全 文 ：植 物 学 报 1994, 36( 5): 325— 330
Acta Botanica Sinica
外源激素对风信子胚珠再生
及其性细胞分化的影响*
陆 文 木梁
(中国科学院植物研究所 ,北京 100044)
摘 要
风信子 ( Hyacinthus orientalis L. )性器官分化和性细胞分化所需条件是不一样的 ,适合于
性细胞 (雌配子体 )分化的外源激素水平大大低于性器官 (胚珠 )分化的外源激素水平。珠心细
胞在低浓度的外源激素条件下可以分化性细胞 ;稍稍提高外源激素浓度 ,性细胞化化停止 ,代
之以珠心细胞的增殖 ;进一步提高外源激素浓度 ,珠心细胞又可以分化出新的胚珠原基 ,进一
步长大以后发育成许多新的胚珠。
关键词 风信子 ;离体培养 ;胚珠再生 ;植物性细胞分化⒇
EFFECTS OF EXOGENOUS HORMONESON IN VITRO RE-
GENERATION OF OVULE AND ITS SEXUAL CELL DIF-
FERENTIATION IN HYACINTHUS ORIENTALIS L.
Lu Wen-liang
( Institute of Botany , Academia Sinica , Beijing 100044 )
Abstract
Studies on the ef fects of exogenous hormones on ovule regeneration and i ts sexual cell
di fferentiation in Hyacinthus orientalis L. have reveased that condi tions required for differen-
tiations of sexual o rgans and sexual cells w ere dif ferent. The exogenous hormone lev el sui t-
able for the sexual cell dif ferentia tion was g reat ly low er than that fo r sexual org an differenti-
ation. The nucellus cells could differentiate the sexual cell under quite low concentration of
⒇ 收稿日期: 1993-08-11 接受日期: 1993-11-05
* 国家自然科学基金资助课题。
exogenous ho rmones. With slight increase of ho rmone concentration, the differentiation of
the sexual cells stopped and proliferation of the nucellus cells took place instead. Upon fur-
ther increase of the exogenous hormone concentration, new ovule primordia could be formed
from the proliferated nucellus cells, w hich further developed into many new ovules.
Key words Hyacinthus orientalis L. ; In v itro; Ovule reg eneration; Sexual cell differ-
entiation
性器官从分化到发育成熟经历了大小孢子母细胞的分化 ,减数分裂 ,大小孢子的发育
等一系列复杂的结构上和生理生化上的变化。 其中每一过程的完成需要什么条件目前仍
不清楚。我们在诱导风信子等植物的胚珠从外植体上直接再生 [ 1, 2 ]并在离体条件下将它培
养成熟 [3, 4 ]取得成功以后 ,已有可能运用这个实验系统来研究从性器官分化到性细胞分化
和发育的每一个过程所需的条件。 本文报道外源激素的影响。
材 料 和 方 法
(一 )植物材料
风信子 ( Hyacinthus oriental is L. )栽培种 delf t blue。三年生鳞茎用于实验。 10月下旬
将鳞茎埋入潮湿的沙中 ,在 3℃左右的温度中贮藏 , 2个月后陆续用于实验。
(二 )再生胚珠的诱导
取花粉发育时期处于二细胞晚期的花芽 ,按前文介绍的方法 [1 ]分离花被接种到 MS
附加 6-BAP 2 mg /L和 2, 4-D 0. 1 mg /L的培养基上 ,培养 2个月 ,然后转移到不同浓度
激素的培养基上 ,在 25℃± 1℃条件下培养 ,观察外源激素对胚珠分化的影响。胚珠分化
后再转入 18± 1℃中观察性细胞的分化。
(三 )培养条件
外植体接种以后 ,置于每天 9小时光照 , 15小时黑暗 , 25± 1℃和 18± 1℃的光照培养
箱中培养。
(四 )细胞学观察
观察材料用纳瓦兴Ⅱ [5 ]固定 ,石蜡切片厚 12μm, PAS反应和苏木精染色 [6 ]。 观察和
照相用 Zelss nf显微镜。
实 验 结 果
(一 )外源激素对胚珠分化的影响及分化过程的细胞学观察
我们已往报道了从花粉发育处于二细胞晚期的风信子花芽上分离的花被外植体 ,在
6-BAP 2 mg /L和 2, 4-D 0. 1 mg /L的培养基上培养一段时间以后 ,转移到 6-BAP 0. 2
mg /L和 NAA 0. 005 mg /L的培养基上可以诱导胚珠的再生 [ 1]。为了进一步了解外源生
长素浓度的影响 ,在 6-BAP 2 mg /L和 2, 4-D 0. 1 mg /L的培养基上培养 2个月的外植体
分别转移到表 1所列的培养基上 ,培养 45天以后统计结果如下 (表 1): 当 6-BAP固定在
0. 2 mg /L, N AA 1 mg /L时外植体上无胚珠分化 ; NAA 0. 1 mg /L和 0. 001 mg /L之间变
326 植 物 学 报 36卷
动时 ,每一组都诱导了胚珠的再生 (再生胚珠基本上是直生型的 ,不同于自然情况下的倒
生型 )而且频率很高 (图版Ⅰ , 1)。结果表明 ,当 6-BAP为 0. 2 mg /L时 ,较高的生长素浓度
( N AA 1 mg /L)不能诱导胚珠再生 ,但 NAA只要低于 0. 1 mg /L则都可以诱导胚珠分
化 ,表现出雌性器官的分化在生长素浓度较低时要求不十分严格。
表 1 外源激素对胚珠分化的影响
Table l Effects o f ex ogenous ho rmones on ovule differentiation
编号
No.
外源激素
Exogenous hormon es
( mg /L)
6-BAP N AA
外植体数
No. of explant
再生胚珠的外植体数
No. of explan t regenerating
ovules
1 0. 2 1. 0 31 0
2 0. 2 0. 1 34 32
3 0. 2 0. 01 39 37
4 0. 2 0. 001 42 41
胚珠再生的细胞学观察表明 ,胚珠原基的隆起首先是由于表皮以下细胞大量增殖的
结果。与此同时表皮细胞变长 (图版Ⅰ , 2) ,紧接着在这些伸长的细胞中出现大量的平周分
裂 ,与此同时 ,原基基部的细胞不断增殖使原基伸长成圆柱状 (图版Ⅰ , 3) ,接着在圆柱体
顶端稍下方的平周分裂细胞层中的细胞不断增殖形成一环状隆起 ,即是内珠被的分化 ,被
内珠被包围的原基顶部是珠心。内珠被生长到一定长度后 ,其外侧基部的细胞又迅速增殖
形成一环状隆起 (图版Ⅰ , 4) ,这是外珠被的分化。 随着外珠被的进一步生长 ,再生胚珠在
结构上已经可以区分出珠孔 ,内外珠被 ,珠心和珠柄 (图版Ⅰ , 5)。 这时胚珠在结构上的分
化可以认为已经基本完成。
(二 )外源激素对雌配子体发生和发育的影响
表 1的实验结果表明:当 6-BAP 0. 2 mg /L, N AA 0. 1、 0. 01和 0. 001 mg /L时都能诱
导胚珠的再生。为了进一步了解这 3个外源激素组合中分化的胚珠其性细胞分化的情况 ,
我们在培养 60天时分别从每个组合中取一定数量的胚珠进行切片观察。观察表明 (表
2) , 6-BAP 0. 2 mg /L和 NAA 0. 1 mg /L组合的 80个胚珠中都无雌配子体形成 ,其组织
学和细胞学的特点是胚珠具珠柄 ,内、外珠被与珠心 ,但珠心中未观察到大孢子母细胞 ,大
孢子或胚囊的痕迹 ,只是薄壁细胞的增殖和珠心增大 (图版Ⅱ , 9)。再进一步培养 ,珠心中
部的薄壁细胞首先死亡 ,而后扩大到整个珠心 (图版Ⅱ , 10)。观察 6-BAP 0. 2 mg /L、 NAA
0. 01 mg /L组合的 96个胚珠中 ,有 7个胚珠存在大孢子 (图版Ⅰ , 6) ,表明性细胞的分化
已经经历了母细胞的分化和减数分裂。然而在图版Ⅰ图 6所示的那样大的珠心中仍然能
表 2 外源激素对雌配子体分化的影响
Table 2 Effects o f ex ogenous ho rmones on gynogam etophy te differentiation
编号
No.
外源激素
Exogenous hormones
( mg /L)
6-BAP NAA
观察胚珠数
No. of ovule
observed
具大孢子胚珠数
No. of ovule wi th
megaspore
具胚囊胚珠数
No. of ovule w ith
mature embryo sac
无雌配子体的胚珠数
No. of ovule wi thout
gynogametoph yte
1 0. 2 0. 1 80 0 0 80
2 0. 2 0. 01 96 7 0 89
3 0. 2 0. 001 91 2 4 85
3275期 陆文木梁等: 外源激素对风信子胚珠再生及其性细胞分化的影响
观察到大孢子 ,表明它已经失去了继续分化的能力。因为将它与正常分化过程相比 [ 4] ,与
这么大的珠心相对应的性细胞发育应该是成熟胚囊期 ,但仍然停留在大孢子时期表明它
不能继续往下发育。 其它 89个胚珠无任何雌配子体分化的痕迹 ,其组织学和细胞学的变
化与第一组中的相同。观察 6-BAP 0. 2 mg /L, N AA 0. 001 mg /L组合的 91个胚珠中有 2
个停留在大孢子时期 (图版Ⅰ , 7) ,有 4个观察到了胚囊的分化 (图版Ⅱ , 8) ,它们基本都已
发育成熟。 无疑这 4个胚珠经历了雌配子体发生和发育的整个过程。 其余的 85个胚珠 ,
珠心中无任何雌配子体发生和发育的痕迹。
(三 )外源激素对珠心细胞重新再生胚珠的影响
为了探索不分化雌配子体的胚珠是否可以诱导珠心的薄壁细胞先经过脱分化然后重
新分化大孢子母细胞 ,我们将表 2第 1组中培养 1个月以后不分化雌配子体的再生胚珠
重新转入激素较高的培养基Ⅰ 上诱导珠心细胞脱分化 ,培养 3个星期后再转入激素较低
的培养基Ⅱ上诱导再分化 (表 3)。通过切片观察结果表明 ,将不分化雌配子体的再生胚珠
转入激素较高的培养基上以后 ,确实可以诱导珠心细胞脱分化进行大量的细胞增殖 ,但脱
分化以后再分化的不是大孢子母细胞而是一些原基 (图版Ⅱ , 11、 12) ,这些原基在它进一
步发育的切片中已被证实是新的胚珠原基 ,并由它们发育成新的胚珠 (图版Ⅱ , 14)。 细胞
学观察表明 ,原基的形成同样是表皮细胞伸长以及其下部细胞不断增殖的结果 (图版Ⅱ ,
13)。 在原基伸长过程中同样可以观察到顶部的平周分裂细胞层 (图版Ⅱ , 12* )。诱导珠
心细胞脱分化的频率较高 ,达 69%— 88% ,再生新胚珠的频率较低 ,只有 39%— 41% 。
表 3 外源激素对珠心再生胚珠的影响
Table 3 Effects of ex ogenous ho rmones on ovule reg enera tion from nucellus
外源激素
Exogenous hormones ( mg /L)
M ediumⅠ MediumⅡ
Zeatin 6-BAP 2, 4-D 6-BAP N AA
观察的胚珠数
No. of ovule
observ ed
珠心脱分化的胚珠 (% )
% of ovule in
w hich nucellus
dedif feren tiation
再生新胚珠的胚珠 (% )
% of ovule explan t
regenerating the
n ew ov ules
2 0 0. 1 0. 2 0. 001 28 69 39
0 2 0. 1 0. 2 0. 001 32 88 41
讨 论
由于缺乏十分理想的实验系统 ,人们对性器官分化和以后的性细胞分化所需的条件
仍然知道得很少。随着离体条件下诱导风信子性器官再生 [ 1]和培养再生性器官中性细胞
发育成熟的实验系统的逐渐完善 ,我们对性器官和性细胞分化的条件进行较为细致的研
究 [3, 4, 7 ]。 1992年我们在从外植体上直接分化的完全孤立状态下的再生胚珠培养成熟过程
中 ,成功地观察到了雌配子体发生和发育到最后形成 8核蓼型胚囊的全过程 [4 ] ,从而揭示
了胚珠分化的进一步发育不需要来自花芽和植株的信息 ,其发育过程胚珠是可以自控的。
本实验进一步研究了在胚珠自控过程中外源激素的影响。实验证明 ,适合于胚珠分化的外
源激素水平不一定适合于其中性细胞的分化。 后者所需要的外源激素水平可能要大大低
于前者 (表 1和 2) ,表明性器官分化和性细胞分化的最适条件是不同的。这可能是本实验
328 植 物 学 报 36卷
中 (表 2)许多胚珠都不分化雌配子体的原因。然而雌配子体发生和发育所需的条件可能
是多种多样的 [8, 9] ,外源激素只是其中之一。本实验中性细胞分化的频率特别低 (表 2) ,表
明除外源激素外一定还有别的更为重要的因素。
珠心细胞在性细胞分化中起着十分重要的作用 ,因为由它首先分化出孢原细胞 ,而后
才分化形态上较原来的薄壁细胞有很大不同的大孢子母细胞 ,再进一步分化才有性细胞
的出现。因此揭示珠心细胞的各种生物学特性有很重要的意义。 本实验中诱导珠心细胞
分化的部分 ,原本想探索诱导失去分化性细胞能力的珠心薄壁细胞 ,经过脱分化以后重新
分化出性细胞的可能性。实验虽然没有达到预想的结果 ,但却揭示了一些重要的生物学现
象。其一 ,珠心细胞可以被诱导脱分化启动 ;其二 ,脱分化的珠心细胞可以诱导再分化器
官。这两个生物学现象给我们十分重要的提示:只要进一步调控培养条件有可能诱导大孢
子母细胞的直接分化 ,或者是珠心的大量分化 (以往观察到的再生胚珠中有超过一个珠心
的现象存在 [4 ] )。不管是诱导珠心 ,还是诱导大孢子母细胞的大量再生 ,都是为了直接诱导
性细胞的大量形成 ,这在理论和实践上都具有重要意义。
参 考 文 献
1 Lu W , Enomoto K, Fukunaga Y et al . Regenerat ion of tepals , stamens and ovules in explants f rom perian th of Hy-
acinth us orientalis L. Importance of explant age and exogenous hormones. Planta , 1988. 175: 478— 484
2 Lu Wen-liang. Regeneration of tepal-lik e st ructures, stamens and ovules from perianth ex plant of Narcissus taz etta L.
Chinese J Bot , 1990. 2: 165— 168
3 陆文木梁 ,诸颖杰 , Enomoto K等 . 温度对离体培养中风信子再生雄蕊的诱导 ,小孢子发生和花粉发育的影响 . 植物
学报 , 1990. 32: 832— 840
4 陆文木梁 . 风信子再生胚珠的大孢子发生和胚囊发育的细胞学观察 . 植物学报 , 1993. 35: 493— 498
5 郑国锠 . 生物显微技术 . 北京:人民出版社 , 1979. 33
6 朱徵 . PAS反应作为一种染色技术在植物组织学上的应用 . 植物学报 , 1963. 11: 155— 164
7 陆文木梁 . 小麦外稃和内稃愈伤组织直接再生小穗和雌蕊状结构的研究 . 实验生物学报 , 1992. 25: 9— 15
8 Sokolow ska-Kulczycka A. Search for th e cause of developmen tal variabi li ty in female gametoph ytes in Angiospermae.
W iad Bot , 1988. 32: 81— 94
9 Sedgley M. Som e ef fect s of temperature and light on floral ini tiation and developmen t in Acacia p ycuantha. Aust J
Plant Physiol , 1985. 12: 109— 118
图 版 说 明
E S.胚囊 FC.珠柄 M S.大孢子 NC.珠心 II.内珠被 OI.外珠被 OIP.外珠被原基
图 版 Ⅰ
1. 花被外植体在 M S附加外源激素的培养基上再生众多胚珠 .× 5 2— 5.再生胚珠分化过程的纵切面 .× 183
2.胚珠原基的形成 ,示胚珠隆起主要是表层下细胞大量增殖的结果和表皮细胞变长 . 3. 胚珠原基的进一步发育 ,示伸
长的表皮细胞不断地进行平周分裂 ,和其它的细胞不断地分裂使原基伸长 . 4. 示内珠被首先分化和外珠被原基在内
珠被基部开始分化 . 5. 外珠被 ,内珠被 ,珠心和珠柄全部分化 . 6、 7. 再生胚珠的纵切面 ,在珠心中可观察到一个大孢
子 . × 87
图 版 Ⅱ
8— 14.再生胚珠纵切面 . 8. 在珠心中可观察到胚囊的分化 .× 48 9.珠心中不能观察到雌配子体的分化 . × 50
10.珠心中心部分的薄壁细胞全部死亡 .× 56 11.示珠心两侧有两个生长中心在形成并发育为两个原基 .× 88 12.
珠心分化出多个原基 ,有的原基已经伸长 (* ) ,可见其顶部的平周分裂细胞层 (与图 3相似 ) . 与此同时珠孔被大大地
拓宽了 . × 54 13.示原基起源过程中表层细胞的伸长及其下部细胞的大量增殖 . × 54 14. 由珠心分化的原基发育
形成几个新的再生胚珠 . × 30
3295期 陆文木梁等: 外源激素对风信子胚珠再生及其性细胞分化的影响
Explanation of Plates
E S. Embryo sac FC. Funicullus M S. Macrospore NC. Nucellus II. Inn er integument OI. Outer integument
OIP. Outer integument primodium
PlateⅠ
Fig. 1. Many in vit ro regenerated ov ules derived f rom perian th explan t cultu red on M S medium supplemen ted wi th ex-
ogenous hormnes.× 5 Figs. 2— 5. Logi tudinal sections of reg enerated ovules, showing the di fferen tiation process of the
ov ule.× 183 Fig. 2. Ovule primordium, showing that th e primordium projection w as resulted from propagation of cells
below epid ermis of n ucellus and extension of th e epidermis cells. Fig. 3. Expension of the ovule primordium and many peri-
clinal cell divisions ari sing in the cells of epidermis layer. Fig. 4. Dif ferentiat ion of inner in tegument and af ter th at , outer in-
tegument primordium was formed at th e base of th e inner integ ument. Figs. 6, 7. Longi tudinal section of regen erated ovule
and megaspore could be seen in i ts nucellus.× 87
PlateⅡ
Figs. 8— 14. Longi tudinal sections of regenerated ovules. Fig. 8. There w as dif ferentiation of embryo sac in nucellus.
× 48 Fig. 9. There was not any dif ferentiation of megagametoph yte.× 50 Fig. 10. Furth er dev elopment of the ovule
show ed in Fig. 9. most of parench yma cells at th e ceter part of the nucellus died.× 56 Fig. 11. Sh ow ing that tw o grow th
centers have been formed and resulted in the projection of tw o primordia.× 88 Fig. 12. Many primordia w ere di fferen tiat-
ed f rom nucellus. some of th em have extended (* ) , and cell layer w ith periclinal divisions at th e top of th e ex tend p ri-
mordium could be seen ( simi lar to the primordium show ed in Fig. 3) . At the same time, micropyle w as opened up.× 54
Fig. 14. Several new regen erated ovules resulted f rom furth er development of the primordia show ed in Fig. 11 and 12.× 30
330 植 物 学 报 36卷
陆文づ:外源激素对风信子胚珠再生及其性细胞分化的影响 图 版Ⅰ
Lu Wen- liang: Effects of Exogenous Ho rmones on in Vitro Regeneration of
Ovule and Its Sexual Cell Dif ferentiation in Hyacinihus orientalis L. PlateⅠ
See explanation at the end of tex t
陆文づ:图 版Ⅱ Lu Wen- liang: Pla teⅡ
See explanation at the end of tex t