全 文 ：申 国 种 荃
第 30 卷 第 4 期 S C I EN C E IN C H I N A
( C 辑 )
S e r i e s C ) 2 0 0 0 年 8 月
风信子 月A G I 基因的克隆与表达 *
张宪省 ` ’ 李全梓 李兴 国 白书农
(山东农业大学生命科学学院 , 泰安 2 7 1。 ! 8) (北京大学生命科学学院 , 北京 一0 0 57 1 )
陆文梁
(中国科学院植物研究所 , 北京 10 0 0 9 3)
摘要 根据 A G 同源基 因 M A D S B ox 的保守性 , 设计简并引物 , 进行 R T 一 P C R , 从风
信子的花器官中分离出 正否气G l 基因 . 分析表明 , 该基因与 A G 的同源基因具有较高的同
源性 . 以 月叭G l M A D S B o x 以外的 3 ’ 端序列为模板合成探针 , 进行 N o rt he m 杂交分析
在根和叶片中未检测到 月叭G l m R N A 的积累 , 但在处于花粉母细胞和单核花粉时期的
花器官中其 R N A 的积累水平则相当高 . 利用 PC R 技术 , 并结合序列测定方法 , 从低激
素浓度条件下分化再生雄蕊的花芽中检测到 刀八G l 的片断 , 而从高激素浓度条件下分
化再生花被片的花芽 中未检测到该片断 , 推测激素浓度 、 同源异形基因及花器官特征之
间存在密切联系 .
关键词 风信子 刀月 G l 基因克隆 基因表达
近年来 , 人们通过突变体分析与基因克隆的方法 , 在拟南芥 、 金鱼草等模式植物中找到一
批控制花器官特征 , 被称为 同源异形基因的关键基因〔’ 〕. 这些基因的发现 , 使得人们对植物花
器官发生与发育机理的认识进人到分子水平 . 现 已在拟南芥和金鱼草中建立起 A B c 模型 L’ , 2 ] ,
根据该模型 , 拟南芥控制花器官特征 的同源异形基因被分为 A , B , C 三类 , A 类基因包括
A尸E AT LA I (A 尸1)
,
A尸 E AT LA Z (A 尸2 )
,
B 类基因有 A尸 E AT LA 3( A尸3) 和 尸sI IT L LA (PI ) ,而 AGA M O US
(A )G 则属于 C 类基因 . 每类基因均在相邻两轮器官中起作用 , 这些基因的单独或相互作用决
定了各轮器官的特征 , 其中 A尸2 的单独作用决定警片的形成 , A尸了或 PI 与 A尸2 的作用决定花
瓣的形成 , 而 A尸3 或 PI 与 A G 的作用决定雄蕊 的特征 , A G 的单独作用决定心皮的特征 . 此外 ,
A 类基因与 c 类基因之间存在相互拮抗作用 「’ , “ ] . 这些基因编码 的蛋白质为转录因子 , 其中的
大多数含有非常保守的 M A D s B o x , 称为 M A D s B o x 基因 [3 ] .
风信子属百合科植物 . 在离体条件下 , 以风信子花被片作为外植体 , 已可做到通过生长素
浓度和外植体年龄的变化 , 直接控制外植体上花被 、 雄蕊和胚珠 3 种器官的发生或不发生 14] .
这一实验系统的最大特点是将植物花器官发生在整体条件下不可避免的在种类 、 时间 、 空间
上的高度复合状态 , 成功地简化为单类器官的可控发生 . 由于 同源异形基因与花器官发生的
19 9 9
一
0 3
一
2 9 收稿 , 19 9 9 一 0 6 一 3 0 收修改稿
* 攀登计划预选项 目和 中国科学院 “ 九五 ” 基础研究重点课题 (批准号 : KJ 9 5 2 一 lJ 一 6 01 )
* * E
一
m a i l : z h a n g x s @ s d a u 澄 d u ` c n
第 4 期 张宪省等 : 风信子 刀八G l 基因的克隆与表达
关系比较清楚 , 因此 , 我们 的首要 目标是从风信子中克隆直接控制花器官发生的同源异形基
因 . 最近 , 利用 PC R 技术已从风信子的花器官中成功地分离出 刀A G I 基因 , 该基因与 A G 的同
源基因具有较高的同源性 . N or t h er n 杂交分析显示 出该基因只在花器官 中表达 . 此项研究工作
为我们深入理解激素控制花器官发育的机理提供了新资料 .
1 材料与方法
L l 植物材料
风信子 (yH a e i n r人u s o r i e n ra zi、 L . )栽培种 “ w h i t e p e a r l ” . 3 年生鳞茎用作实验 . 1 1月 _
_
L旬将
鳞茎埋人土 中 ,在 0 一 5 ℃左右的温度中贮存 2 个月后 , 陆续用于实验 .
L Z 外植体分离和消毒
取适宜时期的花被片作外植体 , 按文献 5[ ]的方法进行分离和消毒 .
L 3 再生花被片与再生雄蕊的诱导和培养
再生花被片与再生雄蕊的诱导和培养见文献 4[ , 5] .
L 4 总 R N A 的提取和反转录
总 R N A 的提取参照文献 6[ ] .
反转录方法如下 : 取 10 件g 总 R N A , 用 10 u R N a s e 一 fr e e D N a s e l (P r o m e g a )在 3 7 ℃消化
巧 m in , 苯酚 、 氯仿抽提 , 然后用乙醇沉淀 17 . 取 2 此 总 R N A , 于 70 ℃变性 5 m in 后迅速置于
冰水浴中冷却 ; 然后 , 依次加人反应缓冲液 5 林L , 10 m m ol L/ d N T P 溶液 2 林L , 核糖核酸酶抑制
剂 .0 5 林L , 浓度为 1 林g/ 协L 的引物 B 2 6 1 林L 和反转录酶 2 林L , 混匀后于 42 ℃反应 l ;h 反应结
束后 , 85 ℃放置 10 m in 灭活反转录酶 ; 最后将反应体积稀释至 2 0 林L[ 7] . 引物 B 2 5 和 B 2 6由中
国科学院发育研究所薛勇彪博士惠赠 .
L S 目的基因的扩增
p C R 反应含反应缓冲液 5 林L , 2 . 5 m m o lz L d N T P 溶液 4 林L , 浓度为 5 林m o l / L 的 5 `端和 3 ’
端引物各 4 林L , 反转录产物 4 林L , aT q 酶 0 . 5 林L (2 . s u ) . 反应条件 : 94 ℃预变性 3 m in , 然后
9 4 ℃ , 6 0 5 , 5 6 ℃ , 6 0 5 , 7 2℃ , 1 2 0 5 , 共 3 5 个循环 , 反应结束时 7 2 ℃继续延伸 10 m i n . 取 10 林L
P C R 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 . 5 ’端序列的获得 : 使用 G BI C O B R L 试剂盒 , 并按其说明
书进行 .
L 6 基因的克隆及序列测定
目的基因的克隆参照 P r o m e g a 公司的 p e EM 一 T 和 p G EM 一 T 一 E a s y ve e t o : s y s t e m s 说明书进
行 . 序列 测定用 测序仪 A B I P R I s M T M 3 7 7 D N A s e q u e n e e : 进行 , 反应试剂为 B i g D y e T M
eT
rm i n a t o r C y c l e S e q u e n e i n g R e a d y R e a c ti o n K i t ( P e r k i n E lm e r )
.
1
.
7 N o r t h e r n 分析
取 20 林g 的总 R N A 在 1 . 2% 甲醛变性胶上电泳 6 h 后 , 按 s a m b r o k 等人 l7] 的方法将 R N A
转移到尼龙膜上 . 将膜置于预杂交液 (5 0% 甲酞胺 , l x D e n h a r t , s x s s e , 0 . 2% s D s , 2 0 9几 鲤精
D N )A 中 , 4 2℃预杂交 12 h . 杂交探针的制备采用随机引物法 . 将标记好的探针于沸水浴中变
性 5 m in , 迅速置于冰水浴中冷却 , 然后加人预杂交液中 , 42 ℃杂交 48 h . 以洗膜液 1( xZ S C,
0
.
2% S D S )和洗膜液 2 (0 . 2火 S S C , 0 . 2% S D S )分别洗膜 2 次 , 每次 2 0 m i n一 7 0 ℃下放射 自显影 .

第 4期 张宪省等 : 风信子 月乃G 了基因的克隆与表达 379
的序列设计引物分别进行 3`端 P C R 和 5 `端 R ac eP C R , 最终获得全长度的 c D N A .
目前该基因命名为砚 G z (加 r yH a e i n t人u 、 A G了) , G e n B a n k 登记号为 A F o 9 9 9 37 . 图 2 为该基
因的核昔酸序列和相应的氨基酸序列 . 核普酸序列包括 M A D S B ox 及其上下游的全部序列 ,
A G T T C C T A C T T G T A T C T C C C T A C C C C T T T A G A G A G A G A A A C A G G A G G G G G A G C A A G G A
G T A T C A T A C C C C T T T C T T T C A A G C T C A A A T C C G G G A A G A A C T G A T C A G A C G G C C A G G C T G
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图 2 H A G了序列
推测 的核昔酸和氨基酸序列 ; 下划线为 M A D S B ox
5 8
1 1 8
1 7 8
2 3 8
2 9 8
3 5 8
4 1 8
4 7 8
5 3 8
5 9 8
6 5 8
7 1 8
7 7 8
8 3 8
H A G I G R G K I E I K R I E N T T S R Q V T F C K RR N G L L K KA Y E L S V L C D A E V A L I V F S T R G R L Y E Y
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土`勺`
óJJd J
图 3 M A D S B o x 区域的氨基酸序列比较
* 表示相同的氨基酸 ; AT G I 来自文献 8[ ]; A G 来 自文献 3[ ] ; B A G I 来 自文献 [9] ; z A GI 来 自文献「10]
其长度为 1 0 6 2 b p , 编码 2 2 8 个氨基酸 (图 2 ) . 图 3 为 H A e x 与番茄的认G l [8 ] 、 拟南芥的 A o [3 ] 、
油菜的 B A G lo 〕和玉米的 z A G I[ ’ ” 〕 M A D s B ox 的比较结果 . 与其他植物 中的 A G 同源基因一样 ,
AH G I 的 5 ’ 端编码区含有保守的 M A D S B ox 序列 (图 2 中的下划横线 ) .
.2 3 月连 G l 基因的特异性表达
用 N or the m 技术对 月竹 G l 基因在植物体不同器官的表达进行了研究 . 以 M A D S B ox 以外
的 3 ’端序列为模板 , 合成探针 , 进行分子杂交 . 在根和叶片 中未检测到 月注G l m R N A 的积累 ,

第 4 期 张宪省等 : 风信子 刀乃G I 基因的克隆与表达 3 81
用 R PC技术在分化雄蕊的再生花芽中也探测到 月八G l 的 m RN A , 显然 , 在风信子生殖器官发
生定 向控制系统中 , 花器官的特征也应有 同源异形基因决定 . 由于激素浓度决定花器官发生
的类型 , 因此很可能激素浓度通过直接或间接地作用调控 同源异形基因的表达 , 最终控制花
器官的特征 . 最近 , 我们正在从风信子 中分离 A尸2 及 A尸了的同源基因 . 进一步应用原位杂交等
技术 , 分析这些基因在分化不 同花器官的再生花芽中的表达 , 将为理解激素控制花器官发育
的机理提供十分重要的资料 .
参 考 文 献
2
3
4
5
6
7
8
9
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12
13
l 4
C o e n E S
,
M
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.
T h e w a r o f t h e w ho r l s : g e n e t i e i n t e r a e t i o n s e o n t r o l l i n g fl o w e r d e v e l o Pm e n t
.
N a t u r e
,
19 9 1
,
3 5 3 :
3 1 一 3 7
C h a s a n R
.
M o d e l i n g fl o w e r s
.
P l a n t C e l l
,
19 9 1
,
2 : 8 4 5 一 8 4 7
aY
n o fs k y M E M a H
,
B o w m a n J L
,
e t a l
.
T h e P r o t e i n e n e o d e d b y th e A ar b id op
s i s h o m e o t i e g e n e a g a m o u s r e s e m b l e s
t r a n s e r iP t i o n fa c t o r s
.
N a t u r e
,
19 9 0
,
34 6 : 3 5 一 39
L u W, E
n o m o t o K
,
F u k u n a g a Y, e t a l
.
R e g e n e r a t i o n o f t e Pa l s
,
s t a m e n s a n d o v u l e s i n e x P l a n t s fr o m P e r i a n t h o f yH
a e i n ht u s
o r i e n ta l i s L
.
im Po r t a n e e o f e x P l a n t a g e a n d e x o g e n o u s h o rm o n e s
.
P l a n t a
,
19 8 8
,
175 : 4 7 8 一 4 84
陆文梁 , 诸颖杰 . 风信子再生雄蕊的小抱子发生 和花粉发育的细胞学观察 . 植物学报 , 】9引 , 3 : 3 4 3 ~ 3 49
C a t h a l a G
,
S a v o u r e t J F
,
M e n d e z B
,
e t a l
.
A m e th o d fo r t h e i s o l a t i o n o f i n t a c t t r a n s l a t i o n a l l y a e t i v e r ib o n u c l e i c a e id
.
D N A
,
19 8 3
,
2 : 3 2 9 一 3 3 5
S a m b r o o k J
,
F r i t s c h E F, M
a n i a t i s T
.
M
o l e e u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y M
a n u a l
.
N e w oY
r k : C o ld S P r i n g Ha br o r L a b o r a t o r y
P r e s s
,
19 8 9
P n u e l i L
,
H a r e v e n D
,
R o u n s l e y S D
,
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.
I s o l a t i o n o f t h e t o m a t o A g a m o u s g e n e TA G I
a n d a n a l y s i s o f i t s h o m e o t i e r o l e i n
t r a n sg e n i e P l a n t T h e P l a n t C e l l
,
19 9 4
,
6 : 16 3 一 17 3
M
a n d e l M A
,
B o w m a n J L
,
K e m P i n S A
,
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C e l l
,
19 9 2
,
7 1 : 1 3 3 -
14 3
S e h m id t R J
,
Ve i t B
,
M a n d e l M A
,
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.
I de n t i if e a t i o n a n d m o l e e u l a r e h a r a e t e r i z a t io n o f ZA G ]
,
th e m a i z e h o m o l o g o f th e
A ra b id op
s i s if o r a l h o m e o t i c g e n e A g a m o u s
.
T h e P l a n t C e l l
,
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5 : 7 2 9 一 7 3 7
K e m Pi n S A
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n o f s k y M E C o n v e r s i o n o f P e r i a n t h i n t o r e Pr o d u e t i v e o gr a n s b y e e t o P i e e x Pr e s s i o n o f t h e
t o b a e e o fl o r a l h o m e o t i e g e n e N 八G l . P l a n t P h y s i o l , 19 9 3 , 10 3 : 1 0 4 ] 一 1 0 4 6
H u a n g H
,
T u d o r M
,
S u T, e t a l
.
D N A b i n d i n g Pr o P e r t i e s o f tw o A ar b i d op
s i s M A D S d
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d i m e r fo
rm a t i o n
.
T h e P l a n t C e l l
,
1 99 6
,
8 : 8 1 一 94
M i z u k a m i 丫 H u a n g H , T u d o r M , e t a l . F u n e t i o n a l d o m a i n s o f t h e fl o r a l r e g u l a t o r Ag a m o u s e h a r a e t e r i z a t i o n o f t h e D N A
b i n d i n g d o m a i n a n d a n a l y s i s o f d o m i n a n t n e g a t i v e m u t a t i o n s
.
T h e P l a n t C e l l
,
19 9 6
,
8 : 8 3 1 一 84 5
O k a m u r o J K
,
S z e t o W
,
L o t y s
一
P r a s s C
,
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.
P h o t o a n d h o rm o n a l e o n t r o l o f m e r i s t e m id e n t i t y i n t h e A ar bi d op
s i s if o w e r
m u t a n t s aP
e t a l a Z a n d aP
e似 l a ] . T h e P l a n t C e l l , 19 9 7 , 9 : 37 一 4 7