全 文 ：ISSN1672－4305
CN12－1352 /N
实 验 室 科 学
LABORATORY SCIENCE
第 15 卷 第 1 期 2012 年 2 月
Vol. 15 No. 1 Feb. 2012
实验技术
太行菊 SRAP－PCR反应体系的建立与优化
高亚卉，朱广龙，姬志峰，王祎玲
(山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041004)
摘 要:相关序列扩增多态性(SRAP)是一种新发展起来的分子标记技术，在太行菊中还未见相关的报道。为建
立优化适合太行菊 SRAP分析的扩增体系，以太行菊 DNA为模板，对影响 SRAP－PCR反应体系的 5 个重要参数
设置梯度进行单因素实验分析，以确定最佳的反应条件。经过大量的重复性实验确定了适合太行菊 SRPA－PCR
反应体系:20μL 的反应体系中，模板 DNA 量 50ng，1． 25mmol /L 的 Mg2+浓度，0． 5μmol /L 的上下游引物，
0. 2mmol /L的 dNTPs以及 Taq 酶 1U。该体系在太行菊个体中均能扩增出清晰稳定的条带，为后续的太行菊遗
传多样性分析奠定了基础。
关键词:太行菊;SRAP;反应体系
中图分类号:Q341 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1672－4305． 2012． 01． 026
Establishment and optimization of SRAP reaction system for
Opisthopappus Taihangensis (Ling)Shih
GAO Ya－hui，ZHU Guang－long，JI Zhi－feng，WANG Yi－ling
(College of Life Science，Shanxi Normal University，Linfen 041004，China)
Abstract:Sequence－related amplified polymorphism (SRAP)is a newly developed molecular marker．
Several significant parameters of SRAP－PCR reaction system are studied and optimized by Opisthopap-
pus Taihangensis (Ling)Shih＇s DNA． The stable reaction system is established:20μL reaction system
containing 50ng DNA template，1． 25mmol /LMg2+，0． 5μmol /L forward primer，0． 4μmol /L reverse
primer，0． 2mmol /L dNTPs and 1U Taq DNA polymerase． It can be amplificated clear and steady band
from this system in the individual of Opisthopappus Taihangensis (Ling)Shih，and laid the foundation
for the subsequent research analysis of genetic diversity in Opisthopappus Taihangensis (Ling)Shih．
Key words:opisthopappus taihangensis (Ling)shih;SRAP;reaction system
基金项目:山西省自然科学基金(项目编号:2011011031－2)。
太行菊［Opisthopappus Taihangensis (Ling)
Shih］是太行菊属(Opisthopappus)的多年生草本植
物。该属有两个种:长裂太行菊和太行菊，为我国特
有种，主要分布在山西、河北、河南等地。太行菊高
10 ～ 15 厘米，全部叶末回裂片披针形、长椭圆形或
斜三角形，宽 1 ～ 2 毫米，全部叶两面有稀疏或稍多
的短柔毛;长裂太行菊高 15 ～ 30 厘米，全部叶末回
裂片镰刀形、宽线形或偏斜三角形，宽 0． 5 ～ 2． 5 毫
米，全部叶光滑无毛［1］。太行菊植株通体富含芳香
油，干后香味持久，花色呈洁白或粉红，它是农业园
艺栽培菊花的野生近缘种，也是菊科植物花卉育种
的重要种质资源，具有重要的生态、种质、观赏和经
济价值。由于太行菊分布区狭窄，生态环境独特，繁
殖能力较弱，再加上人为采摘严重，现处于濒危状
态，已被列为国家第二批珍稀濒危保护植物［2］。
对于太行菊属植物，已有人进行过部分研究，但
涉及的种类很少，多集中于分类学、以及组培扩繁等
方面［3］;对于孢粉类的研究，也只是对太行菊和芙
蓉菊花粉母细胞减数分裂过程进行了研究［4］，然而
对于分子标记方面都尚未见报道。
相关序列扩增多态性(SRAP，Sequence－related
Amplified Ploymorphism)是由美国加州大学 Li 和
Quiros博士在 2001 年提出来的，是一种新型的基于
PCR的标记技术。基于基因的内含子和外显子区
域的多态性标记，上游引物对外显子进行特异性扩
增，下游引物对内含子区域和启动子区域进行特异
性扩增。因为个体不同及物种的内含子、启动子和
间隔长度的不等而产生了多态性。该标记具有简
便、中等产率、稳定和易得到选择性条带序列的一些
特点。到目前为止，SRAP 分子标记已经在多种植
物的研究中得到成功的应用［5－10］，适合基因定位、基
因克隆和遗传图谱的构建等生物学方面的研究。本
文通过优化太行菊 SRAP－PCR 扩增反应体系条件，
为太行菊遗传多样性研究奠定了一定的基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
材料采自河南省辉县、林州、济源县、山西省晋
城陵川、河北省磁县、修武、邢台等地，选择长势茂
盛、植株健壮的太行菊的新鲜叶片，将其放入密封袋
置于－80℃冰箱冷冻保存备用。
1． 2 方法
(1)总 DNA的提取
采用 改 良 的 CTAB 法 提 取 太 行 菊 的 总
DNA［11－12］。1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度，紫
外分光光度法检测 DNA 浓度。DNA 样品于－20℃
保存备用。
(2)SRAP－ PCR反应体系
本实验按照 Li 和 Quiros 报道的扩增程序进行
扩增［13］，SRAP引物采用 Li 等已发表的序列，由上
海生工生物有限公司合成，反应体系为 20μL。进行
单因素实验，选择随机组合引物对 m1(TGAGTC-
CAAACCGGATA)－em1(GACTGCGTACGAATTAAT)
对 DNA 模板扩增中的重要参数进行了浓度梯度设
置，并且严格控制其他参数和反应条件，以确保实验
的准确性和可比性。
(3)PCR扩增程序
PCR扩增在美国 Thermo 公司生产的 PTC－200
型仪器上进行。扩增程序采用复性变温法:94℃预
变性 5 min，94℃变性 1min，35℃复性 1min，72 ℃延
伸 1． 5min，5 个循环;94℃ 变性 1min，50℃ 复性
1min，72 ℃延伸 1. 5min，35 个循环，循环结束后
72℃延伸 10min，最后 4℃保存［14］。
(4)PCR扩增产物的检测
扩增产物用 EB显色，2%的琼脂糖凝胶进行电
泳检测，电压 100V，电流 50mA，电泳 90min。最后
用捷达公司凝胶成像系统进行图像采集。
2 结果与分析
2． 1 太行菊总 DNA的提取
植物叶片组织中含有比较多的脂类、蛋白质、多
酯、多酚等一些不利于 DNA提取的物质。针对这个
情况本实验采用了改良的 CTAB 法，基本排除了组
织中多酚物质、蛋白质和其他杂质的干扰，经琼脂糖
凝胶电泳检测得到了清晰、整齐、拖尾较少的 DNA
条带(图 1) ，提取的 DNA 不仅降解小、产量和纯度
都比较高。
图 1 改良的 CTAB法提取的总 DNA电泳图
2． 2 模板 DNA用量对 PCR结果的影响
本实验在 20μL 的反应体系中依次设置了
20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng 6 个模板 DNA 浓
度梯度。结果表明，模板 DNA 的用量对于 PCR 的
测量结果影响较大，当模板 DNA 的用量小于 30ng
时，没有扩增条带或者扩增出的条带模糊不清晰;当
模板 DNA用量为 30 ～ 70ng 时，扩增出的条带带型
不仅清晰而且稳定。由于模板 DNA 浓度过高将会
降低特异扩增效率，增加非特异性产物而影响扩增
结果的稳定性。考虑到模板节约和实验操作稳定
性，本文采用 DNA浓度在 20μL体系中为 50ng最佳
(图 2)。
2． 3 引物浓度对 PCR结果的影响
引物浓度的高低在一定程度上影响扩增产物的
产量。引物浓度较低时与模板结合率低，产生的多
态性条带少;引物浓度偏高将会引起错配和非特异
性扩增，而且可能增加引物之间形成二聚体的机会。
本实验在 20μL 的反应体系中将等量的上、下游引
物(m1—em1)浓度分别设置为 0． 1μmol /L、0． 2
μmol /L、0． 3 μmol /L、0． 4 μmol /L、0． 5 μmol /L、0． 6
μmol /L 6 个浓度梯度进行 PCR 扩增反应。实验中
应选择以最低引物量产生所需要的最适宜结果为
28
高亚卉，等:太行菊 SRAP－PCR反应体系的建立与优化
M 1 2 3 4 5 6
图 2 不同 DNA浓度的 SRAP 的反应结果
注:M 代表 Marker，1、2、3、4、5、6 泳道分别代表
20、30、40、50、60、70ng的 DNA模板。
好。实验结果表明，引物浓度为 0． 5 μmol /L 时，扩
增出的条带最清晰，结果最好(图 3)。
M 1 2 3 4 5 6
图 3 不同引物浓度的 SRAP 的反应结果
注:1、2、3、4、5、6 泳道分别代表 0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、
0． 6 μmol /L的引物浓度。
2． 4 Mg2+浓度对 PCR结果的影响
Mg2+是 PCR 反应中的一个重要因素，Mg2+浓度
的变化可影响 SRAP－PCR带型的相对强弱，它不仅
会影响酶的活性和引物与模板的结合效率，还会影
响模板与 PCR 产物的解链稳定性和产物的特异性
以及引物二聚体的形成等。所以，适宜的 Mg2+浓度
对 PCR的扩增影响很大。本实验在 20μL的反应体
系中依次设置了 1． 0mmol /L、1． 25 mmol /L、1． 5
mmol /L、2． 0 mmol /L、2． 5 mmol /L 5 个浓度梯度。
实验结果表明，当 Mg2+浓度小于 1． 25 mmol /L 时，
PCR 扩增的条带不仅少而且弱;当 Mg2+浓度为
1. 25mmol /L时，扩增的条带相对清晰并且稳定;当
Mg2+浓度大于 1． 5mmol /L，扩增的条带带型不稳定
而且有些弥散(图 4)。
M 1 2 3 4 5
图 4 不同 Mg2+浓度的 SRAP 的反应结果
注:M代表 Marker，1、2、3、4、5 泳道分别代表 1． 0、1．
25、1． 5、2． 0、2． 5mmol /L的 Mg2+浓度。
2． 5 dNTPs对 PCR结果的影响
本实验在 20μL 的反应体系中依次设置了 5 个
dNTPs 浓度梯度:0． 1 mmol /L、0． 15 mmol /L、0． 2
mmol /L、0． 25 mmol /L、0． 3 mmol /L。dNTPs 是 PCR
扩增反应的原料，dNTPs 浓度过高，会导致聚合酶错
误的掺入引起碱基错配，降低 PCR 扩增的真实性;
浓度过低，又会影响合成效率，甚至会因 dNTPs 过
早的消耗完而使产物单链化而影响扩增效果。所
以，dNTPs浓度的选择对 PCR 扩增有一定的影响。
实验结果表明，dNTPs 的浓度过低(0． 1 mmol /L)或
者过高(0． 3 mmol /L)时，扩增条带比较模糊;当
dNTPs的浓度为 0． 2 mmol /L时，得到的扩增产物效
果最佳(图 5)。
M 1 2 3 4 5
图 5 不同 dNTPs浓度的 SRAP 的反应结果
注:M代表Marker，1、2、3、4、5 泳道分别代表 0． 1、0． 15、
0． 2、0． 25、0． 3mmol /L的 dNTPs浓度。
2． 6 Taq酶对 PCR的影响
Taq酶活性的高低影响着 PCR反应的进程与产
物的产量。酶的浓度过低会使扩增产物量减少，浓
度太高容易导致非特异性扩增导致假阳性，甚至有
时候只出现亮的通带，而无任何扩增条带。本实验
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在 20μL的反应体系中设置了 5 个浓度梯度的 Taq
酶用量:0． 25U、0． 5U、1 U、1． 5 U、2． 0 U。实验结果
表明，当 Taq酶用量为 1U 时，PCR 扩增的带型最为
清晰稳定，扩增效果最好(图 6)。
M 1 2 3 4 5
图 6 不同 Taq酶浓度的 SRAP 的反应结果
注:M代表 Marker，1、2、3、4、5 泳道分别代表 0. 25U、
0． 5U、1． 0U、1． 5U、2． 0U的 Taq DNA聚合酶用量。
3 结果与讨论
综合上述实验结果，最终建立了优化的太行菊
SRAP体系。该体系总体积为 20μL，以 m1 和 em1
为引物组合，其中，模板 DNA 量 50ng，1． 25mmol /L
的 Mg2+浓度，0． 5μmol /L 的上下游引物，0． 2mmol /L
的 dNTPs以及 Taq 酶 1U。经过优化的太行菊扩增
体系可以得到清晰、多态性高的条带(图 7)。
图 7 引物组合 m1 ～ em1 图谱
目前，应用较为广泛的分子标记技术主要由
RAPD、RFLP、SSR、AFLP以及核酸序列分析等，每一
个分子标记技术在实际应用中都有其优点和缺点。
SRAP与其他基于 PCR 的分子标记相比，其独特之
处在于引物的设计。SRAP 引物是基于外显子富含
GC而启动子、内含子富含 AT 的特点而设计的。作
为一个理想的分子标记技术，其总体要求是多态性
高，稳定性、重复性好，易于观察和操作，价格低廉，
共显性，在整个基因组中分布广泛等。SRAP 具备
了上述大部分条件。且 SRAP分子标记技术结合了
RAPD和 AFLP 二者的优点，已用于构建遗传图谱、
比较基因组学、分析遗传多样性等方面［15－16］。本实
验通过对 SRAP－PCR 反应条件中主要参数进行优
化，最终确定了适合于太行菊 SRAP 最优的反应体
系。该体系可获得稳定清晰、重复性好的条带，为以
后太行菊遗传多样性方面的研究等奠定了基础。
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收稿日期:2011－08－28
修改日期:2011－10－17
作者简介:高亚卉(1988－) ，女，硕士，主要从事植物遗传学
研究。
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