全 文 :收稿日期:2013-10-18
基金项目:焦作市科技计划经费支持项目(201204001)
作者简介:赵利新(1964-),男,河南沁阳人,高级工程师,主要从事森林生态学和种质资源学研究。E-mail:zlx138@126.com
*通讯作者:张安世(1965-),男,河南博爱人,教授,硕士,主要从事植物分子生物学研究。E-mail:aszhang1212@163.com
珍稀濒危植物太行菊遗传多样性的RAPD分析
赵利新1,张安世2*,刘 莹2
(1.河南省国有焦作林场,河南 焦作454191;2.焦作师范高等专科学校 生物系,河南 焦作454003)
摘要:利用RAPD分子标记技术对太行山特有濒危物种太行菊8个自然居群的遗传多样性进行了
研究。用14条引物对8个居群的48个样品进行扩增,共得到149个扩增位点,其中多态性位点
123个,多态性百分率(PPL)为82.55%。POPGENE分析显示,太行菊具有较高的遗传多样性
[Nei’s基因多样性(H)=0.203 3,Shannon’s多样性指数(I)=0.323 0]。Nei’s遗传多样性分析
表明,8个自然居群间出现了较高的遗传分化(基因分化系数Gst=0.275 2,基因流Nm=1.316 6)。
生境的的片段化和基因流障碍可能是导致太行菊居群间遗传分化显著的主要原因。
关键词:太行菊;RAPD;遗传多样性;遗传分化;保护策略
中图分类号:S58 文献标志码:A 文章编号:1004-3268(2014)04-0106-04
Genetic Diversity Analysis of Rare and Endangered
Opisthopapus taihangensis(Ling)Shih by RAPD
ZHAO Li-xin1,ZHANG An-shi 2*,LIU Ying2
(1.Henan Province Jiaozuo National Forestry Farm,Jiaozuo 454191,China;
2.Department of Biology,Jiaozuo Teachers Colege,Jiaozuo 454003,China)
Abstract:The genetic diversity of eight natural populations of Opisthopapus taihangensis(Ling)
Shih was analyzed by random amplified polymorphic DNA(RAPD),14primers were selected to
amplify 48individuals of eight natural populations.Among the 149DNA loci obtained from 14
primers,123loci were polymorphic(PPL=82.55%).The results of POPGENE analysis indicated
that genetic diversity of Opisthopapus taihangensis(Ling)Shih was high(I=0.203 3,H=0.323 0).
The genetic diferentiation among eight populations was high(Gst=0.275 2,Nm=1.316 6),detected by
Nei’s genetic diversity analysis,and habitat fragmentation and barriers of gene flow might be the
main reasons of high genetic differentiation among eight populations.
Key words:Opisthopapus taihangensis(Ling)Shih;RAPD;genetic diversity;genetic differen-
tiation;conservation strategy
太行菊 [Opisthopapus taihangensis(Ling)
Shih]是一种仅分布于豫、晋、冀三省交界的太行山
区的特有珍稀物种,属多年生草本植物,高10~
15cm,主要生长在海拔1 000m左右的山坡上以及
悬崖峭壁的石缝中,具有清肝名目的作用[1]。由于
太行菊分布范围狭窄,生态环境独特,繁殖能力较
弱,加上人为采摘严重,已处于濒危状态,被河南省
列为珍稀保护植物[2]。
RAPD是由 Wiliams等[3]和 Welsh 等[4]于
1990年分别同时建立的一种采用10bp随机核苷
酸引物进行PCR扩增的分子标记技术。RAPD分
子标记技术以价格低廉、简便快捷、对DNA要求不
河南农业科学,2014,43(4):106-109
Journal of Henan Agricultural Sciences
DOI:10.15933/j.cnki.1004-3268.2014.04.027
高等优点,已经广泛应用于基因指纹图谱构建、种质
资源鉴定和遗传多样性分析等研究中[5-8]。本研究
利用RAPD技术对8个太行菊居群的遗传多样性
进行分析,旨在揭示太行菊自然居群的遗传结构和
遗传多样性水平,为有效保护太行菊这一宝贵的野
生资源提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 供试材料与主要试剂
2011年9月在8个太行菊居群共采集48个样
本(表1)。取健康叶片于冰壶中带回实验室置于
-80℃超低温冰箱保存备用。
2×Taq MasterMix(含有Taq DNA Polyme-
rase,2×Taq PCR Buffer,3mmol/L MgCl2 和400
μmol/L dNTP mix)购自北京康为世纪生物科技有
限公司,RAPD引物由金唯智生物科技(北京)有限
公司合成。
表1 太行菊各居群采样点信息
代码 地点
样本
数
海拔/
m
地理位置
1 山西红豆杉大峡谷 6 1 054 113°26′32.0″E,35°34′31.5″N
2 山西陵川大双村 6 1 175 113°26′21.0″E,35°33′31.6″N
3 辉县市潭头村 6 1 110 113°26′49.4″E,35°29′00.4″N
4 辉县市宝泉村 6 1 130 113°27′55.7″E,35°28′44.7″N
5 辉县市西沟 6 620 113°26′07.9″E,35°29′56.1″N
6 辉县市宝泉水库 6 850 113°29′35.4″E,35°28′07.3″N
7 焦作市净影寺 6 840 113°10′24.0″E,35°24′01.0″N
8 焦作市青龙峡 6 950 113°11′56.3″E,35°23′24.4″N
1.2 RAPD分析方法
太行菊总 DNA 提取采用改良 CTAB 法[9]。
RAPD扩增在9700PCR仪上进行,在10μL反应体系
中,各成分用量分别为:DNA(质量浓度为20ng/μL)
1.2μL,引物(浓度为30mmol/L)0.7μL,2×Taq
MasterMix 5.2μL,不足部分用 RNase-free water
补齐。扩增程序:94℃3min;94℃1min,35℃
1min,72℃2min,43个循环;72℃10min;4℃保
存。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶分离。
1.3 引物筛选及数据处理
选用40条RAPD引物,以48个太行菊样品进
行RAPD-PCR扩增,从中选取条带清晰、多态性好
的引物进行统计分析。利用POPGENE 1.32软件
计算多态性百分率(PPL)、Nei’s遗传一致性和遗
传距离、Nei’s基因多样性(H)、Shannon’s多样性
指数(I)、总群体基因多样性(Ht)、基因分化系数
(Gst)和基因流(Nm)。采用 NTSYSpc 2.10e软件
依据各居群Nei’s遗传一致性构建居群间UPGMA
聚类图。
2 结果与分析
2.1 RAPD引物筛选及扩增结果
利用40条RAPD引物对48个太行菊样品进
行PCR扩增,从中筛选出了14个条带清晰、多态性
好的引物,序列见表2。14条引物共扩增出149个
条带,每条引物扩增出7~14个条带,平均每条引物
扩增出10.6个条带。在物种水平上共有123个多
态性条带,多态性百分率为82.55%。在居群水平
上,多态性百分率在35.57%~46.98%,平均为
42.54%(表3),其中辉县市西沟居群和焦作市净影
寺居群的多态性百分率最高(46.98%),山西红豆杉
大峡谷居群的多态性百分率最低(35.57%)。
表2 RAPD引物编号与序列
引物编号 引物序列(5′→3′)
A1 CAGGCCCTTC
A2 TGCCGAGCTG
A4 AATCGGGCTG
A5 AGGGGTCTTG
A8 GTGACGTAGG
A10 GTGATCGCAG
A11 CAATCGCCGT
A13 CAGCACCCAC
A18 AGGTGACCGT
A20 GTTGCGATCC
B12 CCTTGACGCA
B15 GGAGGGTGTT
B17 AGGGAACGAG
B18 CCACAGCAGT
表3 太行菊8个居群的遗传多样性参数
代码
多态条
带数
多态性百
分率/%
Nei’s基
因多样性
Shannon’s
多样性指数
1 53 35.57 0.127 1 0.190 0
2 67 44.97 0.171 0 0.251 9
3 65 43.62 0.152 3 0.227 9
4 57 38.26 0.128 5 0.194 4
5 70 46.98 0.159 1 0.240 5
6 66 44.30 0.149 2 0.225 8
7 70 46.98 0.162 9 0.244 8
8 59 39.60 0.128 5 0.195 6
平均 63.38 42.54 0.147 3 0.221 4
物种水平 123 82.55 0.203 3 0.323 0
701 第4期 赵利新等:珍稀濒危植物太行菊遗传多样性的RAPD分析
2.2 太行菊各居群的遗传多样性
如表3所示,各居群的Nei’s基因多样性(H)在
0.127 1~0.171 0,平均Nei’s基因多样性H=0.147 3。
各居群的Shannon’s多样性指数(I)在0.190 0~0.251 9,
平均为0.221 4。在物种水平上,Nei’s基因多样性
H=0.203 3,Shannon’s多样性指数I=0.323 0。
从各居群的Nei’s基因多样性和Shannon’s多样性
指数可以看出,山西陵川县大双村和焦作市净影寺
的太行菊居群具有较高的遗传变异,山西红豆杉大
峡谷的太行菊居群遗传分化程度较低。
2.3 太行菊居群间的遗传分化
依据POPGENE分析结果,太行菊总的居群基
因多样性(Ht)为0.203 3,群体内基因多样性(H)
为0.147 3。居群间基因分化系数(Gst)为0.275 2,
表明:在太行菊的8个自然居群中,总遗传多样性有
27.52%来自居群间遗传变异,72.48%来自于居群
内的遗传变异,居群内的遗传分化大于居群间的遗
传分化。基因流Nm=1.316 6,说明太行菊各居群
间存在着低水平的基因交流,各居群间出现了一定
程度的遗传分化。
2.4 太行菊居群间聚类分析
利用POPGENE计算居群间遗传距离与遗传
一致性,结果显示,各居群的遗传距离在0.052 0~
0.111 5,平均为0.077 9,遗传一致性在0.894 5~
0.949 3,平均为0.925 1。其中山西红豆杉大峡谷和
山西陵川大双村两居群间遗传距离最小(0.052 0),
而辉县市潭头村和焦作市青龙峡居群间遗传距离最
大(0.111 5)。
利用NTSYS软件,依据 Nei’s遗传一致性进
行UPGMA聚类分析(图1)。当相似系数取0.927
时,这8个太行菊居群可分为三大组,其中山西红豆
杉大峡谷(1)、山西陵川县大双村(2)、辉县市潭头村
(3)和辉县市宝泉村(4)聚为一组,辉县市西沟(5)和
辉县市宝泉水库(6)聚为一组,焦作市净影寺(7)和
焦作市青龙峡(8)聚为一组。各居群间的遗传关系
与地理距离基本一致。
图1 太行菊居群间Nei’s遗传一致性的UPGMA聚类结果
3 讨论
3.1 太行菊的遗传多样性
本研究通过RAPD标记对太行菊8个居群的
分析表明:8个居群在物种水平上的多态性百分率
(PPL)为82.55%,Nei’s基因多样性(H)为0.203 3,
Shannon’s多样性指数(I)为0.323 0。3项指标均
显示太行菊居群在物种水平上具有较高的遗传多样
性。目前,针对特有种和濒危物种遗传多样性的研
究主要有2种观点。有些研究表明,特有种和狭窄
分布种的遗传多样性较低[10-11],而也有不少研究发
现,有些特有种和濒危物种保持较高的变异水
平[12-14],本研究结果与此结论一致。因此推测,太行
菊原本就拥有丰富的遗传基础,以后随着生境的破
坏,造成大量个体灭绝,幸存的个体将其祖先丰富的
遗传多样性保存了下来[15]。
3.2 太行菊的遗传分化
群体遗传变异的产生主要靠基因流和突变2种
方式[16],其中基因流对群体遗传分化具有重要影
响[17]。基因流增加了群体内部的遗传变化,高水平
的基因流可以防止种群的分化,而低水平的基因流
可能造成种群对局部生态环境的适应,进而促使种
群间的遗传隔离[18]。8个太行菊居群的基因分化系
数(Gst)为0.275 2,表明太行菊不同居群间出现了
一定的遗传分化,各群体间的基因流也处于较低水
平(Nm=1.316 6)。太行菊独特的生境可能对各群
体间的基因交流产生一定的隔离作用,从而导致太
行菊不同居群间出现一定程度的遗传分化。
3.3 太行菊的聚类分析
聚类结果基本反映了各居群间的地理位置关
系。如第1组山西的2个居群(1和2)距离最近,首
先聚在一起,第3组焦作市的2个居群(7和8)也聚
在了一起。但距离较近的辉县市的4个居群(3、4、5
和6)并未完全聚在一起,潭头村(3)和宝泉村(4)
2个居群与距离较远的山西2个居群(1和2)聚为
一组,辉县市的另外2个居群(5和6)单独聚为一
组。究其原因,可能是因为这些居群间的生态环境
极为相似[19],也可能这些距离较远的居群存在着遗
传交换[18]。
3.4 太行菊濒危机制的探讨
稀有或濒危植物的致濒机制研究是保护生物学
中的核心问题之一[20]。针对一些稀有或濒危物种
遗传多样性较高的特征,相关的研究指出致濒的直
接原因是生境的片断化、环境的变迁和人为干扰等
生态因素[21],同时与其本身的生殖障碍也有关
801 河南农业科学 第43卷
系[22]。太行菊主要生长在山坡及悬崖峭壁的石缝
中[1],生境险峻,分布狭窄,由此导致各群体间的基
因交流产生一定的隔离。同时,人为的挖掘采摘现
象日益严重,生境遭到破坏,再加上太行菊本身繁殖
能力较弱,最终导致太行菊群体范围逐步缩小,加剧
其濒危进程。
因此,保护太行菊的野生资源已迫在眉睫。保
护遗传多样性的重要手段之一是保护其生境,具体
应以就地保护为主,迁地保护为辅,加强太行菊保护
生物学的研究,为制定详尽的太行菊保护策略提供
科学依据。
参考文献:
[1] 丁宝章,王遂义.河南植物志(第三册)[M].郑州:河南
科学技术出版社,1998:632.
[2] 何敏杰,程月琴,王红卫,等.太行菊DNA提取和ISSR
标记的筛选与优化[J].中国农学通报,2012,28(16):
202-207.
[3] Wiliams J G K,Kubelik A R,Livak K J,et al.DNA
polymorphism amplified by arbitrary primers are useful
as genetic makers[J].Necleic Acids Res,1990,18(22):
6531-6535.
[4] Welsh J,Mc Cleland M.Finger printing genomes using
PCR with arbitrary primers[J].Necleic Acids Res,
1990,18(24):7213-7218.
[5] 刘韬,车建美,黄素芳,等.福建省主要杨桃品种遗传多
样性分析[J].果树学报,2011,28(3):448-452.
[6] 李健,范文洁,陈昕,等.不同地理种源雷公藤的RAPD
分析[J].四川农业大学学报,2011,29(3):327-333.
[7] 陈曦,汤庚国,郑玉红,等.苹果属山荆子遗传多样性的
RAPD分析[J].西北植物学报,2008,28(10):1954-
1959.
[8] 乔燕春,林顺权,何小龙,等.普通枇杷种内和种间杂种
苗的RAPD鉴定[J].果树学报,2010,27(3):385-390.
[9] 张安世,邢智峰,刘永英,等.苔藓植物DNA不同提取
方法的比较分析[J].河南科学,2009,27(5):559-562.
[10] 金则新,李钧敏.七子花种群遗传多样性的RAPD分
析[J].林业科学,2004,40(4):68-74.
[11] 谢国文,彭晓瑜,郑燕玲,等.濒危植物永瓣藤遗传多样
性的RAPD分析[J].林业科学,2007,43(8):48-53.
[12] 彭艳秋,邵剑文,张小平,等.珍稀濒危植物安徽羽叶
报春遗传多样性的 RAPD分析[J].云南植物研究,
2007,29(5):549-553.
[13] 李建辉,金则新,李钧敏.濒危植物长叶榧群体遗传多
样性的RAPD分析[J].应用生态学报,2007,18(12):
2661-2667.
[14] 陈俊秋,慈秀芹,李巧明,等.樟科濒危植物思茅木姜
子遗传多样性的RAPD分析[J].生物多样性,2006,
14(5):410-420.
[15] 金则新,李钧敏.珍稀濒危植物夏蜡梅遗传多样性的
ISSR分析[J].应用生态学报,2007,18(2):247-253.
[16] 曲若竹,侯林,吕红丽,等.群体遗传结构中的基因流
[J].遗传,2004,26(3):377-382.
[17] 由永飞,邓洪平.珍稀濒危植物金毛狗的SRAP分析
[J].西北植物学报,2012,32(4):688-692.
[18] 侯大斌,任正隆,舒光明.附子野生资源群体遗传多样
性的RAPD分析[J].生态学报,2006,26(6):1833-
1841.
[19] 陈曦,汤庚国,郑玉红,等.苹果属山荆子遗传多样性
的RAPD 分析[J].西北植物学报,2008,28(10):
1954-1959.
[20] 黄久香,庄雪影.观光木种群遗传多样性研究[J].植
物生态学报,2002,26(4):413-419.
[21] 葛颂,洪德元.濒危物种裂叶沙参及其近缘广布种泡
沙参的遗传多样性研究[J].遗传学报,1999,26(4):
410-417.
[22] 罗光佐,施季森,尹佟明,等.利用RAPD标记分析北
美鹅掌楸与鹅掌楸种间遗传多样性[J].植物资源与
环境学报,2000,9(2):9-13.
901 第4期 赵利新等:珍稀濒危植物太行菊遗传多样性的RAPD分析