全 文 ：植 物 学 报 19 9 3 , 3 5 ( 7 ) : 月9 3一 4 9 8
A e t a B o t a n诬e a s 云t 云e a
风信子再生胚珠的大抱子发生
和胚囊发育的细胞学观察 `
陆文棵 钱南芬
(中国科学院植物研究所 ,北京 1 0 0 0 4 4 )
K
.
E n o m o t o a n d Y
.
F u k u n a g a
( 日本学研植物工学研究所 , H os on l一 2一 1 4 , hC l目处泛 k i 一 s ih aJ aP n)
摘 要
离体条件下风信子 (脚。 d 毗丙哪 , 触呱如 15 L . )再生胚珠的形态发生及大抱子发生和胚囊发育
的细胞学研究表明 :再生胚珠具有正常的珠被 、 珠心和珠柄的分化过程 ,但其形状与自然情况
下的明显不同 ,绝大部分再生胚珠是直生型和半倒生型 ,与自然情况下相同的倒生型胚珠极
少 ;胚珠的大抱子发生和胚囊的发育具有正常的细胞学过程 。 最后可形成 1个卵细胞 , 2 个助
细胞 , 1个中央细胞和 3 个反足细胞的 8 核墓型胚囊 。 结果表明 ,处于完全孤立状态下的再生
胚珠 , 自分化启动以后即能按预先确定的发育程序完成大抱子发生和胚囊发育的复杂过程 。
由此推测 ,完成这个复杂过程是胚珠自控的 ,它不需要来自花芽或植株的任何信息 。
关锐词 风信子 ,离体再生胚珠 ;大抱子发生 ;胚囊发育
CYTOLOG IC A L OBS ERVAT ION ON MEGAS POROGEN SE sI AN D EMBRYO S AC
D EV ELOPMEN T OF REG ENE RATED OVULE NI HY ACNI TH
L u W
e n 一 li a n g a n d Q饭 n N a n 一 f e n
(翔吕瓦` 州她 of B o白 .梦 , A e俐卜爪自 从俪 ca , eB i inj g 10 0 0 4 4 )
K
.
E n o m o t o a n d Y
.
F u k u n a g a
(口口西胶沉 翔吕心“ . 白 oj P如” t 几 c几肋如夕梦 , H os on l一 2一 1 4 , C hi ga sa k l一 s h i J a Pa n )
A b s t r a C t
T h e m o r Ph o g e n e s is o f r e罗n e r a t e d o v u l e a n d e y t o l og i e a l e h a n g e s o f it s m e助 s P o r og e n e s is a n d
e m b r y o sa e d e v e l o Pm e n t w e r e s t u d ie d
.
R e s u lst s h o w e d a s f o ll o w s : 1
.
t h e d if f e r e n ti a t i o n o f t h e r e -
g e n e r a te d o v u l e h a d f o ll o w e d a n o r m a l P r o e e s i n th e o r d e r o f in n e r i n et gu m
e n t , o u et r i n t e g u m e n t
a n d t h e n f u n i e u l u s
.
B u t t h e f o r m o f t h e r e g e n e r a t e d o v u l e s 讯 砂汤 0 w a s q u i t e d if f e r e n t fr o m t h a t o f
o v u l e 葱界 . 坛, 0 . M o s t o f t he r e ge n e r a t e d o v u le s w e r e o r t h o t r o P o u s a n d h e m i a n a t r o P o u s , o n l y a f e w
收稿日期 : 19 9 2一 10一 13 接受日期 : 19 9 2一 1 1一 2 8
国家 自然科学基金资助课题 。
植 物 学 报 3 5卷
w e r e a n a t r o P o u s w h i e h a r e t h e sa m e w i t h th a t i
孔 , 么v o . 2 · t h e m e g a s P o r o g e n e s i s a n d t h e e m b r y o s a e
d e v e l o Pm e n t a ls o h a d n o rm a l c y t o lo g i c a l P r o c e s s
, a n d t h
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P o ly g o n u m t y P e
一 e m b r y o sa e c o n s is t e d
o f o n
e e g g
,
t w o s y n e r g id s
, o n e e e n t r a l e e ll a n d t h r e e a n t i Po d a l s e o u l d b e se e n in m a t u r e r e g e n e ar t
-
e d o v u l e
.
T h e s e e x
一
ep r lm e n t a l r e s u l t s m a k e c l e a r t h a t th e r eg
e n e r a t e d o v u l e d if f e r e n t i a t e d d i r e e it y
f r o m e xP l
a n t e o u ld a e e o m P li hs t h
e e o m P le x P r o e e s e s o f m e g a s Po r o g e n e s i s a n d e m b r y o s a e d
e v e l
-
o Pm e n t
.
B y t h is f a e t , a u t h o r s i n f e r t h a t o n e e t h e d i f f e r e n t ia t i o n o f o v u l e P r im o r d iu m
,
t h e e o m Pl e x
b i o e h e m i e a l P r o g r a m s f o r th e m e助 s o r o g e n e s i s a n d e m b r y o sa c d e V e 10 Pm e n t c a n b e e o n t r o l le d b y
t h e o v u le i st e l f a n d n e e d n o m o r e 恤 f o r m a t i o n ft o m f一o w e r b u d a n d / o r p l a n t .
K e y w o dr s 石匆a 疏凡ht 胜s 砰翻 at l葱s ; R e g e n e r a t e d o v u le 乞n ,汤 。 ; M e g a 8P o r og e n e s is ; Em b r y o sa e
d e v e lo P m e n t
离体培养诱导风信子外植体直接大量再生雌雄性器官的成功困 ,有可能建成一个组
织培养大量有性繁殖的实验系统 。 应用这个实验系统不但可以进行许多深入的生殖生物
学的实验研究 ,还可以探索试管有性杂交育种的可能性 。 要建成这样的实验系统 ,首先要
研究再生雌雄性器官在离体条件下是否可以完成大 、 小抱子的发生与发育 。 小抱子发生和
花粉发育的研究已经完成 .z[ 3〕 。 再生胚珠是否可在离体条件下发育成成熟的胚囊 ,及大抱
子发生和胚囊的发育是否具有正常的细胞学过程 , 以往未见报道 。本文报道这方面的研究
结果 。
材 料 和 方 法
(一 ) 植物材料
风信子 (抑ac 认ht 璐 , , at ils L . )栽培种 “ D e ift bl ue ” 。 3年生鳞茎用做实验 。 10 月下旬
将鳞茎埋入潮湿的沙中 ,在 3 ℃左右的温度中贮藏 2 个月后陆续用于实验 。
(二 )再生胚珠的诱导
取花粉处于 2 细胞晚期的花芽 ,按前文介绍的方法困分离花被接种到 M S 附加 6一B A P
2 m g / L 和 2 , 4一 D 0 . 1 m g / L 的培养基上培养 1 4 天 , 然后转移到 M S 附加 6一B A p 0 . 2 m g / L
和 2 , 4一 D 0 . 01 m g / L 的培养基上诱导胚珠从外植体上直接分化 。
(三 )再生胚珠培养成熟
在再生胚珠原基刚刚分化以后 ,就立即将培养瑞勿转移到 18 一20 ℃ 的条件下进行培
养 。 90 天左右再生胚珠即发育成熟 。 ,
( 四 )培养条件
实验材料接种以后置于每天 9 小时光照 , 15 小时黑暗 , 25 士 1℃和 18 一20 ℃ 的培养
箱中培养 。
(五 )细胞学观察
再生胚珠用纳瓦兴 l 固定 4j[ ,石蜡切片 ,切片厚 12 林m , P A S 反应和苏木精染色 1[] 。 在
普通显微镜及相差显微镜下观察及照相 。
7期 陆文裸等 : 风信子再生胚珠的大饱子发生和胚囊发育的细胞学观察
实 验 结 果
(一 )再生胚珠分化过程的形态学观察
风信子是百合科风信子属的一个种 ,在自然情况下胚珠是属于倒生型 。然而通过组织
培养形成的再生胚珠极大部分是直生型 (图版 I , 1一 3) 和半倒生型 (图版 工 , 4 、 5) ,真正的
倒生胚珠极少 。再生胚珠分化过程的形态学变花如下 , : 外植体上首先出现的是许多原基突
起 。原基稍稍长大以后 ,在其顶部出现二环形突起 ,这便是内珠被的分化 , 由内珠被包围的
部分便是珠心 。 随着珠心和内珠被的长大 ,环绕原基四周又出现一圈突起 ,它位于内珠被
的下部 ,这便是外珠被原基的分化 。进一步发育 ,外珠被生长较内珠被迅速 ,将内珠被和珠
心包围在里面 , 顶部收缩形成小孔即珠孔 。 收缩部分出现不规则肿胀结构 。 与此同时外珠
被以下与外植体相连接的部分迅速伸长形成珠柄 。 至此 ,整个结构发育成一个完整的胚
珠 。 珠柄在生长过程中不发生弯曲便发育成直生型胚珠 ;如在与珠心联接处发生弯 曲 , 按
弯曲的程度可以发育成半倒生胚珠和倒生胚珠 。
(二 )再生胚珠的大抱子发生和胚续发育
1
. 大泡子母细胞的分化 本研究观察表明 , 当再生胚珠的内珠被分化以后 ,在珠心的
中部即分化抱原细胞 。抱原细胞经 1次横分裂形成初生周缘细胞和初生大抱子母细胞 。 这
可以从再生胚珠分化初期的纵切片 (图版 I , 6) 中判断 。 这时珠心中部可观察到 已纵分裂
1次的周缘细胞和它下面 的初生大抱子母细胞 。 周缘细胞和初生大抱子母细胞之间的平
周细胞壁表明它们是由抱原细胞经过 1 次平周分裂而形成 。 初生大抱子母细胞以较大的
细胞核和较浓的细胞质与周 围的珠心细胞相区别 。 进一步生长 ,初 生大抱子母细胞长大 ,
逐渐发育成大抱子母细胞 ( 图版 I , 7 ) 。 这时它的体积更大 (一般比周 围的细胞大 5一 10
倍 ) , 外形为长圆柱形 ,但上下端壁为不规则的多角形 。 细胞核较大 ,细胞质很浓 。
2
. 大抱子母细胞 的减数分裂 本研究观察到的大抱子母细胞的减数分裂有两种类
型 : 一种是大抱子母细胞先进行 1 次分裂面垂直于珠心长轴的横分裂 , 即减数第 1 次分
裂 ,形成二分体 (图版 I , 8) ;然后二分体的两个细胞各横分裂 1次形成 4 个大抱子 。 另一
种类型如图版 I 图 9 所示 , 可能是当减数第 1次分裂以后 ,远离珠孔的那个二分体细胞停
止分裂 ,珠孔端的那个二分体细胞继续分裂 ,形成两个细胞后 ,靠近中部的 1个细胞又分
裂 l 次 ,共形成 3个细胞 ,与停止分裂的那个二分体细胞一起形成 4个大抱子 。 图版 I 图
9 中可以看到靠近中部的细胞正在分裂并处于分裂的后期 。
3
, 胚囊发育 4 个大抱子 ( 图版 I , 10 )有 3 个退化 , 留下的 1个发育形成胚囊 。 究竟
留下那个细胞 ,我们观察到的结果是靠近珠孔端的 3 个大抱子退化 ,合点端的那个大抱子
长大 (图版 I , 1 1 ) 。大抱子发育形成胚囊的过程是 :这个大抱子的体积逐渐增大 ,细胞质中
发育较大的液泡 ,液泡 中有细胞质束在穿流 。 由于大液泡的挤压 , 细胞核靠近细胞壁 。 以
后细胞核逐渐移向正中 。 与此同时 ,这个大抱子周 围的周缘细胞逐渐发育成珠心细胞 。 随
后大抱子开始第 1 次有丝分裂形成两个核 ,分裂后两个核与细胞质一起分别移向珠孔端
和合点端 (图版 I , 1 2 ) , 中部留下较大的液泡 。这两个核进一步分裂 ,最后形后成熟的胚囊
( 图版 I , 1 3) 。 成熟再生胚珠的连续纵切片表明 , 在珠孔端有一个卵细胞和两个助细胞 ;
( 图版 l , 1 、 2) 在合点端具有 3个反足细胞 ; (图版 l , 5 、 6 )( 本照片上 只能见到 2 个 ,还有
植 物 学 报 5 3卷
l个在另一张切片上 ) 以及在中部有一个很大的中央细胞 , 它占据了胚囊的极大部分体积
(图版 l , 3 、 4 ) 。 卵细胞的细胞核位于正中 ,直径约 20 一 24 协m ,核物质并不致密 ,其中有 1
个核仁 , 核膜清晰可见 。 卵细胞的细胞质层较厚 ,其中具有许多大小不等的液泡 ,助细胞位
于卵细胞基部的两侧 ,细胞核较致密 , 有 1 个核仁 。 细胞质中不能观察到液泡 。 卵细胞与
助细胞除了彼此接触外 , 它们都与珠孔端的胚囊壁以及中央细胞的细胞壁相接触 。 中央细
胞有 2 个细胞核 , 体积较大 , 直径约 43 一 47 以m , 核物质稀疏 , 核中具有 2一 3个核仁 ,核仁
致密 ,核膜明显可见 。细胞质中具明显的大液泡 ,致使一部分细胞质包围在核的外面 ,其余
的贴近细胞壁 。 本照片中 2 个极核已处于彼此融合的阶段 。 3个反足细胞的细胞核极为致
密 , 核中具有几个核仁 。 核外包围较厚的细胞质层 ,其中有较大的液泡 。 细胞质外可以清
楚地观察到细胞壁 。 3 个细胞分别与合点端的胚囊壁 以及中央细胞的细胞壁相接触 。
在本实验获得的再生胚珠中 , 曾观察到 l 个珠柄上发育上下两个珠心 ,并且两个珠心
中都能发育胚囊的现象 ( 图版 亚 , 7 、 8 ) 。
讨 论
本实验观察到的再生胚珠大部分是直生的和半倒生的 ,真正倒生的极少 。这与自然情
况下都是倒生的在形态上差别很大 。这种外形上的差别是否会影响其中性细胞的发育 ,我
们认为可能性不大 。 首先 自然界本来就存在各种类型的胚珠 ,并未发现胚珠类型上的差异
会影响其中性细胞的发育 ;其次 ,本实验中已经观察到各种类型的再生胚珠都能发育成熟
的胚囊 。 造成这种差异可能与再生胚珠在生长发育中外面无心皮包裹有关 。
通过对不成熟胚珠的离体培养来研究胚囊发育的条件曾有报道 〔5 , 。 离体条件下诱导
胚珠的直接再生 , 除风信子外尚未见到别的种成功的报道 。 从本实验结果来看 ,再生胚珠
在其发育过程中完成 了抱原细胞和大抱子母细胞的分化和发育 ,其细胞学变化无疑是正
常的 。 在观察到的 2 种大抱子母细胞的减数分裂类型中 ,虽然有一种类型不正常 (图版 I ,
9 )
,但这种不正常发生在减数第 2 次分裂的过程中 。 染色体数目的减数及各种细胞遗传学
变化基本上发生在减数第 1次分裂过程中 。 这样 ,减数第 2 次分裂不管在二分体的那个细
胞中发生 ,估计不会出现细胞遗传学上的变化 ,更何况 4 个大抱子中有 3 个要退化 ,仅 l
个发育成胚囊 。 事实上有 1 个二分体细胞停止分裂的现象在其它植物中曾多次观察到川 。
根据以上的分析 , 我们认为大抱子母细胞的减数分裂可以认为是正常的 。 以后 , 1个大抱
子发育成胚囊的细胞学过程 , 以及成熟胚囊的细胞学观察无疑也都是正常的 。 综上所述 ,
可以认为再生胚珠中大抱子发生和胚囊发育具有正常的细胞学过程 , 并且这种胚囊是属
于 8 核寥型 。
再生胚珠可以发育成熟胚囊的事实还表明胚珠分化以后进一步发育成熟的自控性 。
如上所述 ,胚珠从分化到发育成熟经历了极其复杂的细胞学过程 。本实验中所获得的再生
胚珠是完全孤立的 ,在它的发育过程中不能得到来自花芽或整个植株的任何信息 ,在这种
情况下 ,再生胚珠能按照一个预先决定的分化程序正确无误地完成这一系列生理 、 生化和
细胞学的过程 , 表明在胚珠分化的基因启动以后的进一步发育完全可以由这个器官本身
自控 ,它不需要来自花芽或整个植株的任何信息 。
7期 陆文裸等 :风信子再生胚珠的大抱子发生和胚囊发育的细胞学观察4 9 7
参 考 文 献
[1 〕
[2 〕
[3]
[4 〕
[5 〕
[ 6〕
〔 7〕
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D a v i d , K
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T
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S h e r w o od
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: 八 沙云加 0 s e x u a l an d a P o m i e t i e e m b r y o sa e d e v e l o Pm e n t i n C翻 e加哪 `已-
姗 15 . 凸m . J . 肠 t . , 口熟 2 0 5 3一 20 5 .7
uL
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E n o m o t o , Y
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F u k u n a g a a n d C
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K u o , 19 8 8
: R e g e n e r a t ion Of t叩 a ls , s t a m e n s an d o v u les i n e x P】a n ts f r om P e r l -
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M a h e s h w a r i
, P
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: A n Io t rod u ct i o n t
o the E m b r y o l o gy of A n ig os P
e rm s
.
N e w Y o r k : M e G r a w
一
H i l l
.
图 版 说 明
图 版
1
. 由风信子花被外植体直接再生的肛苦珠 。 x 6 2 . 直生型再生胚珠的外部形态 。 x 26 3 . 直生型再生胚珠的纵切
片 , 示外珠被 , 内珠被 ,珠心 ,珠柄和胚囊 。 欠 27 4 , 半倒 生型再生胚珠的外部形态 。 x 28 5 . 半倒生型再生胚珠的纵 切
片 ,示珠被 , 珠心 , 珠柄和胚囊 。 x 20 6一 10 ` 直生型再生胚珠的纵切片 , 示大抱子发生和胚囊发育 。 6 . 初生大抱子母
细胞 ( P M )和周缘细胞 ( P c ) 。 X 5 60 7 . 大抱子母细胞 ( M )S 。 X 8 40 8 . 大抱子母细胞减数分裂形成二分体 。 X 1 5 0 0
9
. 大饱子母细胞减数分裂形成四分体的一种类型 。 x 10 5 0 功 . 四分体 。 又 1 4 0 0 1 . 靠近珠孔端的 3 个大抱子退化 ,
靠近合点端的 l 个大饱子正在发育形成胚囊 。 x 90 o 1 2 . 大抱子第 1 次有丝分裂形成两个核 。 x l o 0 0 13 . 两个核进
一步分裂逐渐形成成熟胚囊 。 x l o s 。
图 版 l
l一 6 . 完整的直生 型再生成熟胚珠的连续纵切片 ,示 8 核胚囊 。 1 . 位于珠孔端的一个卵细胞 ( E c) 和两个助细胞
(s c )
。 只 4 2 2 . 卵细胞和 助细胞放大 。 E N 。 卵 细胞 的细胞 核 ; E c P 。 卵 细胞的细 胞质 。 x 5 2 0 3 . 中央细胞 ( c C ) 。
x 42 4
. 中央细胞放大 。 C N . 中央细胞的细胞核 ; C c P 。 中央细胞的细胞质 。 只 5 20 5 . 位于合点端的反足细胞 ( A )P 。
x 42 6
. 反足细胞放大 , 可观察到细胞壁 (c w ) 。 x 5 20 7 , 8 。 半倒生型再生胚珠的纵切片 , 示一个胚珠中发育两个珠
心 。 在珠心中可以观察到正在发育的雌配子体 。 X 4 0
E x P l a n a ti o n o f P l a t e s
P l a t e
F返 . 1 . T h e vo u l es d i r e e t l y r e g e I1er a t e d f r o m pe r 1a n t h e x Plan 切 Of h y a e in t h . 冰 6 F i g . 2 . E x r e r n a l f or m o f or t h o t r o P 0 u s r卜
g e n e r a t ed o vu l
e
.
X 2 6 Fi g
.
3
.
A l o n g i t u d in a l s e e ti o n o f or t h o t r o P o u s r e罗n e r a t ed o v u l e . s h o w i n g t h e ou t er in t e g u m e n t , in n e r in -
能 g u m e n t , n u c l u s , fu n icu lu s a n d the e m b r y o s a e . X 2 7 F i g . 4 . E x t e r n a l f o r m o f h e m讯 n a t r o P o u s r e g e n e r a t ed vo u l e . X 2 8
F i g
.
5
.
A 】o n沙 u d l n a l se e t i on of h e m ian a t r o po u s r e罗 n e r a t ed o v u 比 , sh ow in g t h e in t e g u m e n t s , n u e e l l u s , f u n e u l u s a n d e m b r y o sa e .
X 2 0 F妙 . 6一 1 0 . L o n gj t u d」n al s e e 吐的 s 时 or t h o tr o P o u s r路 e n o r a t司 vo u les , hs o w l n g m咒 a s P0 r明叨esj s an d d e v e l o P m en t of 叻 -
b r y o as e
.
F i g
.
6
.
T h e Pal le at l c e l s ( P C ) an d
the P r加 ar y m e s as p o roc y te ( P M ) . X 8 40 F i g . 7 . T h e m ge as Por oc y te ( M S ) . X
8 4 0 F zs
.
8
.
T h e’ d y ad f o rm 曰 by m e iot ic id v is i o n of ht e m e g as p o r oc y t e . X 15 0 0 F i s . 9 . o n e w盯 o f r o r m i n s t e t r a d by m e i -
ot i e d iv is ion
.
X 10 5 0 F i g
.
1 0
.
T h e t e t r a d
. 只 1 4 0 0 F地 . 1 1 . T h r e m铭 a s P or es n ae r b y m ic r o P y l a r e n d a ob r tde an d o n e
m e g aS P 0 r e n ae
r
by
c h a
alZ
a l e n d d e v e l o Pi n g in t o t h e e m b r y o as e
. 火 9 0 0 F i g . 1 2 . T w o n u e l e i for m de b y t h e f ir s t m i t ot i e d iv is ion
49 8 植 物 学 报 3 5卷
o f t h e m眼as po r e . X 1 0 0 0 Fi g . 1 3 . M a tu r e e m b r y o as e 肚 ad u a l ly f o rm in g . X 1 05 0
P la te l
F i g s
.
1一 6 . L o n颐 tu di n al e o n ti n u o u s s e e ti o n s o f w h fo e m a tu r e r雏 e n e ra t ed o v u le fO ro t h o t r PO o u s ty ep , s h o w in g s 一 n u e lea t e
em b
r y o sa
e
.
F ig
.
l
.
o n e e g g a n d t w o sy
n er g i d s by m i er
o
yP 姗 e n d i n e m b r y o s a e . 只 4 2 F i g . 2 . E n lar g ed f i g u r e of the e g a n d
s y n e r巨d s s h o w n in f堪u r e l · E N · e g g n u cl e u s ; E c P · e路 c y t o p」as m · X 5 2 0 F i g . 3 · T he cen t r a l e e l ( c c )
·
X 42 F i g
.
4
.
E n l a r g ed
f语u r e o f t比 e e n tr ia 优 115 s h o w n i n f i即 r e 3 · C N . n u cl e u s of cen t r a l e e l
·
c c P
·
e y t o p俪m a l o u n d t he n u e le u s . X 5 2 0 F i g . 5 . T h e
an t i P od a l
f ig u r
e 5
.
ce l s ( A P ) n ear b y
t h e hc a l a z a l e n d in t h e e m b r y o sa e
. 又 4 2 F i g , 6 . E n la r g de f i g u r e c e 】15 s h o w n i n
C W
.
C e l w a l
. 又 5 2 0 F地 5 . 7 , 8 . L o n g i t u d i n a l 鸽 e t ion s tw o n u郎 1 1 i n
t h e as m
e o v u l e , a n d r h e f e m al e 即m e t o P h y t e d e v d o P in g i n t比 m ·
o f h e m i a n a t roP o u s r e g
e n e r a t
de
又 4 0 0
o f t h e a n t i P od a l
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