全 文 ：作者简介:杨春荣 ,女 ,博士 ,副教授　　研究方向:药物新剂型的开发与研究　　＊通讯作者:田景奎 ,男 ,博士 , 教授　　研究方向:中药和天
然药物新药研究　　Tel:(0571)88208454　　E-mail:tjk@zju.edu.cn
拉毛果叶化学成分的研究
杨春荣 1 ,金艳霞 1, 2 ,张洁枝 2 ,张琳 2 ,付红伟 2 ,田景奎 2＊(1.黑龙江省生物制剂重点实验室 ,佳木斯大学化学与药学院 ,黑龙江
佳木斯 154007;2.教育部生物医学工程重点实验室 ,浙江大学生物医学工程与仪器科学学院 ,杭州 310027)
摘要:目的　研究拉毛果叶子的化学成分。方法 　采用硅胶柱及 SephadaxLH-20凝胶柱色谱法分离化合物 ,运用现代光谱
技术鉴定化合物结构。结果　从拉毛果叶中分离得到 6个化合物 ,分别鉴定为:β-胡萝卜苷(Ⅰ )、肥皂草苷(Ⅱ )、芹菜素-7-O-
β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)、异牡荆素(Ⅳ)、异荭草素(Ⅴ)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ )。结论　化合物Ⅰ ～ Ⅳ均为首次从该植
物中分离得到 , 其中化合物Ⅱ ～ Ⅵ 为首次从川续断属植物中分离得到。
关键词:拉毛果叶;肥皂草苷;黄酮
中图分类号:R284　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2010)08-0578-03
StudiesonChemicalConstituentsfromLeavesofDipsacussativus
YANGChun-rong1 , JINYan-xia1, 2 , ZHANGJie-zhi2 , ZHANGLin2 , FUHong-wei2 , TIANJing-kui2＊(1.KeyLa-
boratoryofBiologicalMedicinePreparationsofHeilongjiangProvince, ColegeofChemistry＆Pharmacy, JiamusiUniversity, Jiamusi
154007, China;2.KeyLaboratoryofBiomedicalEngineeringMinistryofEducation, DepartmentofBiomedicalEngineering, ZhejiangU-
niversity, Hangzhou310027, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　ToinvestigatethechemicalconstituentsfromtheleavesofDipsacusativus(Linn.)Honck..METHODS
　Thecompoundswereisolatedbyusingvariouscolumnchromatographictechniquesandtheirstructureswereelucidatedonthebasisof
spectralanalysis.RESULTS　Sixcompoundswereisolatedandidentifiedasβ-daucosterol(Ⅰ), saponarin(Ⅱ), apigenin-7-O-β-D-gluco-
pyranoside(Ⅲ), isovitexin(Ⅳ), isoorientin(Ⅴ)andluteolin-7-O-β-D-glucopyranoside(Ⅵ ).CONCLUSION　CompoundⅠ-Ⅵ werei-
solatedfromDipsacusativusforthefirsttime, andcompoundⅡ-Ⅵ wereisolatedfromtheDipsacusgenusforthefirsttime.
KEYWORDS:Dipsacussativus(Linn.)Honck..;saponarin;flavonoids
　　拉毛果 [ Dipsacussativus(Linn.)Honck.]又名
蓟果 、越绒草 ,土名洋菜篰 ,系川续断属植物 ,原产于
日本 ,浙江省余姚市于 20世纪 80年代引种成功 ,并
大面积栽培 。拉毛果的果实用于棉毛纺织工业 ,而
其叶子被当地居民泡水以代茶喝 ,具有消暑和防治
心脑血管疾病的作用 。对拉毛果叶子化学成分及药
理活性的研究未见报道 ,为探索其防治心脑血管疾
病的有效成分 ,我们对拉毛果叶的化学成分进行了
系统研究 ,从中分离得到 6个化合物 ,分别鉴定为 β-
胡萝卜苷(Ⅰ)、肥皂草苷(Ⅱ)、芹菜素-7-O-β-D-葡
萄糖苷(Ⅲ)、异牡荆素(Ⅳ)、异荭草素 (Ⅴ)、木犀
草素-7-O-β-D-葡萄糖苷 (Ⅵ )。化合物 Ⅰ ～ Ⅵ 均为
首次从该植物中分离得到 ,其中化合物 Ⅱ ～ Ⅵ 为首
次从川续断属植物中分离得到 。
1　仪器与材料
X-4数字显示显微熔点测定仪(北京泰克仪器
有限公司), BrukerDPX-500核磁共振仪(TMS内
标),循环水式多用真空泵(河南省泰康科教器材
厂);EYELAwaterbathSB-2000旋转蒸发仪(东京
理化器械株式会社);YOKO-ZF三用紫外线分析
仪(武汉药科新技术开发有限公司);柱色谱用硅胶
(青岛海洋化工厂);SephadexLH-20(瑞士 Phar-
macia公司);试剂为化学纯或分析纯 。
拉毛果叶采自浙江省余姚市 ,经浙江大学生物
医学工程与仪器科学学院张琳博士鉴定为 Dipsacus
sativus(Linn.)Honck.的干燥叶。
2　提取与分离
拉毛果干燥叶 3.25 kg,经体积分数 70%的乙
醇超声提取 2次 ,每次 2 h,合并提取液 ,滤过 ,减压
浓缩至无醇味 。加水稀释至 1 g· mL-1 ,离心后 ,取
上清液缓缓通过 AB-8大孔树脂色谱柱 ,放置 30
min,使药液与树脂充分吸附 。水洗脱 ,再分别用体
·578· ChinPharmJ, 2010April, Vol.45No.8　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2010年 4月第 45卷第 8期
积分数 70%乙醇及 95%乙醇洗脱 ,弃去水洗脱液部
分 ,收集 70%乙醇和 95%乙醇部分 ,浓缩得浸膏
256.6g。经硅胶柱色谱 ,以氯仿-甲醇(1∶0※ 6∶4)
梯度洗脱 , TLC检测合并得 4个流分 ,第 1流分经硅
胶色谱柱色谱 ,氯仿-甲醇(95∶5)为溶剂梯度洗脱 ,
重结晶得化合物 Ⅰ (65 mg);第 2流分经反复硅胶
色谱柱色谱 ,氯仿 -甲醇(1∶0 ※ 6∶4)为溶剂梯度洗
脱 ,经 SephadexLH-20纯化 ,得化合物 Ⅲ(20 mg)、
化合物 Ⅵ (20mg)、化合物Ⅳ(10 mg);第 3流分经
硅胶色谱柱色谱 , SephadexLH-20纯化得化合物
Ⅲ(100 mg);第 4流分经硅胶色谱柱色谱 , Sephadex
LH-20纯化得化合物Ⅴ(50mg)。
3　结构鉴定
化合物 Ⅰ :白色粉末 (氯仿-甲醇), mp294 ～
296℃。 10%硫酸-乙醇溶液显紫色。薄层 Rf值与
标准品 β-胡萝卜苷一致 。混合后的熔点不下降 ,鉴
定为 β-胡萝卜苷 。
化合物 Ⅱ:黄色粉末 (MeOH), mp228 ～ 230
℃, 盐酸-镁粉反应阳性 ,三氯化铁反应阳性 , Molish
反应阳性。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:13.58
(1H, s, C-5-OH), 10.40(1H, brs, 4′-OH), 7.97(2H,
d, J=8.7 Hz, H-2′, 6′), 6.93(2H, d, J=8.7 Hz, H-
3′, 5′), 5.00(1H, d, J=6.8 Hz, H-1″O-glucose),
4.66(1H, d, J=9.8 Hz, H-1 , C-glucose);13C-NMR
(125 MHz, DMSO-d6)δ:164.0(C-2), 103.1(C-3),
181.8(C-4), 159.2(C-5), 110.4(C-6), 162.0(C-
7), 93.4(C-8), 156.2(C-9), 104.8(C-10), 120.6
(C-l′), 128.3(C-2′, 6′), 115.8(C-3′, 5′), 161.2(C-
4′), 101.1(C-1″), 73.0(C-2″), 75.6(C-3″), 69.5
(C-4″), 77.2(C-5″), 60.3(C-6″), 73.8(C-l ), 72.6
(C-2 ), 78.9(C-3 ), 70.8(C-4 ), 80.9(C-5 ),
60.7(C-6 )。以上数据与文献 [ 1-2]报道的肥皂草苷
基本一致。
化合物 Ⅲ:乳白色粉末 (MeOH), mp216 ～
218 ℃,盐酸-镁粉反应阳性 ,三氯化铁反应阳性 ,
Molish反应阳性。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:
3.17 ～ 4.59(5H, m, Glc-H), 5.36(1H, d, J=4.3
Hz, H-1″), 6.45(1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.83(1H,
d, J=2.0Hz, H-8), 6.87(1H, s, H-3), 6.95(2H, d,
J=8.7 Hz, H-3′, 5′), 7.97(2H, d, J=8.7 Hz, H-2′,
6′), 10.38(1H, s, 7-OH), 12.96(1H, s, 5-OH);13C-
NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ:164.2(C-2), 103.0
(C-3), 181.9(C-4), 156.9(C-5), 99.5(C-6), 162.9
(C-7), 94.8(C-8), 161.3(C-9), 105.3(C-10),
120.9(C-1′), 128.5(C-2′, 6′), 115.9(C-3′, 5′),
161.0(C-4′), 99.9(C-1″), 73.0(C-2″), 76.4(C-
3″), 69.5(C-4″), 77.1(C-5″), 60.6(C-6″)。以上数
据与文献 [ 3] 报道的芹菜素 -7-O-β-D-葡萄糖苷基本
一致 。
化合物Ⅳ:橙黄色结晶(MeOH), mp198 ～ 200
℃,盐酸-镁粉反应阳性 , 三氯化铁反应阳性 , Mol-
ish反应阳性。1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:
13.12(1H, s, 5-OH), 10.81(1H, s, 7-OH), 10.32
(1H, s, 4′-OH), 8.03(2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, 6′),
6.89(2H, d, J=8.4 Hz, H-3′, 5′), 6.77(1H, s, H-
3), 6.27(1H, s, H-6), 4.69(1H, d, J=9.8 Hz, H-
1″);13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ:162.9(C-2),
102.4(C-3), 181.3(C-4), 160.8(C-5), 109.4(C-
6), 161.6(C-7), 94.4(C-8), 157.5(C-9), 102.0(C-
10), 121.1(C-1′), 128.4(C-2′, 6′), 116.2(C-3′,
5′), 160.8(C-4′), 73.3(C-1″), 70.8(C-2″), 78.6
(C-3″), 70.5(C-4″), 81.8(C-5″), 61.3 (C-6″)。以
上数据与文献 [ 4]报道的异牡荆素相对照一致 。
化合物Ⅴ:黄色粉末(MeOH), mp245 ～ 246℃,
盐酸 -镁粉反应阳性 , 三氯化铁反应阳性 , Molish反
应阳性。1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ:13.56
(1H, s, 5-OH), 7.44(1H, d, J=8.0 Hz, H-6′), 7.40
(1H, s, H-2′), 6.89(1H, d, J=8.0 Hz, H-5′), 6.67
(1H, s, H-3), 6.48(1H, s, H-8), 4.59(1H, d, J=9.7
Hz, H-1″);13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ:163.2
(C-2), 102.8(C-3), 181.8(C-4), 160.6(C-5),
108.8(C-6), 163.6(C-7), 93.5(C-8), 156.2(C-
9), 103.3(C-10), 121.4(C-1′), 112.9(C- 2′),
145.7(C-3′), 149.7(C-4′), 116.0(C-5′), 118.9(C-
6′), 73.0(C-1″), 70.5(C-2″), 78.9(C-3″), 70.2
(C-4″), 81.5(C-5″), 61.4(C-6″)。以上数据与文
献[ 5]报道的异荭草素基本一致 。
化合物 Ⅵ :淡黄色颗粒状结晶 (MeOH), mp
258 ～ 260 ℃,盐酸-镁粉反应阳性 , 三氯化铁反应阳
性 , Molish反应阳性 。1 H-NMR(500 MHz, DMSO-
d6)δ:12.98(1H, s, 5-OH), 9.98(1H, s, 3′-OH),
9.38 (1H, s, 4′-OH), 7.44(1H, dd, J=8.5, 2.5 Hz,
H-6′), 7.41(1H, dd, J=2.5 Hz, H-2′), 6.89(1H,
d, J=8.5 Hz, H-5′), 6.77(1H, d, J=2.0 Hz, H-8),
6.74 (1H, s, 3-H), 6.43 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6),
5.38(1H, d, J=8.0 Hz, H-1″), 3.0 ～ 3.8(5H, m,
Glc-H);13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6)δ:164.4(C-
·579·中国药学杂志 2010年 4月第 45卷第 8期　　　　　　　　　　　　　　　 ChinPharmJ, 2010April, Vol.45No.8
2), 103.1(C-3), 181.8(C-4), 161.1(C-5), 99.5(C-
6), 162.4(C-7), 94.7(C-8), 156.9(C-9), 105.3(C-
10), 121.3(C-1′), 113.5(C-2′), 145.7(C-3′),
149.8(C-4′), 115.9(C-5′), 119.1(C-6′), 99.9(C-
1″), 73.0(C-2″), 76.3(C-3″), 69.5(C-4″), 77.1(C-
5″), 60.5(C-6″)。以上数据与文献 [ 6]报道的木犀草
素 -7-O-β-D-葡萄糖苷基本一致 。
REFERENCES
[ 1] 　 MIROSLAWAKB, WOJCIECHC.FlavoneC-glycosidesfrom
BryoniaalbaandB.dioica[ J] .Phytochemistry, 1995, 39(3):
727-729.
[ 2] 　ABOU-ZAIDMM, LOMBARDODA, KITEGC, etal.Acylated
flavoneC-glycosidesfromCucumissativus[ J] .Phytochemistry,
2001, 58(1):167-172.
[ 3] 　YANGNY, DUANJA, LIP, etal.FlavonoidsfromGlechoma
longituba(Nakai)Kupr[ J].JChinPharmUniv(中国药科大学
学报), 2005, 36(3):210-212.
[ 4] 　LINL, XIEN, CHENGZ.FlavonoidsfromCajanuscajanL[ J].J
ChinPharmUniv(中国药科大学报), 1999, 30(1):21-23.
[ 5] 　PENGJY, FANGR, HONGZY.Preparativeseparationofisovi-
texinandisoorientinfromPatriniavillosaJussbyhigh-speed
counter-currentchromatography[ J].JChromatogrA, 2005, 1074
(1-2):111-115.
[ 6] 　HUANGKY, HEL, QUY, etal.Isolationandidentificationof
chemicalconstituentsfrom rootsofPicrorhizascrophulariflora
pennel[ J] .JShenyangPharmUniv(沈阳药科大学学报),
2009, 26(2):112.
(收稿日期:2009-09-08)
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30572182);卫生部卫生公益性行业科研专项经费项目(200802041)
作者简介:宫丽丽 ,女 ,博士研究生　　研究方向:心脑血管药理学与新药发现　　＊通讯作者:方莲花 ,女 ,博士 ,副研究员 ,硕士生导师　　研
究方向:心脑血管药理学与新药发现　　Tel:(010)63165313　　Fax:(010)63165184　　E-mail:fanglh@imm.ac.cn
Rho激酶抑制剂的高通量筛选模型建立与应用
宫丽丽 ,方莲花＊ ,彭健豪 ,何国荣 ,杜冠华(中国医学科学院-北京协和医学院药物研究所 ,北京 100050)
摘要:目的　建立重组人 Rho激酶(Rho-associatedcoiled-coilformingproteinkinase, ROCK)的表达 、纯化方法 ,并建立基于荧光
素酶发光法的 ROCK抑制剂的高通量筛选(highthroughputscreening, HTS)模型 , 通过大规模筛选发现其选择性抑制剂 ,为心
脑血管 、神经系统等疾病的预防和治疗提供新的治疗策略。方法　用分子生物学的技术 ,构建 ROCK-Ⅰ /pET32a表达质粒 ,转
化入大肠杆菌 BL21中 , 筛选阳性克隆 ,诱导目的蛋白表达。纯化可溶性蛋白后 , 用 Kinase-GloLuminescentKinaseAssay进行
活性鉴定 , 用 Z因子评价 HTS方法的稳定性 , 并对 3万个化合物和中药提取物进行了 HTS。结果　重组人 ROCK-Ⅰ 蛋白显
示较好的激酶活性 , 建立的 HTS模型 Z因子为 0.75, 基于此模型筛选出 4个活性化合物和 5个活性提取物。结论　本实验
建立了一个简单而快速的人重组 ROCK-Ⅰ表达系统 , 该系统具有低成本 、稳定 、表达量大等特点。 ROCK-Ⅰ的化学发光检测
方法适用于 HTS技术 ,具有较高的稳定性 、灵敏性和可重复性。
关键词:Rho激酶;高通量筛选;表达;大肠杆菌;化学发光
中图分类号:R965　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2010)08-0580-05
DevelopmentofHighThroughputScreeningMethodforRhoKinaseInhibitors
GONGLi-li, FANGLian-hua＊ , PENGJian-hao, HEGuo-rong, DUGuan-hua(InstituteofMateriaMedica, ChineseA-
cademyofMedicalScience＆PekingUnionMedicalCollege, Beijing100050, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　ToscreennewRhokinase(Rho-associatedcoiled-coilformingproteinkinase, ROCK)inhibitorsforthe
preventationandtreatmentofthecardiovasculardiseasesandnervoussystemdiseasesandtoestablishaluminescentbasedhigh
throughputscreening(HTS)model.METHODS　ThecDNAencodingtheaminoacids3-543 ofhumanROCK-Ⅰ wasamplified
andsubclonedintopET32aexpressionvectortoexpresstheproteininEscherichiacoli(E.coli)BL21 (DE3)assolubleprotein.The
kinaseactivityofthepurifiedROCK-Ⅰ wasdeterminedwithKinase-GloLuminescentKinaseAssaykit.Z wasusedtoevaluatethe
assayqualityofHTS.RESULTS　RecombinanthumanROCK-Ⅰ showedwellkinaseactivity.TheparameterZ was0.75, which
showedahighfeasibilityandstabilityoftheassay.Totalcompoundsabout30 000 werescreened, and4 compoundsand5 extracts
showedtheinhibitionforRhokinaseactivity.CONCLUSION　Aneasyandrapidprocedurewasestablishedtoharvestalargequanti-
·580· ChinPharmJ, 2010April, Vol.45No.8　　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2010年 4月第 45卷第 8期