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木鳖子素的分离与纯化
王秀琴 1, 李 檀2,白宗利 3,指导:贾天柱 3
( 1.辽宁省血栓病中西医结合医疗中心, 辽宁 沈阳 110101; 2. 沈阳市苏家屯区中医院, 辽宁 沈阳 110101;
3. 辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110032)
摘 要: 目的:分离纯化到单一组分的木鳖子素。方法: 木鳖子脱脂粉用磷酸盐缓冲液提取, 提取液用硫酸铵沉淀,
沉淀用水溶解后先上 CM Sepha rose Fast F low阳离子交换凝胶柱然后上 Sephacry lTM S - 200 H igh F low凝胶柱。结果:纯化
到单一组分的木鳖子素 ,分子量为 29000。结论: 该方法快速、稳定。
关键词: 木鳖子素; CM Sepharose Fast F low阳离子交换凝胶柱; Sephac ry lTM S - 200 H igh F low凝胶柱; 分子量
中图分类号: 284. 2 文献标识码: B 文章编号: 1000 - 1719( 2007) 01 -0078 - 02
Isolation and Pur ification ofCochinchin in
WANG X iu - q in1, LI Tan2, BA I Zong - li3, adviso r: J IA Tian - zhu3
( 1. L iaoning Provinca l ThrombusD isease T rea ting Cen ter, Shenyang 110101, L iaon ing, China; 2. Su jiatun D istrict
Hosp ita l o f TCM , Shenyang 110101, L iaoning, China; 3. L iaon ing University o f TCM, Shenyang 110032, L iaoning, Ch ina )
Abstrac t: Coch inch in in wa s separated and pu rified from the seed ex trac t o fM om o rdicaCochinchinensis, Chinese he rbalm ed-
icine mubiez,i by precipitation a t 30) 60% sa tu ra tion o f( NH4 ) 2 SO4, CM Sepha rose Fast F low and Sephacry l
TM S - 200 H igh
F low co lum n chrom a tog raphy. It p roved to be homogeneous by SDS) PAGE w ith a m olecu larw eight o f 29000.
K ey words: Cochinchinin; CM Sepharose Fast F low; Sephacry lTM S -200 H igh F low; mo lecu la rw eight
收稿日期: 2006 - 04 - 06
作者简介:王秀琴 ( 1968 - ) ,女,山东蓬莱人,副主任中药师,硕士,主要
从事蛋白的分离、纯化工作。
木 鳖 子 为 葫 芦 科 植 物 木 鳖 Momord ica
Coch inch inensis(Lour. ) Spreng. 的干燥成熟种子, 为
常用中药,具有散结消肿、攻毒疗疮之效,用于疮疡肿
毒、乳痈、痔漏、干癣、秃疮等 [1 ]。多外用, 很少内服。
本品有毒。木鳖子含皂苷, 其苷元为木鳖子酸。小鼠
腹腔注射皂甙 LD50为 37mg /kg[2]。
1987年,杨显荣等从木鳖子根中分得 1种具有引
产活性的木鳖根蛋白 (momo rcochin) [3]。 1989年, Bo-
legnesi andrea等从木鳖子中分离出了一种核糖体失活
蛋白 (momo rcochins)分子量 3000, 被认为是根中蛋白
M omorcochin的异构体。 1992年, 郑硕等从木鳖子中
分离出了一种单链核糖体失活蛋白, 称为木鳖子素
( coch inchinin)分子量 29000[4 ]。本文用 CM Sepharo se
Fast F low 阳离子交换凝胶柱和 Sephacry lTM S - 200
H igh Flow凝胶柱从种子中纯化到木鳖子素, 由于二者
均为快速分离胶,因此, 纯化效率有了极大的提高, 节
省了纯化时间。
1 仪器与试药
仪器: AKTA快速蛋白分离仪配有 215nm、254nm、
280nm三波长同时检测的紫外检测仪和全自动收集仪
(瑞士, Pharmacia ) ; LC - 10AT 高效液相色谱仪,
CLASS - 10A工作站, 色谱柱: B IOSEP SEC S - 2000
300@ 7. 8mm; Pow er PAC 300电泳仪 ( Ame rica B io -
RAD); TS - 1型脱色摇床 (江苏海门市麒麟医用仪器
厂 ) ;超滤膜 (美国产 10K和 39K) ; ZMQS50FOY M illi
-Q B ioce l超纯化净水器 (M o lsheim F rance ); AEU -
210分析天平 ( XIANGYI BALANCE FACTORY)。
试药: 木鳖子为葫芦科植物木鳖 Momord ica
Coch inch inensis(Lour. ) Spreng. 的干燥成熟种子; CM
Sepharose Fast F low ( Amersham Pharmacia B io tech );
Sephacry lTM S - 200 H igh Flow ( Ame rsham Pharmacia
B iotech); Low M o lecu larW e ight Ca libration K it for SDS
E lectrophoresis( Ame rsham B iosciences); 透析袋 (美国
产,孔径 10000 - 120000Mw,为 Amersham产品 ) ;磷酸
氢二钠、磷酸二氢钠等均为国产分析纯。
2 方法与结果
2. 1 木鳖子素的提取 取木鳖子 60. 0g研细, 分次置
于索氏提取器中用石油醚 ( 30e ~ 60e 沸程 )脱脂, 过
滤,减压回收石油醚, 残渣挥尽石油醚得脱脂粉 36g,
脱脂粉加 0. 02mo l /L、pH7. 0磷酸盐缓冲液 10倍量,
置冰箱中 4e 冷藏提取 5h,于冷冻离心机中, 在 4e 下
离心,至溶液澄清,得上清液,沉淀按上述再提取 2次,
合并 3次上清液, 得提取液。将提取液按硫酸铵饱和
度表中的量加入硫酸铵, 取 30% ~ 60%饱和度的沉
淀,用适量蒸馏水溶解, 透析, 待上 CM Sepha rose Fast
F low阳离子交换凝胶柱。
2. 2 木鳖子素的分离纯化 ①用 CM Sepharose Fast
F low对木鳖子素分离: CM Sepha rose FastF low用 pH=
7. 0, 0. 02mo l /L磷酸二氢钠 -磷酸氢二钠缓冲液洗
涤,脱气, 装柱 ( 2. 6cm @ 30cm )。将上述木鳖子提取
液, 吸附在 CM Sepharose Fast F low离子交换凝胶柱
上,首先用 pH = 7. 0, 0. 02mo l /L磷酸二氢钠 -磷酸氢
二钠缓冲液洗脱穿透峰部分,流速 1. 2mL /m in。用紫
外检测仪在 215nm、254nm、280nm检测, 至峰回到基
线时换 0~ 0. 3mol /L的 N aCL进行梯度洗脱, 收集有
紫外 ( 280nm )吸收的洗脱液即图谱中的 1部分, 得样
品 A。再用 1mo l /L NaCL洗脱杂质部分, 待峰回到基
线时换基础缓冲液即 pH = 7. 0, 0. 02mol /L磷酸二氢
钠 -磷酸氢二钠缓冲液平衡柱子,图 1。
图 1 CM Sepharose Fast F low对木鳖子素分离色谱图
②用 Sephacry lTM S - 200 H igh Flow对木鳖子素纯
化: Sephacry lTM S - 200 H igh Flow凝胶用 pH = 7. 2,
0. 02mol /L磷酸二氢钠 -磷酸氢二钠缓冲液洗涤, 脱
气,装柱 ( 1. 6cm @ 60cm )。取木鳖子的活性部位 A溶
液适量,浓缩后上 Sephacry lTM S - 200 H igh Flow凝胶
柱,用 pH = 7. 2, 0. 02mo l /L磷酸二氢钠 -磷酸氢二钠
缓冲液洗脱, 流速 0. 8mL /m in。用紫外检测仪检测
( 215nm、254nm、280nm ) , 收集有紫外吸收的部分, 即
图谱中的 2得到样品 B,图 2。
#78# 辽宁中医杂志 2007年第 34卷第 1期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2007.01.82.wangxq.055
收稿日期: 2006 - 06 - 15
作者简介:许正杰 ( 1954 - ) ,男,辽宁沈阳人,副主任药师, 主要从事中药制剂的生产及质量控制的研究工作。
图 2 Sephacry lTM S - 200 H igh Flow对木鳖子素纯化色谱图
2. 3 分子量测定 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳法
( PAGE )按国家药品监督管理局国家药品标准 2000
国药标字 XG - 031号。凝胶浓度 12%, 电压为恒压
200伏。标准蛋白为 Pharmacia提供, 分别为 Phopo ry-
lase b ( 97000)、A lbum in ( 66000)、Ovalbum in ( 45000 )、
Carbonic anhydrase ( 30000)、Trypsin inhibitor( 20100 )、
± - Lac talbum in ( 14400) , 测得相对分子量为 29000。
电泳结果见图 3。
图 3 木鳖子素的 SDS - PAGE
2. 4 纯度测定 采用高效液相色谱法,流动相: pH=
7. 2, 0. 02mol /L磷酸盐缓冲液 + 0. 05% N aN3; 流速:
1. 0mL /m in;检测波长: 280 nm;柱温: 20e 。
精密吸取样品 B 10LL, 注入高效液相色谱仪中,
按高效液相色谱法进行检测,得到色谱,见图 4。
图 4 木鳖子素的高效液相色谱
3 讨 论
木鳖子是一种常用中药,在临床上应用比较广泛,
但其作为一个有毒中药材, 尚缺乏对其质量进行有效
控制的方法,其用药质量控制工作亟待解决, 同时, 长
期以来,对于木鳖子的毒性,在化学成分上并没有给出
明确的答案,而木鳖子素是从种子中分离出的对细胞
有高毒性的新的核糖体失活蛋白, 它的分离将对木鳖
子的毒性研究提供科学依据。本实验方法具有简单、
快速、稳定、提取率高等优点。
参考文献
[ 1 ] 宋立人,洪恂,定绪亮,等.现代中药大辞典 (上册 ) [M ].北京:人
民出版社, 2001: 349 - 351
[ 2 ] 陈冀胜, 郑硕. 木鳖 Mom ord ica coch inch in ensis. 中国有毒植物
[M ].北京:科学出版社, 1987: 204
[ 3 ] Yeung, H. W. Isolation and characterization of an abortifacient p ro-
tein, M om orcoch in, from root tubers of M om ord ica coch in chinens is
( Fam ily Cu curb itaceae) [ J ]. In .t Pep tide Protein Res. , 1987, 30:
135
[ 4 ] 郑硕,李格娥,颜松民.木鳖子素的纯化和性质研究 [ J].生物化学
与生物物理学报, 1992, 24 ( 3) : 311
利胆排石散的质量标准研究
许正杰,田 原, 指导:刘桂芳
(辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110032)
摘 要: 目的:制定利胆排石散的质量标准。方法: 依照《中国药典》2005版一部, 采用薄层色谱法、高效液相法对
利胆排石散进行定性、定量测定。结果: 方中甘草、延胡索、大黄定性检出 ;黄芩以黄芩苷 ( C21H18O 11 )计 ,不得少于 10. 0
m g /g。结论: 方法简便快捷,精密度、稳定性、重现性良好, 可用于利胆排石散的质量控制。
关键词: 大黄素;延胡索乙素 ;薄层色谱法; 黄芩苷;高效液相色谱
中图分类号: 284. 1 文献标识码: B 文章编号: 1000 - 1719( 2007) 01 -0079 - 02
利胆排石散是辽宁中医药大学附属医院著名老中医
的经验方,主要由大黄、黄芩、延胡索等配制而成。用于
肝、胆管结石,总胆管结石,胆管炎等症。在质量标准制
定过程中,曾对方中主要几味药进行筛选,经反复试验,
采用薄层色谱法对方中大黄和延胡索定性检出;采用高
效液相色谱法对方中黄芩苷进行含量测定,结果表明:高
效液相色谱法测定黄芩苷的含量,准确可行。
1 仪器与试剂
仪器: UV - 1100紫外可见分光光度计 (北京瑞利
公司 )、ZF -Ⅰ型三用紫外分析仪 (上海顾村电光仪器
厂 )、Ag ilen t1100; 样品:利胆排石散:辽宁中医药大学
附属医院制剂中心提供;药材: 辽宁中医药大学附属医
院中药局提供; 对照品: 大黄素、延胡索乙素、黄芩苷
(中国药品生物制品检定所提供 ) ;试剂: 所用试剂均
为分析纯和色谱纯; 硅胶 G (青岛海洋化工有限公
司 )。
2 方法与结果
2. 1 大黄的鉴别 供试品溶液的制备:取本品 4. 5g,
加甲醇 80mL, 超声处理 30m in, 滤过, 滤液蒸干, 残渣
加水 60mL使溶解, 加盐酸 15mL, 水浴加热 30m in, 冷
却,用乙醚振摇提取 2次, 每次 40mL, 合并乙醚液, 回
收至干, 残渣加醋酸乙酯 2mL使溶解, 作为供试品溶
液。对照品溶液的制备:取大黄素对照品,分别加甲醇
制成每 1mL含 lmg的溶液, 作为对照品溶液。阴性液
的制备: 分别称取处方中各十分之一药量 (大黄除
外 ) ,同法制成大黄的阴性液。薄层层析鉴别: 按照薄
层色谱法 [中国药典 2005年版一部附录 V IB ]试验,吸
取上述 4种溶液各 10LL、2LL、5LL、10LL,分别点于同
一硅胶 G薄层板上,以石油醚 ( 30~ 60e ) -甲酸乙酯
-甲酸 ( 15B5B1)上层液为展开剂展开,取出,晾干, 置
紫外光灯 ( 365nm )下检视。结果: 供试品色谱中, 在与
对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,用
#79# 辽宁中医杂志 2007年第 34卷第 1期