of tepals, stamens and ovules in ex plants f rom perian th of h y-
acinthus orientalis L. Planta, 1988. 175: 478— 484
5 Th orpe T A, Tran Thanh Van M, Thomas G. Isoperoxidases in epidermal layers of tobacco and changes during organ
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6 陆文木梁 ,郭仲琛 ,王雪洁等 . 风信子外植体直接再分化花芽的研究 . 中国科学 ( B辑 ) , 1986. ( 5): 491— 500
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8 章美云 ,韩碧文 . 烟草薄层培养的花芽诱导和开花梯度的研究 . 作物学报 , 1992. 18: 17— 22
图 版 说 明
L P. 花被基部 F.花丝 U P.花被上部 FB.花芽
1. 培养 5天的花被外植体 ,示花被的上部、下部和花丝。× 15 2. 单独附加 6-BAP 2 mg /L的 M S培养基中由风
信子花被外植体下部细胞直接分化的花芽。× 10 3.图 2中的花芽长大。× 12 4.附加 6-BAP或玉米素 2 mg /L和
2, 4-D 0. 1 mg /L的 M S培养基上由花被外植体中部细胞直接再生的花芽。 × 8 5. 附加 6-BAP或玉米素 2 mg /L和
2, 4-D 1. 0 mg /L的 M S培养基上由花被外植体上部细胞直接分化的花芽。 × 10 6. 图 5中的花芽长大。 × 12
Explanation of Plate
U P. Upper part of perianth explant; F. Filam ent; FB. Flow er bud; LP. Low er part of perianth explant; Fig. 1. Pe-
rian th explant cul tured for 5 days, showing upper and low er part of perianth explant and f ilam ent.× 15 Fig. 2. Flow er
buds dif feren tiated f rom the cells of th e low er part of perianth explan t cultured on MS medium supplemented wi th 6-BAP
2 mg /L alone for tw o month s.× 10 Fig. 3. Th e flow er bud sh ow ed in Fig. 2. grows up× 12 Fig. 4. Flow er buds di ffer-
entiated f rom cells of the middle part of perianth ex plant cultured on M S medium wi th 6-BAP or zeatin 2 mg /L and 2, 4-D
0. 1 mg /L for th ree w eeks.× 8 Fig. 5. Flow er buds dif feren tiated f rom cells at the upper part of perian th explant cul tured
on M S medium w i th 6-BAP or zeatin 2 mg /L and 2, 4-D 1. 0 mg /L for one month.× 10 Fig. 6. The f low er buds show ed
in Fig. 5 grow up.× 12
586 植 物 学 报 36卷
陆文木梁等: 外源激素在诱导风信子花被外植体不同部位细胞再生花芽中的作用 图 版 Ⅰ
Lu Wen- liang et al. : Role of Exogenous Hormones in Inducing Cells in Different Posi tions of Perianth Explants to Regenerate Flower Buds in Hyacinthus orientalis Pla teⅠ
See explanation at the end of tex t