全 文 ：HPD100大孔吸附树脂分离纯化香青兰中木犀草素的研究
魏改芹 1 , 　邢建国 2＊ , 　何承辉2 , 　翟科峰 1
(1.石河子大学药学院 ,新疆 石河子 832002;2.新疆维吾尔自治区药物研究所 ,新疆 乌鲁木齐 830000)
收稿日期:2007-12-10
基金项目:新疆维吾尔自治区重点实验室开发课题(xjys0207-2006-02)。
作者简介:魏改芹(1981-),女 ,硕士生 ,研究方向:中药新剂型与新制剂。电话:13579297892。
＊通讯作者:邢建国(1968-),男 ,硕士 ,研究方向:中药新剂型与新制剂。电话:0991-2318172。
关键词:香青兰;木犀草素;大孔吸附树脂
摘要:目的:进行不同型号大孔吸附树脂分离纯化香青兰总黄酮的工艺研究。方法:比较了 7种不同型号大孔吸附树脂
对香青兰中木犀草素的吸附性质。结果:HPD100树脂对香青兰中木犀草素具有很好的吸附特性 ,并对其吸附动力学特
性进行了系统的研究 ,确定其工艺参数为上样液浓度 240 μg/mL, 吸附时间不低于 6 h, 吸附速度 1 ～ 2 BV/h, 洗脱速度 1
～ 5 BV/h, 70%乙醇洗脱 4 BV。结论:HPD100树脂最适合于香青兰中黄酮的纯化。
中图分类号:R284.1　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2008)11-1608-04
　　香青兰 [ 1] 为唇形科植物香青兰 Dracocephalum
MoldevicaL.的干燥地上部分 ,是新疆地产维吾尔
药 ,又名巴德兰吉布亚。最早记载于维吾尔古典
“买克散艾地维 ”(波斯文),至今已有 500多年历
史 。香青兰主要含有黄酮类 、挥发油 、萜类 、氨基酸 、
微量元素等 [ 2] 。在维吾尔医药中用于治疗冠心病 、
心绞痛 、动脉粥样硬化 、高血压 、心肌缺血等疾
病 [ 3] 。目前研究表明 ,黄酮类化合物能防治心脑血
管系统和呼吸系统的疾病 ,具有抗炎抑菌 、降血糖以
及增强免疫功能等药理作用 ,且以木犀草素为代表
的黄酮类成分被认为具有降低血压 、改善高血脂症
状等作用。香青兰药材含有木犀草素 ,所以本实验
以香青兰中木犀草素含量为指标 ,进行了不同型号
大孔吸附树脂分离纯化香青兰总黄酮的工艺研究 ,
为进一步开发利用香青兰提供了一种纯化方法 。
1　仪器与试药
SPD-10AVP型高效液相色谱仪(日本岛津制造
所);LibrorAEG-200电子天平 (日本岛津制造所);
Miliporesimplicity-185超纯水器 (美国密理博公
司);LS-3120超声波发生器(美国科学系统公司);
木犀草素对照品(批号 111520-200504)由中国药品
生物制品检定所提供;D101大孔吸附树脂(购于天
津海光化工有限公司);AB-8大孔吸附树脂 (购于
南开大学化工厂 );HPD100, HPD100A, HPD300,
HPD600, HPD700大孔吸附树脂(购于沧州宝恩化
工有限公司);甲醇为美国 Fisher公司生产色谱纯;
水为双蒸水;其它试剂均为分析纯。
2　含量测定方法
2.1　色谱条件
色谱柱:Shim-packVP-ODS(4.6mm×250 mm,
5μm);流动相:甲醇-0.4%磷酸(47∶53);检测波长
350 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:35℃。
2.2　供试品溶液的制备方法
取香青兰粉碎(过 10目和 40目筛),精密称取
1g,置 50mL量瓶中 ,加入 40%乙醇 40 mL,回流提
取 6 h,放置至室温 ,加 40%乙醇至刻度 ,滤过 ,取续
滤液 ,过 0.45μm微孔滤膜 ,备用。
2.3　线性关系考察
精密称取木犀草素对照品 10.88 mg,置 10 mL
量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得木犀
草素对照品贮备溶液(1 088 μg/mL)。分别精密吸
取对照品贮备液 1, 1.5, 1, 1, 0.1 mL,分别置 10, 50,
50, 100, 100 mL量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,
制成含木犀草素浓度为 108.8, 32.64, 21.76,
10.88, 1.088μg/mL的对照品系列溶液。从中分别
精密吸取 10μL,注入液相色谱仪 ,记录峰面积。以
进样浓度(μg/mL)为横坐标 ,峰面积为纵坐标进行
回归 , 得回归方程:Y=30 209X+232.14, r=
0.999 7。结果表明 ,木犀草素在 1 088 ～ 1.088 μg/
mL范围内 ,峰面积与进样浓度具有良好线性关系。
2.4　精密度试验
照 “ 2.2”项下方法制得供试品溶液 1份 ,连续
进样 5次 ,每次 10 μL,根据 5次的峰面积 ,计算木
犀草素的 RSD=0.50%(n=5)。
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3　大孔吸附树脂工艺参数考察
3.1　大孔树脂预处理 [ 4]
以 95%乙醇浸泡树脂 24 h,充分溶胀后湿法装
柱 ,以 95%乙醇洗至流出液加水(乙醇∶水 =1∶5)不
显浑浊为止 ,然后以大量蒸馏水洗去乙醇 ,至水洗液
无醇味为止 。
3.2　上柱药液的制备
取香青兰粗粉(过 10目和 40目筛),加 40倍量
40%乙醇加热回流提取 1次 6 h,过滤 ,滤液离心后
回收乙醇浓缩至无醇味 ,加适量热水搅拌使溶解 ,备
用 。
3.3　树脂型号的筛选
3.3.1　静态吸附与解吸
大孔吸附树脂型号很多 ,根据文献报道[ 5] ,弱
极性和极性树脂比较适用于黄酮类成分的分离纯
化 。本 试验选 择的树脂 型号为 AB-8, D101,
HPD100, HPD100A, HPD300, HPD600和 HPD700。
取 7种处理好的干树脂(先按 3.1项下大孔树
脂预处理方法处理大孔树脂 ,然后将处理好的大孔
树脂抽干)各 1 g,置于锥形瓶中 ,分别加入香青兰
水溶液 10mL(生药材含量为 0.02 g/mL,木犀草素
含量为 40.1 μg/mL),每隔 10min振摇 20 s,持续 2
h,静置 24 h后 ,过滤 ,滤液用水定容至 50 mL量瓶
中 ,液相检测 ,计算各树脂的吸附量 、吸附率。
将静态吸附过滤完毕后的树脂再移回锥形瓶 ,
加 20mL70%乙醇解吸 ,每隔 10 min振摇 20 s,持
续 2 h,静置 24 h后 ,过滤 ,滤液用 70%乙醇定容至
50 mL量瓶中 ,液相检测 ,计算各树脂的解吸率 ,结
果见表 1。
表 1　7种树脂对香青兰中木犀草素的吸附率及解吸率
树脂型号 吸附量 /(μg/g) 吸附率 /% 解吸率 /%
AB-8 197.9 49.34 8.48
D101 236.8 59.04 16.69
HPD100 353.3 88.09 43.40
HPD100A 210.1 52.39 17.07
HPD300 321.4 80.12 36.90
HPD600 401.1 100.00 41.18
HPD700 289.0 72.06 16.05
　　由表 1可知 , 7种树脂的吸附率与解吸率各不
相同 ,其中以 HPD100和 HPD600的吸附和解吸效
果较好 。
3.3.2　HPD100与 HPD600的动态吸附比较
取处理好的 HPD100与 HPD600干树脂 (先按
3.1项下大孔树脂预处理方法处理大孔树脂 ,然后
将处理好的大孔树脂抽干)各 5g于 1.4cm×30 cm
色谱柱内 ,上样 80mL(生药材含量为 0.02g/mL,木
犀草素含量为 40.1 μg/mL),静置过夜后 , 先后用
水 , 30%, 50%, 70%, 95%乙醇洗脱 ,两树脂相同处
理 ,计算各部分的转移率 ,选出较好树脂 ,结果见表 2。
表 2　 HPD100与 HPD600的动态吸附比较结果
树脂型号 各洗脱部位转移率 /%
30% 50% 70% 合计
HPD100 0.2 64.9 35.2 100
HPD600 4.6 70.7 9.7 85
　　由表 2可知 , HPD100优于 HPD600树脂 ,且目
标成分主要集中在 50%和 70%部位 ,所以本试验选
择 HPD100树脂 ,并进一步考察洗脱醇浓度 。
3.4　洗脱醇浓度的考察
取处理好的 HPD100干树脂 (先按 3.1项下大
孔树脂预处理方法处理大孔树脂 ,然后将处理好的
大孔树脂抽干)5 g(柱体积 20 mL)于 1.4 cm×30
cm色谱柱内 ,上样 80 mL(生药材含量为 0.02 g/
mL,木犀草素含量为 40.1 μg/mL),平行两份 ,静置
过夜后 ,一份水洗后用 50%和 70%乙醇两个梯度洗
脱 ,另一份水洗后直接用 70%乙醇洗脱 ,洗脱液液
相检测 ,结果见表 3。
表 3　 洗脱醇浓度考察结果
洗脱醇浓度 洗脱部位木犀草素转移率 /%
50%乙醇洗脱部位 70%乙醇洗脱部位 合计
50%乙醇 +70%乙醇 14.65 78.69 93.35
70%乙醇 — 95.71 95.71
　　由表 3可知 ,直接用 70%乙醇洗脱木犀草素转
移率 ,优于 50%和 70%两个梯度洗脱木犀草素转移
率 ,所以本试验选择水洗后直接用 70%乙醇洗脱。
3.5　HPD100最大上样量考察
取处理好的 HPD100干树脂 (先按 3.1项下大
孔树脂预处理方法处理大孔树脂 ,然后将处理好的
大孔树脂抽干)5 g于 1.4 cm×30 cm色谱柱内 ,精
密吸取香青兰水溶液(生药材含量为 0.05 g/mL,木
犀草素含量为 97.4μg/mL)上柱 ,以 1.5BV/h的流
速进行动态吸附 ,分段收集流出液 ,每 10 mL收集 1
份 ,共收集了 32份。每份流出液依法测定木犀草素
含量 ,绘制泄露曲线 ,见图 1。
图 1　动态吸附泄漏曲线图
　　由图 1可知 ,第 25份收集样即第 250 mL(即
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12.5倍树脂床体积)时 ,木犀草素开始明显泄露 ,故
确定最大上样量为 240 mL(即 12倍树脂床体积)。
3.6　上样液吸附流速的考察
取处理好的 HPD100干树脂(先按 3.1项下大
孔树脂预处理方法处理大孔树脂 ,然后将处理好的
大孔树脂抽干)5 g(柱体积 20 mL)分别装于 4根
1.4cm×30 cm色谱柱中 ,精密加入香青兰水溶液
(生药材含量为 0.05 g/mL,木犀草素含量为 97.4
μg/mL)40mL,吸附速度分别为 0.5 BV/h, 1.0BV/
h, 2.0 BV/h, 5 BV/h。上样后 ,静置 2 h,然后先用 5
BV水洗脱 ,再用 5BV70%乙醇解吸 ,醇洗脱液定容
至 100mL量瓶中 ,液相检测 ,结果见表 4。
表 4　 上样液吸附流速考察结果
吸附速度 /(BV/h) 木犀草素转移率 /%
0.5 99.4
1.0 98.1
2.0 97.6
5.0 93.2
　　由表 4可知 ,吸附速度在 0.5 ～ 2.0 BV/h范围
内对木犀草素转移率影响不大 , 且转移率均达到
95%以上 ,速度更大时转移率降低。考虑到工作效
率 ,选用吸附流速为 1 ～ 2BV/h较为恰当 。
3.7　上样液浓度和洗脱终点的考察
取香青兰水溶液(生药材含量为 0.24 g/mL,木
犀草素含量为 487 μg/mL)48 mL,分别加水稀释 1,
2, 3, 4, 5倍 ,以 1 ～ 2 BV/h的吸附流速加于 5g树脂
柱(1.4 cm×30 cm)上 ,静置过夜后 ,先用 5 BV水
洗脱后 ,再用 10 BV70%乙醇解吸 , 分段收集流出
液 ,每 1BV为一流份 ,依法液相检测 ,计算木犀草素
的转移率 ,结果见表 5。
表 5　 上样液浓度和洗脱终点考察结果
药液浓度
/(μg/mL)
收集流份的转移率 /%
第 1BV 第 2BV 第 3BV 第 4BV 前 4BV 第 5BV
487 23.41 42.78 12.22 2.63 81.04 0.75
243.5 33.87 51.13 10.90 1.49 97.39 0.32
162.3 16.10 60.52 17.56 4.09 98.28 0.97
121.8 19.34 61.58 14.83 2.99 98.74 0.71
97.4 16.89 60.33 17.58 4.51 99.31 1.17
　　由表 5可知 ,除 487 μg/mL外 , 样品浓度在
97.4 ～ 243.5 μg/mL范围内 ,对木犀草素转移率影
响不大 ,且转移率均较高 ,但为了缩短上样时间 ,我
们应尽可能把样品浓度控制在 240 μg/mL左右 。
此外 ,由表 5也可看出 ,洗脱液第 5 BV转移率已很
低 ,可忽略不记 ,因此我们可确定洗脱终点为 4 BV。
3.8　树脂吸附时间考察
取处理好的 HPD100干树脂 (先按 3.1项下大
孔树脂预处理方法处理大孔树脂 ,然后将处理好的
大孔树脂抽干)5 g(柱体积 20 mL)于 1.4 cm×30
cm色谱柱内 ,上样 97 mL(生药材含量为 0.12 g/
mL,木犀草素含量为 240μg/mL),分别考察吸附时
间 0, 3, 6, 9, 12 h对木犀草素转移率的影响 ,结果见
表 6。
表 6　 树脂吸附时间考察结果
吸附时间 /h 木犀草素转移率 /%
0 88.82
3 94.50
6 97.37
9 97.96
12 98.62
　　由表 6可知 ,吸附时间除在 0h, 3h时木犀草素
转移率较低外 ,在 6 ～ 12h范围内差别不大 ,且转移
率均较高 ,所以实验中树脂吸附时间应不低于 6h。
3.9　树脂径高比的考察
调整树脂用量 ,使树脂径高比分别为 1∶3, 1∶6,
1∶9,上样量按树脂径高比确定 ,其余条件同前 ,结果
见表 7。
表 7　 树脂径高比考察结果
树脂径高比 木犀草素转移率 /%
1∶3 97.37
1∶6 97.78
1∶9 98.37
　　由表 7可知 ,树脂径高比在 1∶3 ～ 1∶9范围内 ,
对木犀草素转移率影响不大 ,且转移率均较高。实
际工作中 ,可根据具体条件选择合适的树脂径高比。
3.10　洗脱流速考察
取处理好的 HPD100干树脂 (先按 3.1项下大
孔树脂预处理方法处理大孔树脂 ,然后将处理好的
大孔树脂抽干)5 g(柱体积 20 mL)于 1.4 cm×30
cm色谱柱内 ,上样 97 mL(生药材含量为 0.12 g/
mL,木犀草素含量为 240 μg/mL),其余条件同前 ,
考察洗脱速度为 1 BV/h, 2 BV/h, 3 BV/h, 5 BV/h
对木犀草素转移率的影响 ,结果见表 8。
表 8　 洗脱流速考察结果
洗脱流速 /(BV/h) 木犀草素转移率 /%
1 99.8
2 99.4
3 98.9
5 98.7
　　由表 8可知 ,洗脱速度在 1 ～ 5 BV/h很大范围
内对木犀草素转移率影响不大 ,且转移率均较高 ,实
际生产中 ,可适当放大洗脱速度。
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3.11　树脂重复使用次数考察
按上述确定的吸附 、洗脱条件 ,取香青兰水溶液
进行上柱 、吸附和洗脱 ,在同一根树脂柱上重复操作
4次 ,分别计算树脂对木犀草素的转移率 ,结果见表
9。
表 9　 树脂重复使用次数考察结果
树脂重复使用次数 木犀草素转移率 /%
1 98.6
2 95.4
3 90.2
4 79.7
　　由表 9可知 ,树脂使用 3次后 ,对木犀草素的转
移率明显下降 ,不足 80%,需再生才可继续使用 ,故
树脂可重复使用 3次 。
3.12　树脂再生 [ 6]
大孔吸附树脂除了吸附目标产物之外 ,还会吸
附杂质 ,而这些杂质会毒化树脂 ,必须在下一次使用
前 ,再生树脂 ,处理方法为依次用 2% ～ 5%NaOH,
2% ～ 5%HCl,无水乙醇冲洗 ,然后再用蒸馏水冲洗
至中性 ,即可 。
3.13　验证实验
综合以上结果 ,香青兰的最佳纯化工艺条件为:
HPD100树脂分离纯化 ,上样液木犀草素浓度在 240
μg/mL左右(相当于 0.12g生药 /mL),吸附时间不
低于 6h,树脂径高比 1∶3 ～ 1∶9,吸附速度 1 ～ 2BV/
h,洗脱速度 1 ～ 5 BV/h, 70%乙醇洗脱 4 BV。按优
选的最佳工艺条件进行验证 ,平行 3份 ,结果转移率
均在 95%以上 ,说明所选工艺稳定可行 。
4　产品纯度的对比
精密吸取 50 mL上柱液和过柱后 70%乙醇的
洗脱液水浴蒸干 , 105 ℃干燥至恒重 ,得总固形物 ,
称重 ,计算 ,得出膏率分别 34.3%和 5.4%,木犀草
素含量由纯化前的 1.5‰增加到纯化后的 2.7%,纯
度提高了 7倍左右 。
5　讨论
树脂的极性 、比表面积和平均孔径的大小直接
影响树脂的吸附容量和解吸率 ,本实验筛选的树脂
除 HPD600为极性树脂外 ,其余均为非极性树脂。
对 7种树脂吸附香青兰中木犀草素性能进行比较筛
选 ,发现 HPD100树脂最适合于香青兰中黄酮的纯
化。 HPD100树脂对香青兰中木犀草素吸附好 ,转
移率高。
按优选的纯化条件对香青兰进行纯化后 ,浸膏
由纯化前的 34%减到纯化后的 5%,木犀草素含量
也由纯化前的 1.5‰增加到纯化后的 2.7%,说明大
孔吸附树脂分离纯化技术的可行性。
文献报道中 ,对影响大孔树脂吸附和解吸的各
因素多进行分开考察 ,本实验对上样液浓度和洗脱
终点同时进行了考察;吸附时间和树脂径高比也可
以交叉同时考察;选择较好树脂的同时 ,初步考察了
洗脱醇浓度 ,由此不仅节约了时间 ,也对今后大孔吸
附树脂的考察提出了新的思路。
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赤峰丹龙药业有限公司顺利通过 GMP认证
继 2003年 12月第一次通过 GMP认证后 ,历经 5年的规范运行 ,作为内蒙古唯一一家具有 182个品种 ,
集中药 、西药 、蒙药于一体的现代化制药企业———赤峰丹龙药业有限公司 ,又一次顺利通过了日益严格的行
业检查认证 ——— GMP认证 。
据介绍 , 9月 18日至 20日 ,由内蒙古食品药品监督管理局组成的 GMP认证小组 ,对丹龙药业公司进行
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真 、严格的现场问询和检查 ,对丹龙公司的 GMP运行给予了高度评价 ,并对某些方面的工作提出了宝贵的指
导意见和建议。
专家们认为 ,丹龙公司质量保证体系完备 ,质量管理科学 、合理 , GMP运行规范 、有序 ,符合行业标准 ,一
致同意一次性通过 GMP认证。 (信息由新华社提供)
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