全 文 ：珠子参对人早幼粒白血病HL-60细胞
增殖的抑制和诱导分化作用的研究
陈　涛　龚张斌1
(三峡大学医学院·宜昌 443003　1上海中医药大学·上海 201203)
摘　要　目的:观察珠子参对人早幼粒白血病HL-60细胞增殖的抑制和诱导分化作用。 方法:采用 HL
-60细胞株体外培养 ,MTT 法观察各药物及含药血清不同作用时间的直接细胞毒作用;细胞涂片观察细
胞形态学改变;试剂盒检测酸性磷酸酶(ACP)含量。结果:珠子参血清和珠子参煎液均有明显的细胞毒
作用 , 72小时时抑制率分别为 31.27%、34.23%, 与 5 -氟脲嘧啶(5 -FU)联合应用后 , 达 73.32%、
76.28%;作用 72小时后 ACP活性高于对照组(P<0.01)。细胞形态学观察以中幼粒及晚幼粒为主 , 分别
占 36.8%、75.8%, 向成熟细胞方向分化。结论:珠子参在体外对 HL-60 细胞株有细胞毒作用 ,且能提高
5-FU的敏感性 , 有诱导 HL-60 细胞分化的功能。
主题词　珠子参 药理学　HL-60 药物作用　细胞增殖　诱导分化　血清药理学
　　珠子参(Panax japlcus var ,Major)又名扣子七 , 属五加科
人参属植物 ,根茎入药 , 具活血散瘀 、补血止血 、消肿止痛之
功 ,主要分布于东喜马拉雅至我国西部山区。目前已从珠子
参各种属珠子参根茎及叶中共分离出 25 个皂苷 , 多数为三
萜皂苷。从结构上分析 ,珠子参极可能具有诱导肿瘤细胞分
化的作用。但到目前为止 , 珠子参用于抗肿瘤方面的研究 ,
尚属空白。本文以人早幼粒白血病 HL-60 细胞株为对象 ,
用体外细胞培养的方法 ,探讨珠子参抗癌及诱导肿瘤细胞分
化的作用 ,报告如下。
1　材料
1.1　实验动物和细胞株　日本大耳白兔 4 只 , 雌性 , 体重
(2.5±0.1)kg , 购自同济医科大学实验动物中心 , 动物合格
证:医动字第 19 -052 号。HL-60 细胞株(人早幼粒白血
病):购自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
1.2　主要药品与试剂　珠子参:产于湖北省神农架林区 , 经
宜昌市药品检验所鉴定。打为细粉 , 蒸馏水浸泡 6 小时 , 置
圆底烧瓶内 ,用 KDM型调温加热套加热 , 挥发油提取器提取
挥发油和芳香成分后 , 转为 50℃浸煎 30 分钟提取水溶性成
分 ,纱布过滤取汁后 , 药渣加水再煮沸 , 转为 50℃浸煎 30 分
钟 ,共煎 3 次 ,药液混合 , 加热浓缩定容 , 与挥发油等混匀制
成口服液 , 终浓度为含生药 0.2g/ ml , 经 0.22μm 微孔滤膜过
滤除菌 , 4℃保存。 5-氟脲嘧啶(5-FU):天津氨基酸公司人
民制药厂生产 ,针剂 , 250mg/支 , 避光常温保存。 3-(4 , 5)双
甲基-2-唑噻-(2 , 5)-二苯基溴化四氨唑蓝(MTT):Fluka
公司产品 , 用 pH7.2、0.01M PBS 配成 5mg/ml 溶液 , 过滤除
菌 ,避光 4℃保存。十二烷基磺酸钠(SDS):Sigma 公司产品。
酸性磷酸酶试剂盒 、考马斯亮蓝:南京建成生物工程研究所
产品。
2　方法
2.1　药物血清的制备　日本大耳白兔 4 只 , 分为生理盐水
组(简称空白对照组)2只 , 珠子参组(简称PJ 组 , 1.3g kg), 西
药 5-FU 组(简称 5-FU组 , 25mg kg)各 1 只。珠子参组每
日分 2 次灌胃珠子参煎液 , 每次 20ml , 共 11 次;同时生理盐
水 50ml耳缘静脉滴注 , 每天 1 次 , 共 3 次。 5-Fu 组予生理
盐水 20ml 每日 2 次灌胃 , 共 11 次 , 同时耳缘静脉滴注 5-
Fu50ml , 每天 1 次 , 共 3 次。空白组:灌胃 、滴注等量生理盐
水。
最后一次给药前禁食 12 小时 ,灌胃给药 1 小时 、静脉滴
注 30分钟后 , 固定兔子 , 局部消毒 , 无菌巾遮盖 , 不麻醉 , 心
脏取血 40ml , 注入无菌离心管内。 37℃水浴箱内静置 30 分
钟促凝血 , 1000r min 离心 10 分钟 , 取上清 , 注入对应新离心
管中 , 3500r min离心 20 分钟 2 次 ,取上清 , 56℃30分钟灭活 ,
0.22μm 微孔滤膜过滤后 , 分装 EP 管 , -20℃保存 ,经培养实
验证明无微生物污染后使用。
2.2　分组及给药　对照组血清 、PJ 组血清 、5-FU 组血清 、
小牛组血清直接加入 RPMI-1640 培养基 , 终浓度为含 10%
血清。PJ 组:将经过过滤除菌的珠子参煎液以及对照组血
清加入 RPMI-1640 培养液 , 终浓度为含 10%血清 , 100μg/ ml
药液。5-Fu 组:避光保存的 5-FU 经 0.22μm 滤膜过滤除
菌 ,和对照组血清加入 RPMI-1640培养液 ,终浓度为含 10%
血清 , 50μg ml药液。两种血清组:将珠子参血清组培养基与
5-FU血清组培养基对半混匀。两种药物组:将中药组培养
基与西药组培养基对半混匀。 以上各组培养基均调整 pH
值为 7.2。
2.3　细胞培养　细胞培养方法参照文献[1] 。HL-60 细胞
复苏后在含 10%小牛血清的 RPMI-1640 培养液 , 5%CO2 ,
37℃条件下传代培养 , 至对数生长期后 ,分组 ,加入相应培养
基及血清后 , 调整浓度至 2×105 个/ml。
2.4　细胞毒实验　方法参照文献[2] 。每组一瓶各取细胞悬
液接种于 96孔培养板 , 每组 3 板 , 每板设 5 个平行孔 , 每孔
·278· 中国中医药科技 2009 年 7月第 16 卷第 4期 July 2009 Vol.16 No.4
100μl(含细胞 2×104 个/孔), 分别在加入血清后 24、48、72 小
时加入 20μlMTT贮液 , 使 MTT 浓度为 0.9mg ml , 继续温育 4
小时 ,超速低温离心机 1000r min离心 5 分钟 ,直接翻板法甩
干上清 , 加入 10%SDS(含 0.01mol L HCl)100μl 孔 , 震荡 5 分
钟 ,摇匀 ,以完全溶解微小紫蓝色结晶 ,迅速于酶标仪 570nm
处测定各孔吸光度(0D值)。
细胞抑制率=1-实验组 OD均值对照组OD均值 ×100%
2.5　诱导分化实验
2.5.1　酸性磷酸酶(ACP)检测　按试剂盒说明进行。
2.5.2　细胞形态学分级　每瓶 HL-60 细胞悬液离心 , 弃上
清 ,取沉淀涂片 , 迅速风干 , Wright-Giemsa 染色 10 分钟 , 蒸
馏水轻轻冲洗 ,风干后 , 油镜下观察 , 记数 200 个细胞 , 分级
标准参照文献[ 3] 。
2.6　统计分析方法 　数据采用单因素方差分析 , 应用
SPSS10.0 在 PC 上进行处理。并采用 SNK 法进行组间比较。
3　实验结果
3.1　各组的细胞毒作用　结果见表 1。
表 1 各时间段各组细胞的抑制率
组别
24h　　 48h　 72h　
OD值 抑制率(%)OD 值 抑制率(%)OD值 抑制率(%)
对照组 0.486 0.694 0.742
小牛组 0.576△△ 0.702 0.742
5FU 组 0.422△△＊ 13.17 0.364△△ 47.55 0.402△△ 45.82
5FU 血清组 0.456 6.17 0.388△△ 44.09 0.406△△ 45.28
PJ组 0.440△＊ 9.47 0.468△△ 32.56 0.488△ 34.23
PJ血清组 0.560△△ 0.496△△ 28.53 0.510△ 31.27
两种药物 0.194△△＊## 60.08 0.172△△## 75.22 0.176△△## 76.28
两血清组 0.380△△## 21.81 0.188△△## 72.91 0.198△△## 73.32
　　与对照组比较△P<0.05 , △△P<0.01;与血清组比较＊P<0.
05;与单独用药和单独使用血清组比较#P<0.05 , ##P<0.01(下
同)
3.2　各组对 HL-60细胞的诱导分化作用
3.2.1　各组 ACP 活性的检测　结果见表 2。
表 2 各组 72h时 ACP活性比较( x±s)
组别 蛋白含量(g L) ACP活性(U g·prot·min-1)
对照组 0.4949±0.0411 9.0886±0.0153
PJ组 0.3092±0.0116△△ 16.0122±1.8060△△
PJ血清组 0.3227±0.0004△△ 13.6107±1.8315△△
两种药物 0.2889±0.0200△△ 15.5043±0.3531△△
两种血清组 0.3454±0.0003△△ 12.6131±0.4173△△
3.2.2　各组细胞形态分级　结果见表 3。
表 3 各组细胞 72h时形态学分级(x±s , %)
组别 早幼粒 中幼粒 晚幼粒 杆状核 分叶 肿胀 固缩 分裂
对照组 79.3 12.0 6.98 0.3 0 0.5 0 0.92
PJ组 9.0 34.1 41.7 0 0 7.6 7.1 0.47
PJ血清组 4.55 18.6 18.2 1.36 0 5 32.7 4.09
两种药组 9.9 26.7 57.9 0 0 1.98 1.99 1.49
两种血清组 16.4 36.1 36.1 0.91 0.46 5.94 2.28 1.37
　　4　讨论　
用HL-60 细胞株进行直接细胞毒实验 , 表明珠子参有
确切的抑瘤效应。结果显示 , 在相同的背景条件下 , 珠子参
血清组及珠子参药物组 24 小时抑制率很低 , 药物组仅为
9.47%, 血清组细胞生长甚至优于对照组 , 48 小时时细胞抑
制率为 28.53%和 32.56%, 72 小时达到 31.27%和 34.23%,
抑制强度与其作用时间有较密切的关系。分析 24 小时药物
血清组的结果可能是因为珠子参可以促进白细胞的生长 ,但
在作用时间加长后 , 又能抑制幼稚细胞的生长 , 起到双向调
节作用 , 具体机理有待进一步实验来证实。 5-FU 不是治疗
白血病的常用药物 , 本次实验发现其体外细胞抑制率仅为
40%左右 ,与文献报道相近 , 但在血清或药物与珠子参联合
应用后 ,抑制率显著升高 , 达 73.32%、76.28%, 说明珠子参
不但在一定浓度下能直接抑制 HL-60 增殖 , 还能通过提高
细胞株对 5-FU的敏感性而与化疗药物起协同作用 , 其具体
机理有待进一步的探讨。
HL-60 细胞最大特点是在分化诱导剂作用下可向粒细
胞系统或巨噬细胞系统两个方向分化 , 广泛应用于分化诱导
剂的寻找和分化诱导剂作用机理的研究。在珠子参血清作
用 72小时后 ,HL-60 中幼粒及晚幼粒细胞比例为 36.8%,
而珠子参组达到 75.8%;酸性磷酸酶(acid phosphatase ,
ACP)[ 7]系统命名为邻磷酸单脂磷酸水解酶 , 是巨噬细胞的
标志酶之一 ,主要定位于溶酶体内[ 8] , 在酸性条件下除可水
解磷酸酶外 ,还可催化磷酸基因的转移。ACP含量的高低可
反映细胞的成熟程度。经珠子参血清或珠子参作用后 , ACP
活性升高至 13.6107 、16.0122(U/g·prot·min -1), 明显高于对
照组。形态学及生化指标改变一致 , 显示珠子参血清或珠子
参在体外有诱导 HL-60 细胞向成熟巨噬细胞系统分化的作
用。5-FU 也具有一定的诱导分化能力[ 9] , 但在本次实验
中 , 5-FU和珠子参无论是直接添加药物还是药物血清共同
作用 ,其对 HL-60 细胞诱导分化的能力都在统计学上无显
著差异。
此外 , 体外培养的 HL-60 细胞油镜下观察到珠子参血
清作用 72 小时后有 48.6%癌细胞发生核固缩 、浓聚 , 断裂成
许多核片段 ,呈致密紫蓝色大小不等颗粒 , 表明珠子参具有
一定诱导肿瘤细胞凋亡的作用。由于本次实验未进行凋亡
指数的检测 ,且电镜下无明显可见的凋亡小体形成 , 其诱导
凋亡能力的强弱及机制有待进一步实验证明。
　　参考文献
1　鄂征.组织培养与分子细胞技术.北京:北京出版社 ,1995:133.
2　朱立平 ,陈学清主编.免疫学常用实验方法.北京:人民军医出
版社 , 2000:193.
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医科大学联合出版社 , 1997:130.
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胞药效.上海免疫学杂志, 2000 , 20(2):107.
5　陈惠黎主编.生化检测技术.北京:人民卫生出版社 , l995:139.
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影响.解剖学报 ,2000 , 24(4):307.
7　鄂征主编.癌变机理研究.北京:北京出版社 ,1999:383.
(收稿:2008-04-29)
·279·中国中医药科技 2009年 7 月第 16卷第 4 期 July 2009 Vol.16 No.4