全 文 ：太行菊顶芽离体高效再生系的建立＊
王建博　徐思明　董　鹏　孙　佳　李学东＊＊
(首都师范大学生命科学学院 ,北京　100037)
摘 要
　　采用太行菊茎尖组培快繁技术 ,建立了太行菊无菌顶芽离体试管苗再生体系.通过 MS 培养基和激素配比实
验 ,筛选出太行菊组织培养与快速繁殖的最佳培养基配方.结果表明:最适宜的外植体是幼嫩太行菊植株的茎顶
芽;诱导愈伤组织的最适培养基为:MS+NAA 0.2 mg L+6-BA 2.0 mg L;诱导丛生芽的最适培养基为:MS+NAA 0.2
mg L+6-BA 2.0 mg L+IBA 0.1 mg L、MS+NAA 0.2 mg L+6-BA 1.0 mg L;诱导试管苗生根的最适培养基为:1 2 MS
+NAA 0.2mg L;Ca2+可明显提高芽的再生率;电子显微镜进行病毒检测后 , 筛选出3 个脱病毒株系可提供优质种苗
的种源.
关键词:太行菊 , 快速繁殖 ,愈伤组织 , 土壤分析 ,病毒检测.
中图分类号:Q 949.783.5
收稿日期:2007-17-25
＊首都师范大学学生处科研立项项目
＊＊通讯作者.
　　太行菊(Opisthopapus taihangensis)(图 1)是菊科
太行菊属的多年生宿根草本植物 ,为太行山特有属 ,
仅有 2种 ,主要分布在河北:邢台 、武安 、磁县;山西:
陵川 、晋城;河南:林县 、辉县 、济源等地区 ,分布范围
十分狭窄 ,多生于海拔1 000 m左右的山坡上以及悬
崖峭壁的石缝中 ,生境险峻 ,人常难以到达.植物体
通体富含芳香油 ,干后香味持久.太行菊入秋后花色
洁白或粉红 ,花期长达 3 ～ 4个月 ,耐旱 、耐荫 、耐寒 ,
适于家养和园艺栽培 ,具有很高的观赏价值和经济
价值 ,由于分布区狭窄 ,繁殖能力较弱 ,太行菊现处
于濒危状态 ,已被列为国家珍稀保护植物及河南省
重点保护植物 ,列入极危物种范畴.关于太行菊组织
培养的研究 ,目前国内文献仅见姚连芳教授等人对
茎顶芽和茎段进行的有关研究[ 1] ,至于培养基的改
良与快速繁殖的研究 ,国内外尚未见报道.鉴于该物
种采用传统方法繁殖效率较低 ,本实验首次以茎顶
芽与带腋芽的茎段为外植体 ,比较系统地对太行菊
的组培快繁进行研究 ,以期建立太行菊顶芽离体的
高效再生系.
图 1　太行菊
1　材料与方法
1.1　外植体选择
选用采集自山西省陵川县太行山区生长旺盛 ,
健壮的太行菊植株作为试验材料.外植体取之于完
全展开 、绿色的叶片.叶片首先用自来水冲洗2 h ,后
用 75%酒精先浸泡 ,最后用无菌水冲洗 3 ～ 4遍.
1.2　培养基配制
本实验所用培养基均以 MS培养基为基本培养
基 ,琼脂含量为 0.7%,葡萄糖浓度 3%, pH 值刚
NaOH 或HCl(1 mol L)调到 5.8 , 121 ℃,0.15 MPa 灭
菌 15 min.
1.3　方法与条件
为了研究不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导
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第 29 卷　第 5 期
2008 年 10 月
首都师范大学学报(自然科学版)
Journal of Capital Normal University
(Natural Science Edition)
　
No.5
Oct., 2008
的影响 ,设计了 12种不同的培养基分别对顶芽和茎
段进行培养(表 1),在超净工作台上用 70%酒精消
毒10 s ,无菌水冲洗 5 ～ 6 遍 , 0.1% HgCl2 消毒 5
min ,无菌水冲洗 7遍.用无菌吸水纸将材料上的水
分吸干 ,把材料放在无菌培养皿中 ,用解剖刀切取茎
顶7 ～ 8 mm 长 ,接种于培养基上 ,每瓶接三个顶芽
或茎段 ,每个品种在每个处理上做 5次重复.放于
16 h 8 h光周期 , 23+2 ℃, 1 500 ～ 2 000 lux 光照强
度下进行培养.定期观察 、记录外植体生长状况.
2　实验步骤
2.1　诱导愈伤组织
在以上12组培养基中培养 2周以后 ,顶芽 、茎
段均开始膨大 ,形成一个半球形黄绿色愈伤组织块.
此时分别统计培养基中外植体的增值倍数和愈伤组
织数量 ,列入 3和表 4.
由于培养顶芽与培养茎段的培养基组成成分和
比例完全相同 ,分为 A 、B两只是为区分培养部位 ,
把A1 , B1合称为 M1 组 , 其他组别的命名 ,依次类
推.由表 2 、3可以看出 ,不同的培养基对外植体扩增
倍数和外植体形成愈伤组织数量影响不同.M5-8
组 、M9-12组处理的影响较M1-4组大 ,M5-8组
表 1　愈伤组织诱导培养基
接种部位 组别 培养基 组成部分 mg·L-1
顶芽培养
茎段培养
1
2
3
1
2
3
A1 MS+NAA 0.1+6-BA 0.5
A2 MS+NAA 0.1+6-BA 1.0
A3 MS+NAA 0.1+6-BA 1.5
A4 MS+NAA 0.1+6-BA 2.5
A5 MS+NAA 0.2+6-BA 0.5
A6 MS+NAA 0.2+6-BA 1.0
A7 MS+NAA 0.2+6-BA 1.5
A8 MS+NAA 0.2+6-BA 2.0
A9 MS+NAA 0.3+6-BA 0.5
A10 MS+NAA 0.3+6-BA 1.0
A11 MS+NAA 0.3+6-BA 1.5
A12 MS+NAA 0.3+6-BA 2.0
B1 MS+NAA 0.1+6-BA 0.5
B2 MS+NAA 0.1+6-BA 1.0
B3 MS+NAA 0.1+6-BA 1.5
B4 MS+NAA 0.1+6-BA 2.0
B5 MS+NAA 0.2+6-BA 2.0
B6 MS+NAA 0.2+6-BA 0.5
B7 MS+NAA 0.2+6-BA 1.5
B8 MS+NAA 0.2+6-BA 2.0
B9 MS+NAA 0.3+6-BA 0.5
B10 MS+NAA 0.3+6-BA 1.0
B11 MS+NAA 0.3+6-BA 1.5
B12 MS+NAA 0.0+6-BA 2.0
表 2　不同培养基对外植体扩增倍数的影响
培养基 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12
培养基 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
培养数 0.9 1.1 1.3 1.4 2.7 2.8 2.8 3.0 1.5 1.7 1.8 2.0
表 3　不同培养基对诱导愈伤组织的影响
培养基 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12
培养基 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
愈伤组织数量 0 6 1 6 1 6 1 6 2 6 3 6 3 6 4 6 1 6 2 6 1 6 2 6
最大.由于三组不同生长素处理中细胞分裂素 BA
的浓度梯度相同 ,所以培养初期出现的差别只可能
由于生长素的浓度不同造成.当培养基中添加 2 ,4-
D和赤霉素时 ,愈伤组织诱导率很低 ,并且颜色为淡
黄色 ,S Kintzi和 C Manos也观测到同样的结果[ 2] .李
辛雷等报道了 NAA 浓度升高时 ,丛生芽诱导率下
降[ 3] .综上可得 ,M5-8组的 NAA浓度更适合诱导愈
伤组织形成.
愈伤组织在前期生长速度缓慢(可能与太行菊
本身分株能力较弱有关),外植体接种 4周左右愈伤
组织只有 8 ～ 9 mm2大小.6周后愈伤组织生长速度
开始加快 ,并部分开始向小芽分化.在接有顶芽的
MS培养基上 ,约 8周左右可形成 80 ～ 90 mm2 的不
定芽;在同样时间内在接有茎段的培养基上 ,愈伤组
织长到 40 ～ 50 mm2 就不再继续生长 ,说明太行菊带
有顶芽或腋芽的茎段在MS 培养基上都可诱导愈伤
组织产生 ,但差别明显(见表 4).在接有顶芽的培养
基上的愈伤组织诱导率是 90.9%,而在接有茎段的
培养基上的愈伤组织诱导率只有 38.2%.以上结果
说明:顶芽较茎段有更强的脱分化能力.因此 ,选择
生长状况更好的顶芽作为诱导愈伤组织的材料.
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首都师范大学学报(自然科学版) 2008年
表 4　不同外植体诱导愈伤组织的比较
部位
培养基
糖浓度
%
接种顶芽
或茎段
数 个
污染数
个
成活顶芽
茎段数
个
形成愈伤
组织顶
芽 茎段
数 个
愈伤组
织诱导
率
%
顶芽 3 36 3 33 30 90.9
茎段 3 36 2 34 13 38.2
实验中还观察到 ,由于茎段两端存在着极性差
异 ,所以分化情况也存有差异.在诱导愈伤组织时 ,
茎段切段的远轴端先形成愈伤组织且数量多;而近
轴端后形成愈伤组织且数量少 ,两者之间初始形成
愈伤组织的时间相差约一周.
2.2　继代培养
表6结果显示 ,第 2 、7 、8组培养基更有利于太
行菊愈伤组织的分化.这三组培养基中均含有生长
素NAA.在第 2组中 ,NAA和 IBA 共同使用 ,起到了
更好的效果 ,从原理上分析 NAA 与 IBA 均为生长
素 ,二者具有相同的调节功能[ 4] ,可选择一种使用或
在降低其中一种浓度的情况下同时使用.第 7 组用
KT替代了 6-BA 作为细胞分裂素起到了很好的作
用.在实验中还发现从扩增数量上看 ,含 6-BA 的组
普遍较高 ,从生长状况上看含 KT 的组普遍较含 6-
BA的组要好.
表 5　继代培养基
培养基 组成部分 mg·L-1
S1 MS+NAA 0.2+6-BA 2.0+IAA 0.1
S2 MS+NAA 0.2+6-BA 2.0+IBA 0.1
S3 MS+IAA 0.4+6-BA 2.0
S4 MS+IBA 0.4+6-BA 2.0
S5 MS+IAA 0.4+6-KT 1.0
S6 MS+IBA 0.4+KT 1.0
S7 MS+BAA 0.2+KT 1.0
S8 MS+NAA 0.2+BA 1.0
表 6　不同培养基对继代培养的影响
培养基 培养数 株 污染物 增值倍数
S1 9 1 1.5
S2 9 0 3.2
S3 9 2 1.1
S4 9 0 1.9
S5 9 1 1.7
S6 9 0 1.8
S7 9 1 2.8
S8 9 0 3.0
考虑到继代培养时需大量扩繁 ,在保留了 MS
母液和生长素的基础 ,把每个处理的细胞分裂素浓
度向上提高 0.5 mg L(继代培养需更高的细胞分裂
素 生长素的浓度比[ 5]).对太行菊生境的实地考察 ,
发现太行菊多生在峡谷内阳坡绝壁的石缝内 ,通过
对采集太行山区土壤与周边丘陵平原地带进行比对
分析后发现 ,该地区土壤中钙含量较高.经测定 ,太
行菊植物体内的钙元素含量也高于其它平原植物 ,
体现出钙元素偏高的一致性 ,这也意味着该植物生
长对钙元素的要求较高.因此 ,改良培养基配方 ,加
倍添加了MS 母液中钙离子浓度 ,经筛选得到继代
培养基组成:MS+NAA0.2+6-BA2.0;MS+NAA0.2
+KT1.5;MS+NAA 0.2+IBA0.1+6-BA 2.0.
继代培养 3 ～ 4代后丛生芽逐渐变得茁壮起来 ,
但随着继代代数的增加 ,继代培养的组培苗外观形
态呈半透明状的玻璃化现象.考察了造成玻璃化的
几方面因素后 ,加大了琼脂在培养基中的含量(在以
后实验中将浓度上调至 0.8%);在不能降低整体光
照强度的情况下 ,采取了套袋处理的方法以及短时
间高光强与长时间黑暗培养交替进行的方式培养 ,
加大温差 ,结果玻璃化现象有所减少.
2.3　从生芽的诱导
不同激素的配比对太行菊愈伤组织诱导率的影
响较大 ,实验结果经 F 值测定表明:各处理间差异
达到显著水平(F=5.238＊, F0.95=3.86).从结果中
还可以看出 ,当 IBA 浓度一定时 , NAA 浓度低于
0.05 mg L 和高于 0.20 mg L 时 ,对愈伤组织的诱导
不利 , IBA 为 0.10 mg L 时 , NAA 浓度为 0.10 mg L
时 ,愈伤组织诱导率最高.经回归分析认为在设置的
16 个处理中 , IBA 浓度为 0.10 mg L , NAA 浓度
0.10mg L的激素配比对太行菊愈伤组织的诱导最
好.
表 7　不同浓度的NAA IBA对丛生芽形成的影响 %
IBA
mg·L-1
NAA mg·L -1
0.05 0.10 0.15 0.20
0.05 65.4 78.7 89.2 84.4
0.10 82.3 99.6 99.0 91.6
0.15 90.4 93.9 95.6 92.4
0.20 85.8 87.4 88.5 85.4
从表 8中可以看出以上各个处理都可以促使愈
伤组织块诱导产生丛生芽.随着 6-BA 的浓度的升
高 ,丛生芽的高度 、形成的丛生芽数量 、丛生芽叶片
数量也都呈上升的趋势 ,形成丛生芽时间相应缩短 ,
但当 6-BA 浓度超过某一浓度时(0.05 mg L)时 ,丛
生芽的高度反而下降 ,形成丛生芽时间相应增加 ,这
时随着 6-BA浓度升高形成丛生芽的数量呈下降的
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第 5期 王建博等:太行菊顶芽离体高效再生系的建立
趋势而且丛生芽的也长得较弱.只有一定浓度 NAA
(或 IBA)(0.2 mg L)与一定浓度的 6-BA(0.05 mg L)
相配合才能使诱导的丛生芽数量比较多 、高度适中 、
健壮且多数为多叶芽苗 ,这有利于进一步的生根培
养和保证移栽的成活率.
表 8　不同 6-BA浓度对诱导丛生芽的影响
培养基 No.
6-
BA
mg·L-1
形成丛生
芽所需天
数 d
平均组织
块形成的
丛生芽
数 株
丛生芽
高度
cm
丛生芽
叶片数
片
MS+NAA
0.15
(mg L)
MS+NAA
0.1+IBA
0.1
(mg L)
M1 0.01 60 1.5 0.8 4
M2 0.03 56 1.7 1.1 3
M3 0.05 46 4.2 2.0 12
M4 0.07 50 3.5 1.8 9
M5 0.01 65 1.6 0.5 5
M6 0.03 54 1.8 1.3 4
M7 0.05 48 4.1 2.1 11
M8 0.07 59 3.4 1.6 7
图 2　不同 6-BA浓度对丛生芽诱导率的影响
表 9　不同浓度的激素组合对太行菊生根的影响
培养基 组成成分 外植体数 分化数 平均高度 cm
生根
数
N1
1 2 MS+
NAA 0.1 mg L 30 75 3.0 3
N2
1 2 MS+
NAA 0.2 mg L 30 80 3.2 6
N3
MS+NAA
0.1 mg L 30 85 3.5 0
N4
MS+NAA
0.2 mg L 30 82 4.0 1
结果显示 ,完全 MS 有利于外植体诱导愈伤组
织和扩繁分化 , 1 2MS利于生根 ,并且组合较高浓度
的生长素更有利于生根[ 6] .所以应根据不同目的 ,在
不同阶段使用不同培养基 ,初期以扩繁为主要目的 ,
宜使用完全MS培养基;生根前宜使用 1 2 MS 培养
基 ,得到完整大量的根系 ,有利于后面移栽成活率的
提高.在N2培养基上的芽苗 12d开始长根 ,且根的
生长迅速 ,较粗壮 ,数量多(5 ～ 7 条).在 N1培养基
上的芽苗 18 d才开始长根 ,且根比较短 ,数量少(1
～ 2条).从移栽成活的角度来考虑 ,生根培养基以
N2较为适宜.各阶段培养的实物照片如图3所示.
2.4　太行菊的病毒检测
目前侵袭菊科植物的病毒不下 10余种 ,如菊花
矮缩类病毒CSC ,菊花番茄不孕病毒 TAV ,烟草花叶
病毒 TMV ,黄瓜花叶病毒 CMV ,马铃薯病毒 PVX ,马
铃薯 Y病毒等[ 7] .
取经过脱病毒和繁殖的试管苗材料 1 g(约为 6
个高为 1 ～ 2 cm 带有 1 ～ 2个节的无菌苗),加入 2
倍体积的 0.2 mol L PBS 磷酸盐缓冲液(含 1%巯基
乙醇 ,pH=7.2)捣碎 ,研磨 ,1 000 g离心 30 min取上
清液.用 2%磷钨酸(pH=6.8)负染色 2 min ,在电子
显微镜(HITACH-7000型)下观察 ,每个样品做 3 个
铜网 ,每个铜网至少取 20个不同视野检测病毒 ,并
以未脱毒样品作为对照 ,确认所含病毒类型的基本
形态和特征.为了确认脱病毒效果 ,对脱病毒前后的
太行菊试管苗进行了病毒检测.在未脱病毒样品中 ,
主要观察到了大量长约 600 nm 的直杆状烟草花叶
病毒 、大量直径约为40 nm的球形黄瓜花叶病毒.对
茎顶芽培养成活的株系样品反复进行了病毒检测 ,
其中有 3个株系的样品在所有视野中均没有观察到
病毒(占所观察样品总数的 80%),其余株系的样品
视野中均有少量病毒 ,予以淘汰.对脱病毒的株系保
留并繁殖 ,可作为今后提供无病毒优质种苗的种源.
3　炼苗及移栽
将生根后 15 d的再生植株去掉封口膜 ,从培养
瓶中取出 ,在清水中浸泡 2 ～ 3小时 ,轻轻洗去根部
的培养基.炼苗3 ～ 5 d ,然后移栽于河泥+细沙(2∶
1)混合基质中[ 8] ,用塑料薄膜覆盖 ,湿度保持 85%
左右.10 d后完全揭掉地膜 ,15 d后用稀释的大量元
素进行喷施 ,成活率可达 90%以上.当移栽苗长至
15 ～ 20 cm时 ,带土移栽至大田 ,灌足水 ,缓苗 1周后
便开始旺盛生长 ,带土移栽的成活率为 98%.
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首都师范大学学报(自然科学版) 2008年
图 3　各阶段实物照片
4　结　论
本实验以太行菊茎顶芽与带腋芽的茎段为外植
体对太行菊进行组织培养研究 , 实验过程中采用
spss软件对实验数据进行分析 ,采用土壤分析的方
法分析太行菊生存环境 ,筛选改良得到更适宜其生
长的培养基.结果表明:最适宜的外植体是幼嫩太行
菊植株的茎顶芽 ,诱导愈伤组织的最适培养基为:
MS+NAA 0.2 mg L+6-BA 2.0 mg L ,在诱导过程中 ,
茎段切段的远轴端先形成愈伤组织且数量多 ,而近
轴端后形成愈伤组织且数量少.诱导丛生芽的最适
培养基为:MS+NAA 0.2 mg L+6-BA 2.0 mg L+IBA
0.1 mg L 、MS+NAA 0.2 mg L+6-BA 1.0 mg L ,切块
大小以20 ～ 25 mm2 为宜;诱导试管苗生根的最适培
养基为:1 2 MS+NAA 0.2 mg L;用电子显微镜进行
病毒检测后 ,筛选出 2个脱病毒株系 ,脱病毒试管苗
可作为今后提供优质种苗的种源.选择河泥+细沙
(2∶1)混合作移栽基质 ,成活率达 90%以上.
5　讨　论
目前使用较多的快繁方法是扦插 、嫁接 、组织培
养 、人工种子等.为了证明组培的快繁效果 ,我们同
时也平行实验了其他的方法.由于太行菊属于多年
生宿根草本植物 ,从植株结构形态上不具有进行嫁
接的条件;而人工种子的的方法成本高 、投入大 ,鉴
于经济原因 ,我们没能采用此方法.以下是扦插实
验[ 9] 的结果 ,由下图可得 ,不论开始扦插的植株部位
如何 ,最终的成活率都很低.
图 4　不同植株部位的扦插结果比较
实验还遇到了植株玻璃化的情况 ,后来通过查
阅资料发现[ 10] ,上问提到的控制光强的手段不仅防
止玻璃化的产生 ,还在一定程度上预防了外植体褐
变情况的发生.对此方面我们没有能继续探究 ,是否
影响玻璃化的原因与褐变的因素在一定程度上有所
联系 ,这些问题有待于我们进一步的研究.
49
第 5期 王建博等:太行菊顶芽离体高效再生系的建立
6　意义与进展
本实验建立了经过愈伤组织的太行菊高效离体
再生体系 ,经实验筛选出的适合太行菊快繁的培养
基配方 、培养条件等一系列结论将为进一步大量培
养该植物提供技术支持.与前人的研究结果相比 ,这
种方法具有不伤害母株 、增殖系数高等优势 ,对于这
种珍稀 、特异资源的组织培养具有优越性.培养基经
筛选改良后 ,诱导愈伤组织 、继代培养以及生根的周
期明显缩短 ,更适于太行菊的快速繁殖和茁壮生长.
利用组培快繁途径 ,建立太行菊无性系 ,为使野生太
行菊成为优良的观赏香料植物和区系研究材料创造
条件 ,并可进一步用于太行菊基因工程育种研究 ,提
供遗传转化的良好受体系统 ,濒危物种保护等多个
方面 ,具有广泛的应用前景.
参 考 文 献
[ 1] 　姚连芳 , 董美华 ,毛玉收.太行菊组织培养研究[ J] .中国农学通报 , 2004 , 20(6):29-31.
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Estabalishment of High Efficient Regeneration in vitro
from Shoot tip of Opisthopapus taihangensis
Wang Jianbo　Xu Siming　Dong Peng　Sun Jia　Li Xuedong
(College of Life Science , Capital Normal University , Beijing　100037)
Abstract
The shoot tip of Opisthopapus taihangensis were used as explants to produce plantlets in vitro.A virus-free
regeneration system from shoot tip of Opisthopapus taihangensis was developed.A series of optimization experiment for
cultural medium composition and concentration of phytohormones were investigated with a view to accelerate the
propagation of virus-free materials.The results indicated that the most suitable explant was the tender shoot tip.It was
shown that MS medium supplemented with NAA 0.2 mg L+6-BA 2.0 mg L was good for callus induction , while MS
medium containing NAA 0.2 mg L+6-BA 2.0 mg L+IBA 0.1 mg L , NAA 0.2 mg L+6-BA(KT)1.0 mg L , half-
strength MS medium containing NAA 0.2 mg L gave best result for shoot induction and for rooting , respectively.Ca2+
enhanced shoot induction rate.Each tissue piece is suitable at the size of 20-25 mm2.Virus-free materials were found
repeatedly under electron microscope and 3Virus-free strains were selected , which could be used as the source for rapid-
propagation.
Key words:Opisthopapus taihangensis , rapid propagation , callus , soil analysis , virus testing.
作者简介　王建博(1985—), 男 , 北京人 , 首都师范大学生命科学学院本科三年级学生 , 本实验项目负责人.E-mail:Jason-
wangjianbo@sina.com
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首都师范大学学报(自然科学版) 2008年