全 文 ：福建林学院学报　2006, 26(2):169 -172
Jou rna l of Fujian Co llege of Fo restry
濒危植物七子花 ISSR反应体系的优化
李钧敏 , 金则新
(台州学院生态研究所 , 浙江 临海 317000)
摘要:以濒危植物七子花基因组 DNA为研究对象 , 测试了 ISSR-PCR反应体系的最适退火温
度 , 并利用单因素试验测试了镁离子浓度 , dNTP浓度 , 模板 DNA含量 , Taq DNA聚合酶量 、
BSA浓度 、 引物用量 、甘油浓度对反应结果的影响 , 可知七子花 ISSR分析较适宜的扩增条件
是:10 μL PCR反应体积 , 1×Taq酶配套缓冲液 (10 mmo l L- 1 Tris HC l pH 9.0, 50 mmo l L -1
KC l, 0.1% T riton X-100), 2.0mmol L -1 MgC l2 , 0.75 U Taq酶 (上海华美公司 ), 10 ng模板
DNA , 6 pmo l引物 (上海 Sangon公司 );dATP、 dCTP 、 dGTP 、 dTTP各 0.2mmol L -1.
关键词:七子花; ISSR;优化
中图分类号:Q948.1　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1001 - 389X(2006)02 - 0169 - 04
Optmi ization of ISSR reaction system in endangered
plantHeptacodium m iconioides
LI Jun-m in, JIN Ze-x in
(E cology Institute of Taizhou Un iversity, Linh ai317000, C hina)
Abstrac t:The ISSR reac tion sy stem of endangered p lan tHeptacod ium m iconioides w as op tim ized.The annea ling tem pe ra ture w as
confirm ed and the effect ofM g2+ concentra tion, dNTP concentration, DNA tem pla te s dosage, Taq DNA po lym erase do sage, BSA
concentra tion, prime r dosage and g ly ce ro l concentration on ISSR am plification w ere tested by using sing le factorm ethod. The optim al
reac tion sy stem of ISSR for H. m iconioides w as de te rm ined as fo llow s:1 ×Taq po lyme rase co rrespond ing buffe r (10 mmo l L -1
T ris HC l pH 9.0, 50 mmo l L - 1 KC l, 0.1% T riton X-100), 2.0 mmo l L - 1 MgC l2 , 0. 75 U Taq DNA polym e rase, 10 ng tem-
p la te DNA, 6 pm o l p rim er, 0. 2 mmo l L - 1 dATP, dCTP, dGTP, dTTP fo r each in to tal 10 μL reaction vo lume.
K ey words:Heptacodium m iconioides; inter sim ple sequence repea t; optim ization
简单重复序列间扩增 ( inter-simp le seuquence repeat, ISSR), 又称为 Inte r-SSR.这一分子标记是
Zie tk iew iez et al
[ 1]于 1994年创建的 , 类似于 SSR的一种 PCR技术 .其基本原理是:利用基因组中存在
的简单重复序列 (simp le sequence repeat, SSR)本身设计引物 , 在 SSR的 3’或 5’端加锚 1 - 4个随机碱
基 , 然后以此为 3’或 5’引物 , 对两侧具有反向排列的 SSR间的基因组片段进行扩增 . ISSR引物序列较
长 , 扩增的是重复序列之间的序列 , 稳定性较高 [ 2] . ISSR技术现已广泛应用于植物品种鉴定 、遗传作
图 、基因定位 、 分类 、进化及遗传多样性方面的研究 [ 3 -4] .
七子花 (Heptacodium m iconioides)为我国特有的落叶小乔木 , 属忍冬科 (Caprifo liaceae)的单种属植
物 , 为国家 Ⅱ级重点保护植物 .多生于悬崖峭壁 , 沟谷和山坡灌丛 , 分布范围窄 , 现存资源极少[ 5 -6] .
文中以珍稀濒危植物七子花的基因组 DNA为模板 , 探讨 ISSR-PCR反应体系中 7种因素对扩增的影响 ,
以期获得七子花 ISSR反应的最佳体系 , 为七子花遗传多样性的分析提供基础 .
1　材料与方法
1.1　材料
试验材料七子花采自浙江省临安市颊口镇干坑 , 取植株的幼嫩叶片置于保鲜袋中 , 封口 , 装于样品
　基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(399203);台州市科技局资助项目(044205).
　第 1作者简介:李钧敏(1973 - ), 女, 浙江临海人 , 副教授 , 从事分子生态学研究 .
　收稿日期:2005 - 12 - 12;修回日期:2006 - 03 -06.
DOI牶牨牥牣牨牫牫牪牬牤j牣cnki牣j fcf牣牪牥牥牰牣牥牪牣牥牨牱
　　　　　　　　　　　　　　　　　　福　建　林　学　院　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　第 26卷
贮藏箱 (由超低温冰袋保持冷藏条件 )带回实验室 , -70 ℃低温冰箱保存 , 供 DNA提取 .
1.2　方法
1.2.1　DNA提取与定量　采用改进的 SDS法 , 按文献 [ 7]提取基因组 DNA.DNA经 0.8%琼脂糖凝胶电
泳分析 , 用 G IS凝胶成像分析系统(上海天能科技服务公司)拍照定量 , - 20℃保存备用 .
1.2.2　 ISSR原初扩增条件及 PCR扩增程序　 ISSR引物采用加拿大哥伦比亚大学 (University o f B ritish
Co lumbia, Se tNo.9, N o.801 -900)提供的序列 , 由上海生工生物工程公司合成 .
原初的扩增反应条件为 10μL PCR反应体积 , 1×Taq酶配套缓冲液 (10mmol L -1 Tris HC l pH 9.0,
50 mmo l L -1 KC l, 0.1% Triton X-100), 1.5 mmo l L- 1MgC l2 , 0.5U Taq酶(上海华美公司), 5 ng模板
DNA , 10 pmo l引物(上海 Sangon公司 );dATP、 dCTP 、 dGTP 、 dTTP各 0.1 mmo l L - 1.根据引物的 Tm
值及参考文献 [ 8] , 初步确定 ISSR-PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火
45 s, 72℃延伸 1.5m in, 共 35个循环;72 ℃完全延伸 5 m in.
所有反应在美国 Thermo公司生产的 P ×2梯度热循环仪中进行 , 扩增产物在 1.6%的琼脂糖凝胶
(含 0.5 μg mL -1溴化乙锭 )中电泳 , 电泳缓冲液为 0.5×TBE , 用 200 bp DNA梯度做分子量标记 , 用
G IS凝胶成像分析系统(上海天能科技服务公司)拍照保存 .
1.2.3　退火温度的确定　采用梯度 PCR模式 , 自动设定温度从 48 - 63 ℃, 生成的温度梯度为 48.1、
48.5、 49.3、 50.7、 52.4、 54.4、 56.3、 58.3、 60.6、 62.0、 62.7、 63.2 ℃.其余 PCR扩增程序同
1.2.2, 以确定最合适的退火温度 .
1.2.4　七子花 ISSR-PCR扩增反应体系的优化　ISSR-PCR扩增反应体系的优化按常规采用单因素试验 ,
共试验了 6个因素各 4个水平(表 1).其余条件同 1.2.2.
表 1　 ISSR-PCR体系优化的因素与水平
Tab le 1　The factors and levels used in the op tim ization of ISSR-PCR reaction system
水平 M g
2+浓度
/(mm o l L - 1)
dNTP浓度
/(mm o l L -1)
Taq酶用量
/U
模板 DNA用量
/ng
BSA浓度
/(mg mL - 1)
引物用量
/pm o l
1 1.5 0. 1 0. 5 5 0 6
2 2.0 0. 15 0. 75 10 2 12
3 2.5 0. 2 1 20 4 18
4 3.0 0. 25 1. 25 30 6 24
注:BSA, 牛血清白蛋白 .
1.2.5　甘油在 ISSR-PCR扩增中的应用　在 1.2.2所示的 PCR扩增反应条件 , 添加一定浓度的甘油 (分
别为 0、 2%、 4%、 6%), 采用 1.2.2的 PCR扩增程序 , 观察甘油对 ISSR-PCR扩增的影响 .
2　结果与讨论
2.1　退火温度的确定
ISSR引物有不同的 GC百分含量 , 确定一个合适的退火温度非常重要 .先根据原初的 PCR反应条
件进行引物的初筛 , 选择能看到清晰条带的引物 UBC 827进行退火温度的确定 , 结果如图 1所示 .从图
1可看出 , 退火温度对 ISSR-PCR的影响非常明显 .从 48℃到 63℃共 15℃的温度间隔里 , 对 PCR结果
的影响可以分为 4类:48.1 ℃为第 1大类 , 缺少大分子量的条带 , 但低分子量的条带亮度较大;从
48.5 -54.4℃为第 2大类 , 在这个范围内随着温度的增高 , 条带数目增多 , 条带亮度增亮 , 以温度
52.4和 54.4℃的条带扩增为最好;从 56.3 - 62.0℃为第 3大类 , 大分子量的条带消失 , 并且随着温度
的增高 , 条带的亮度逐渐减弱 , 加样孔的背景明显增加;从 62.7 -63.2 ℃为第 4大类 , 条带数目很少 ,
背景增高 , 当温度达 60.2℃时 , 条带消失 , 只在加样孔处留下明显的背景 .引物 UBC 826根据公式 Tm
=4(G +C)+2(A +T)[ 9]计算的退火温度为 52 ℃, 而在本研究中 , 最适的退火温度为 52.4 - 54.4 ℃,
选择七子花最适的最火温度为 54 ℃.
170
　第 2期　　　　　　　　　　　 李钧敏等:濒危植物七子花 ISSR反应体系的优化
　　注:M. 200bp标准分子量参照物 . 1 -12:退火温度分别为 48. 1、 48. 5、 49. 3、
50. 7、 52. 4、 54. 4、 56. 3、 58. 3、 60. 6、 62. 0、 62. 7、 63.2 ℃.
图 1　退火温度对七子花 ISSR扩增的影响
Figure 1　Th e effect of annealing tem peratu re on ISSR am p lification ofH. m icon ioid es
2.2　Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
M g
2 +可以通过影响 Taq DNA聚合
酶的活性 , 从而影响 PCR扩增[ 11] .在
一定的浓度范围内 , 随着 Mg2 +浓度的
增高 , 扩增的特异性减弱 , 但扩增片
断的产率增加 .在七子花的 ISSR-PCR
扩增中 , M g2 +浓度的变化对 ISSR带的
数量影响不大 , 但对条带的强弱影响
较大 , 如图 2所示 .Mg2+浓度较低时
(1.5 mmo l L -1), 条带清晰度尚可 ,
但亮度较弱;随着 Mg2+浓度的增加 ,
条带亮度增加 , 但是总体的背景也增
高 , 可能是由于 M g2 +浓度导致一些非
特异性的扩增 .因此本研究中 , Mg2+
浓度以 2.0mmo l L -1较为适宜 .
2.3　dNTP浓度对 ISSR扩增的影响
在 PCR扩增反应中 , dNTP浓度应在 0.02 - 0.2mmol L -1 [ 11] .在研究中 , dNTP浓度的变化对 ISSR
带的数量和强弱影响较大 (图 2).当 dNTP浓度为 0.1和 0.15mmo l L - 1时 , 条带较清晰 , 但条带亮度较
低 , 而当 dNTP浓度大于 0.2 mmo l L - 1时 , 带型没有变化 , 但条带亮度明显增加 .本研究中的最佳
dNTP浓度为 0.2mmol L -1.
注:M. 200 bp标准分子量参照物 . 1 - 4:Mg2+浓度分别为 1. 5, 2. 0, 2. 5, 2. 5 mm ol L- 1. 5 - 8:dNTP浓度分别为
0. 1, 0. 15, 0. 2, 0. 25 mmo l L- 1. 9 -12:Taq酶的用量是 0. 5, 0. 75, 1, 1.25 U. 13 - 16:模板 DNA量分别为 5, 10, 20,
30 ng. 17 - 20:BSA浓度为了 0, 2, 4, 6m g L- 1. 21 - 24:引物浓度分别为 6, 12, 18, 24 pm ol. 25 - 28:甘油浓度分别为
0, 2, 4, 6%.
图 2　几种因素对七子花 ISSR扩增的影响
Figu re 2　The effect of am plif ication cond itions on ISSR amp lificat ion ofH. m icon io ides
2.4　Taq酶单位对 ISSR扩增的影响
Taq酶单位的变化对 ISSR带的数量和强弱影响较大 (图 2).当 10 μL反应体积中 , Taq酶单位为
0.5和 0.75 U时 , 可获得清晰的带型 , 但条带亮度较低;当 Taq酶单位增加至 1 U和 1.25 U时 , 条带
亮度明显增加 , 但同时背景略有增加 .Taq酶用量过高不仅可以提高成本 , 而且会造成非特异性的扩增 ,
因此本研究认为在 10 μL反应体积中最适的 Taq酶量为 0.75 U.
2.5　模板 DNA量对 ISSR扩增的影响
模板 DNA量的变化对 ISSR带的数量和强弱影响不大(图 2).10 μL反应体积中 , 模板 DNA的量从
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5 -30 ng均可扩增获得清晰的条带 , 带型与亮度均变化不大 .但当模板 DNA量大于 20 ng时 , 背景略有
增加 .模板 DNA浓度过低 , 可以导致扩增产物无或不稳定;而模板 DNA浓度过高 , 又会增加非特异性
产物的扩增 .因此本研究采用在 10μL反应体积中最适的模板 DNA用量为 10 ng.
2.6　BSA用量对 ISSR扩增的影响
BSA对于酶活性有一定的促进作用 [ 13] , 可以减低 ISSR扩增的背景 .但在本研究中 , 发现添加 BSA
可以降低扩增的背景 , 但同时高分子量的条带丢失 , 条带亮度也明显下降(图 2).因此在本研究采用不
添加 BSA的方法 .
2.7　引物浓度对 ISSR带的影响
引物浓度的变化对 ISSR带的数量影响不大 , 但对强弱影响较明显 (图 2).当引物浓度为 6和 12
pmo l时 , 条带亮度较大 , 但当引物浓度大于 18 pmol时 , 条带亮度反而有些下降 .过高的引物浓度会造
成一些非特异性扩增 , 因此本研究选择每 10μL反应体积中 6 pmo l引物 .
2.8　甘油浓度对 ISSR带的影响
文献报道添加 2%的甘油可以降低 ISSR扩增的背景 [ 14] , 但在本研究中 , 发现添加 2%的甘油对于
带型影响不大 , 对于条带亮度略有减少;而添加 4%和 6%的甘油时 , 条带亮度明显减少 , 因此本研究
中采取不添加甘油的方法 .
3　结语
本研究结果显示濒危植物七子花的 ISSR分析较适宜的扩增条件如下:10 μL PCR反应体积 , 1×
Taq酶配套缓冲液 (10mmo l L -1 Tris HC l pH 9.0, 50 mmo l L - 1 KC l, 0.1% Triton X - 100), 2.0mmo l
L
- 1
MgC l2 , 0.75 U Taq酶 (上海华美公司), 10 ng模板 DNA , 6 pmol引物 (上海 Sangon公司);dATP、
dCTP 、 dGTP 、 dTTP各 0.2mmol L - 1.在优化的扩增条件下 , 经过反复实验表明可获得重复性和可靠
性较高的 ISSR带谱 .
参 考 文 献:
[ 1] Z ie tk iew icz E, Rrafa lsk iA , Labuda D.Genom e finge rprinting by simp le sequence repea t(SSR) -ancho red po lym erase cha in
reaction am plifica tion[ J] .G enom ics, 1994, 20:176 - 183.
[ 2] Nagaoka T, Og iha ra Y.App licab ility of inter-simp le sequence repeat po lymo rph ism s in wheat fo r use as DNA m arkers in com-
pa rison to RFLP and RAPD m arke rs[ J] . Theo rApp lGenet, 1997, 94:597 - 602.
[ 3] L iA, Ge S.G ene tic va ria tion and co lona l dive rsity o f psammochloa v illo sa(Poaceae) de tected by ISSR marke rs[ J] .Ann Bo t,
2001, 87:585 - 590.
[ 4] Irue laM , Rubio J, Cubero JI, e t al.Phy logene tic ana ly sis in genusCicer and cultiva ted chickpea using RAPD and ISSR
m arke rs[ J] . Theo rApplG enet, 2002, 104:643 -651.
[ 5] 俞　建 , 于明坚 , 金孝锋 . 浙江省七子花资源现状及保护建议 [ J] . 浙江大学学报:理学版 , 2003, 30(3):
314 - 326.
[ 6] 国家环境保护局 , 中国科学院植物研究所 .中国珍稀濒危保护植物名录(第 1册)[M ] .北京:科学出版社 , 1987:
11.
[ 7] 李钧敏 , 柯世省 , 金则新 .濒危植物七子花 DNA的提取及分析 [ J] .广西植物 , 2002, 22(6):499 - 502.
[ 8] 葛永奇 , 邱英雄 , 丁炳杨 , 等 . 子遗传植物银杏群体遗传多样性的 ISSR分析 [ J] . 生物多样性 , 2003, 11(4):
276 - 287.
[ 9] 卢盛栋 .现代分子生物学实验技术(第二版)[M ] .北京:中国协和医科学大学出版社 , 1999:458 -463.
[ 10] 边才苗 , 李钧敏 , 金则新 , 等 .牛血清白蛋白在植物 RAPD分析中的作用 [ J] .遗传 , 2002, 24(3):279 - 282.
[ 11] 王彦华 , 候喜林 , 徐明宇 . 正交设计优化不结球白菜 ISSR反应体系研究 [ J] .西北植物学报 , 2004, 24(5):
899 - 902.
(责任编校:江　英 )
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