全 文 ：收稿日期:2012 － 04 － 28 修回日期:2012 － 07 － 10
基金项目:福建省财政专项—福建省农业科学院科技创新团队建设基金项目资助(STIFY06) ;国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-G-
20) ;国家科技支撑项目(2007BAD07B03)．
作者简介:李永平(1974 －) ，女，硕士，副研究员．研究方向:蔬菜育种与生物技术． Email:lyp_lily@ 163． com．通讯作者温庆放(1965 －) ，男，
研究员．研究方向:蔬菜育种与栽培． Email:fjvrc@ 163． com．
10 个佛手瓜栽培品种亲缘关系的 SRAP分析
李永平，康建坂，林 珲，温庆放
( 1．福建省农业科学院作物研究所; 2．福建省农业科学院蔬菜研究中心;
3．福建省蔬菜工程技术研究中心，福建 福州 350013)
摘要:研究影响佛手瓜 SRAP扩增反应的主要因子，建立佛手瓜 SRAP反应的优化体系，利用 SRAP技术对福建省 10 个佛
手瓜栽培种进行亲缘关系分析．筛选出 10 对具有较高扩增多态性的引物组合，共扩增出条带 114 条，其中 62 条为多态性条
带，多态率为 54．38% ．聚类分析结果表明，当遗传距离为 0．20 时，可将 10 个品种分为 3 个类群;遗传距离为 0．35 时，10 个
品种聚为一类，表明 10 个佛手瓜品种的亲缘关系较近．
关键词:佛手瓜;亲缘关系;SRAP;聚类分析
中图分类号:S795．9 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2012)06-0590-05
SRAP analysis of the genetic relationships of 10 chayote (Sechium edule)cultivars
LI Yong-ping，KANG Jian-ban，LIN Hui，WEN Qing-fang
(1． Institute of Crop Sciences，Fujian Academy of Agricultural Sciences;2． Vegetable Research Center，
Fujian Academy of Agricultural Sciences;3． Engineering Research Center for Vegetable，
Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350013，China)
Abstract:The main factors affecting the amplification results in the reaction system of sequence-related amplified polymorphism
(SRAP)were investigated． SRAP-PCR reaction system of Sechium edule was optimized and SRAP was assessed to analyze the ge-
netic relationships among 10 Sechium edule cultivars． A total of 114 DNA bands were amplified by 10 selective primers，62 of which
(54．38%)were polymorphic． Cluster analysis showed that the 10 cultivars were classified into three cluster groups with the genetic
similarity of 0．20． All cultivars clustered together when the genetic distance was 0．35，which suggested the closer genetic relation-
ship of 10 Sechium edule cultivars．
Key words:Sechium edule Swartz．;genetic relationship;SRAP;cluster analysis
佛手瓜(Sechium edule Swartz．)为葫芦科多年生宿根性攀缘植物，是一种富含营养的珍稀蔬菜［1］，其
含有较丰富的营养成分，具有高蛋白低脂肪、高钾低钠、赖氨酸和组氨酸含量高的特点，是一种理想的蔬菜
食品，有良好的保健作用［2］．美、日等国称之为“超级蔬菜”，具有较高的利用价值和开发前景．福建是佛手
瓜从国外引入我国的原始引种地之一［3］．因此，研究福建省佛手瓜各品种的亲缘关系，可为佛手瓜新品种
选育奠定基础．
SRAP (sequence-related amplified polymorphism)分子标记具有多态性高、快速、准确、可靠、重复性好
等优点，已被广泛应用于作物品种鉴定、指纹图谱构建、遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及分子
标记辅助育种等研究中［4］．目前，SRAP分子标记技术在佛手瓜遗传多样性分析方面未见报道．因此，采用
SRAP标记技术对福建省 10 个佛手瓜品种的遗传多样性进行分析，旨在揭示其亲缘关系，为佛手瓜品种
选育、种植、推广和利用提供依据．
1 材料与方法
1．1 供试材料
佛手瓜由福建省农业科学院蔬菜中心提供．材料代号、生物学性状及来源见表 1．
福建农林大学学报(自然科学版) 第 41 卷 第 6 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition) 2012 年 11 月
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2012.06.015
表 1 试验材料、生物学性状、来源
Table 1 Names，biological characteristics and sources of 10 Sechium edule cultivars
品种
代号
茎色 叶形 叶色
第一雌花
花节位
第一朵雌
花开放期
瓜形
瓜重
g 瓜皮色 有无刺 肉质 来源
A 绿色 掌状五角形 浓绿 20 － 25 6 月上旬 梨形 283 绿白色 无 微糯性 尤溪
B 绿色 掌状五角形 浓绿 19 － 24 5 月下旬至
6 月上旬
梨形 295 绿白色 无 微糯性 尤溪
C 绿色 掌状五角形 浓绿 21 － 25 6 月上旬 长梨形 256 绿色 有 微糯性 尤溪
D 绿色 掌状五角形 浓绿 22 － 26 6 月上旬 长梨形 270 绿色 无 微糯性 尤溪
E 绿白相间 掌状五角形 绿，叶柄基部白 23 － 28 6 月中下旬 梨形 263 白色 有 糯性 尤溪
F 绿色 掌状五角形 绿 20 － 24 6 月上旬 梨形 257 绿白色 无 微糯性 福州
G 绿色 掌状五角形 浓绿 19 － 24 6 月上旬 梨形 286 绿色 有 微糯性 福州
H 绿色 掌状五角形 绿 20 － 25 6 月上旬 梨形 273 绿色 有 微糯性 福州
I 绿色 掌状五角形 绿 21 － 25 6 月上旬 长梨形 265 白色 无 微糯性 福州
J 绿色 掌状五角形 浓绿 20 － 25 6 月上旬 梨形 269 绿白色 无 微糯性 福州
1．2 试剂
表 2 佛手瓜 SRAP引物序列表
Table 2 Sequences of SRAP primers
引物名称 引物序列
引物长度
bp
引物合成温度
℃
上游 me1 5-TGAGTCCAAACCGGATA-3 17 50．0
me2 5-TGAGTCCAAACCGGAGC-3 17 54．0
me3 5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3 17 50．0
me4 5-TGAGTCCAAACCGGACC-3 17 54．0
me5 5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3 17 52．0
me6 5-TGAGTCCAAACCGGTAA-3 17 50．0
me7 5-TGAGTCCAAACCGGACC-3 17 54．0
me8 5-TGAGTCCAAACCGGTGC-3 17 54．0
下游 em1 5-GACTGGGTACGAATTAAT-3 18 47．5
em2 5-GACTGGGTACGAATTTGC-3 18 52．1
em3 5-GACTGGGTACGAATTGAC-3 18 52．1
em4 5-GACTGGGTACGAATTTGA-3 18 49．8
em5 5-GACTGGGTACGAATTAAC-3 18 49．8
em6 5-GACTGGGTACGAATTGCA-3 18 52．1
em7 5-GACTGGGTACGAATTCAA-3 18 49．8
em8 5-GACTGGGTACGAATTCGA-3 18 52．1
em9 5-GACTGGGTACGAATTCAC-3 18 52．1
em10 5-GACTGGGTACGAATTCCA-3 18 52．1
主要试剂为 TaqDNA 聚合酶(Tiangen 公
司) ，10 × PCR buffer(含 Mg2 +，Tiangen公司)和
dNTP(上海生工生物工程公司)． SRAP 引物由
上海捷瑞生物工程有限公司合成(表 2) ，引物
长度分别为 17 bp(上游引物)和 18 bp(下游引
物) ，组合成 80 对引物．
1．3 方法
1．3．1 基因组 DNA的提取与检测 选取各品
种健壮、无病，且具有本品种特征特性的植株 1
株(同一品种最少 3 株混合取样) ，每株剪取 1
－ 2 片幼小、舒展的心叶，用改进的微量 CTAB
法［5 － 8］提取 DNA．在 10 μL模板 DNA中加入 1
× TE溶液至 3000 μL，在紫外分光光度计上分
别测定 260 nm和 280 nm 的吸光值，用 D260 nm /
D280 nm检测各样品的纯度并计算其浓度． 采用
0．8%琼脂糖凝胶电泳，检测 DNA完整性．
1．3．2 SRAP反应体系 扩增反应在美国 Ap-
plera公司生产的 GeneAmp PCR System 9600 上进行．采用 20 μL体系:75 ng 模板 DNA，0．4 μmol·L －1引
物，0．625 mmol·L －1 dNTP，1．5 U TaqDNA聚合酶，2．0 mmol·L －1 MgCl2，2．0 μL 10 × PCR缓冲液，加入灭
菌的超纯水至 20 μL． PCR反应体系确定后，在保持反应体系其它因素一致的条件下，改变单一因子，筛选
最佳参数．
SRAP反应热循环程序参照 Li et al方法［9］，即 94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 1 min，35 ℃退火 1 min，
72 ℃延伸 1 min，5 个循环;72 ℃变性 1 min，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35 个循环，72 ℃延伸 10
min，最后 4 ℃保存．
PCR扩增产物用 14 g·L －1的琼脂糖凝胶电泳检测，90 V稳压电泳 1 h，EB 染色，在 UVP公司的 GDS
8000 凝胶成像系统上观察并拍照．
1．3．3 数据分析 根据 SRAP扩增条带在相同电泳迁移位置上的有无，建立 1 － 0 型数据阵．“1”表示某
一电泳迁移位置上产物存在，“0”表示不存在． 根据 Nei-Li 相似系数法计算，按照类平均聚类方法，运用
NTSYS-pc 2．10e软件进行聚类分析．
·195·第 6 期 李永平等:10 个佛手瓜栽培品种亲缘关系的 SRAP分析
2 结果与分析
2．1 SRAP反应体系的优化
2．1．1 DNA模板浓度对佛手瓜 SRAP 的影响 在 SRAP 反应中，DNA 模板浓度是制约扩增产量及特异
性的一个重要因素． DNA模板浓度过高会出现非特异性扩增条带甚至抑制扩增，过低则无法获得所需的
扩增产物［10］，因此必须对模板 DNA浓度进行优化． 当模板使用量为 30、40、50 和 100 ng 时，扩增带型较
弱;当模板使用量为 75 ng时，扩增效果最好，故选择 75 ng为模板的优化使用量(图 1)．
2．1．2 引物浓度对佛手瓜 SRAP的影响 引物浓度影响引物与模板配对机率，从而影响扩增效率．引物
浓度过低或过高，都将降低引物与模板特异性配对，使带型弥散模糊，出现非特异性扩增．引物浓度为0．2、
0．3 和 0．5 μmol·L －1时，扩增条带比较模糊;引物浓度 0．4 μmol·L －1时，条带最清晰(图 2)．因此，最终选
用 0．4 μmol·L －1为最佳用量．
2．1．3 dNTP浓度对佛手瓜 SRAP的影响 dNTP 浓度不适合会导致 PCR 反应的产率降低． dNTP 浓度为
0．25、0．375 和 0．50 mmol·L －1时，条带模糊;dNTP 浓度为 0． 625 mmol·L －1时，条带清晰;dNTP 浓度为
0．75 mmol·L －1时，条带变弱(图 3)．因此，选择 dNTP浓度为 0．625 mmol·L －1 ．
2．1．4 TaqDNA聚合酶浓度对佛手瓜 SRAP的影响 TaqDNA聚合酶浓度为 1．5 U时，条带清晰;TaqDNA
聚合酶浓度为 1．0 和 2．0 U时，条带变弱(图 4)．故 1．5 U作为优化体系酶的使用量．
2．2 佛手瓜 SRAP反应的引物筛选
利用上述佛手瓜 SRAP反应体系，选择 8 条上游引物和 10 条下游引物组成 80 对 SRAP引物，对 10 个
佛手瓜品种进行分析． 引物筛选依据:DNA 条带清晰可辨、扩增条带具有较高的多态性和较好的重复
·295· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 41 卷
性［11］．结果从 80 对引物组合中筛选出 10 对引物(表 3)．
表 3 10 对有效引物组合
Table 3 The selected 10 primer combinations
No． 上游引物 下游引物 No． 上游引物 下游引物
M1 me1 em10 M6 me5 em4
M2 me3 em1 M7 me5 em10
M3 me3 em10 M8 me7 em5
M4 me5 em1 M9 me7 em9
M5 me5 em3 M10 me8 em8
2．3 多态性引物扩增结果
10 对引物共扩增出 114 条谱带，其中 62 条为多态性条带，多态性比率为 54．38%，平均每个引物组合
扩增出 6．2 条多态性谱带，每个引物可扩增出 4 － 10 条，谱带大小为 100 － 2000 bp．图 5 为引物 me8 － em8
和 me5 － em10 扩增的 SRAP谱带图．引物 me8 － em8 的扩增效果最好，多态性达 71．14%;引物 me5 － em10
的扩增效果较好，多态性为 69．93%;引物 me5 － em3 的扩增效果比较差，多态性仅为 35．71% ．谱带统计表
明，10 个佛手瓜品种间的遗传多样性不高．
图 5 me8 － em8(左)和 me5 － em10(右)扩增的 SRAP谱带图
Fig． 5 SRAP-PCR amplification profiles of 10 cultivars with primer combination me8 － em8 (left)and me5 － em10 (right)
图 6 10 个佛手瓜品种的聚类分析图
Fig． 6 SRAP dendrogram of cluster analysis
2．4 聚类结果
根据 DNA扩增结果计算佛手瓜各品种之间的遗
传距离，由遗传距离构建 10 个佛手瓜品种的亲缘关系
树状图(图 6)． 从聚类图可以看出，遗传距离为 0． 20
时，可分为 3 类:A与 D一类，B单独为一类，其它的为
一类;遗传距离为 0． 35 时，10 个佛手瓜品种聚在一
起，说明 10 个佛手瓜品种的亲缘关系较近．
3 讨论
有报道从佛手瓜中分离出一种核糖体失活蛋白
Sechiumin，该蛋白与特异的单克隆抗体相结合，可以
用作治疗癌症的化疗药剂［12］． 因此，近年来对佛手瓜
的研究越来越受到人们的重视．福建的佛手瓜不但是
本省庭院种植的重要蔬菜，还形成一定规模的商品化栽培，成为当地一种十分重要的珍稀蔬菜．因此，收集
并分析我省的佛手瓜品种的亲缘关系，对我省的佛手瓜品种的选育有着积极的意义．
不同植物的 SRAP最佳反应体系差异较大［10］，甚至同一种植物在不同实验室所做的结果都有差异．
TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度和 DNA模板浓度均可影响 SRAP 反应结果．因此，构建同一物
种在相同仪器设备和一定操作规范下的最佳优化技术体系是进行 SRAP 研究的关键所在．根据实验确定
·395·第 6 期 李永平等:10 个佛手瓜栽培品种亲缘关系的 SRAP分析
佛手瓜 SRAP 20 μL反应体系为:75 ng 模板 DNA，0． 4 μmol·L －1引物，0． 625 mmol·L －1 dNTP，1． 5 U
TaqDNA聚合酶，2．0 mmol·L －1 MgCl2，2．0 μL 10 × PCR缓冲液．
中国佛手瓜划分成绿皮有刺、绿皮无刺、白皮有刺和白皮无刺 4 个品种类型［3］．所收集的 10 个佛手瓜
品种的多态性比率仅为 54．38%，亲缘关系较近．果面有刚刺的 E、J、G、H亲缘关系更近，而果皮的颜色相
同的 E和 I亲缘关系相对较远，这可能是由于控制果皮颜色的基因差异小，表现不明显所致．
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( 责任编辑: 吴显达)
·495· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 41 卷