全 文 ：图 1　PCR产物鉴定(M.Marker;1-30 are 1-30 clones)
图 2　基因芯片杂交扫描结果
燥备用。
1.2.8　探针的制备:总 RNA 20 μg , 加入 5 μl 10 mmol/L 的
dATP、dGTP、dTTP 和 1μl 10 mmol/L的 dCTP , 1.5 μl 1mmol/ L的
cy3-dCTP , 2μg ologo(dT18), 15U AMV , RNasin 20U和适量的水使总体积为 50μl , 42℃1h。乙醇沉淀后溶解在预杂交液(5μ
SSC , 0.2%SDS , 50%甲酰胺)中。
1.2.9　杂交和检测:将探针在 95℃变性 5min 后 ,离心冷却 , 取
3.5 μl 加在芯片上 , 盖上盖玻片封闭 , 42℃杂交 16 h。然后依次分别在 2×SSC/0.1%SDS , 0.1×SSC/0.1%SDS , 0.1×SSC ,
H2O 和无水乙醇中洗片 , 室温干燥后 , 用 GSI Lumonics 公司的
Scanarry lite扫描芯片。
2　结果
2.1　将 PCR产物与 pMD18-T载体连接后 , 用载体上的引物进行鉴定 , Figure 1 所示为引物 PAA-PAA的克隆鉴定结果 , 一
共挑取了 30 个克隆 , 应用Labworks 软件计算后 ,筛选出片段长度大于 300bp ,并且相差 20 个碱基以上的 DNA 带的克隆 (在此组中 , 筛出 13、19 、30、29、9、1、11 和 4号克隆),测序结果证实它们是不同的基因片段。
2.2　基因芯片扫描此芯片所用的靶基因片段是应用 RD-PCR技术克隆的片段 , 共180个样品 , 一部分已经测序 ,阴性对照为 5 个不同的
HIV片段 、pMD18-T 载体上 primerA与 primerB 之间的一段序列和一个 50%DMSO溶液 , 阳性对照有 GAPDH(三磷酸甘油醛脱氢酶)和NAPDH 脱氢酶 ,每一个样品上样 3 次 ,构成一个 18×30(0.54cm×0.9 cm)点阵。结果显示 , HIV 片段 、pMD18-T载体和 50%DMSO 样品没有检测到信号 , 检测到阳性信号包
GAPDH 和 NAPDH脱氢酶 ,一些在肿瘤表达丰富的基因如核糖体 large P0蛋白 、核糖体 L27a蛋白 、核糖核酸还原酶多肽链M1等出现较强的信号。该基因芯片上基因信号检测到的阳性结果 , 均以三个点相连出现 , 与芯片制备时打印的预测完全相同。本研究结果表明 , 采用 RD-PCR 技术得到的基因片段 ,可以重复性很好地用于基因芯片制备时的探针收集。
3　讨论本文采用 RD-PCR技术制备基因芯片的靶基因片段 , 把
cDNA 片段分组克隆 , 与经典建库方法克隆基因相比 , 减少了重复性克隆 , 降低了后续操作的成本。由于用载体上的引物进行扩增 , 所得的产物比真正的靶基因片段长 140bp 左右 , 这一部分序列是否导致杂交假阳性产生? 作者用 cy3-dCTP 标记的 cDNA 与之杂交 ,阴性对照没有出现阳性信号 , 说明没有假阳性出现 , 即在此种条件下不会导致假阳性结果 , 进而表明利用这种方法克隆的基因片段可以用作基因芯片的靶基因。结果中的信号较弱 ,主要可能是由于所用的样品是总 RNA , 样本量稍微少一些 ,有的推荐用 4-10 μg 的 mRNA , 这样可能会提高一些信号强度。
DNA芯片技术是近年来兴起的一种快速 、高敏感 、高度集成化的基因检测技术 , 它为探索基因的功能 、阐明疾病的发
生 、发展的机制 、药物的筛选等提供了新的途径。获得大量的靶基因片段是基因芯片技术的重要环节 , 也是操作最繁琐的一个过程 ,通常是耗资比较大的步骤 , 因此需要一种快速 、简单 、节约成本的技术克隆大量的靶基因片段。应用 RD-PCR技术克隆 cDNA 片段操作步骤比较少 , 片段重复性小 , 但其比真正靶基因片段长约 140bp ,本文通过实验证明这 140bp 对杂交检测无影响 , 表明采用 RD-PCR技术应用于制备基因芯片的靶基因片段具有明显优势。参考文献:[ 1] Veculescu V , Zhang L , Vogelstein B, et al.Serial analysis of gene expres-
sion[ J] .Science , 1995 , 270(5235):484-487.[ 2]Wang A , Angela P , Kimberly JK , et al.Rapid analysis of gene expression(RAGE) faci litates universal expression prof iling [ J] .Nucleic Acids Re-
search , 1999 , 27(23):4609-4618.[ 3] Ryo A , Kondoh N , Wakatsuki T , et al.A method for analyzing the qualita-
tive and quantitative aspects of gene expression:a transcriptional profile re-
vealed for HeLa cell[ J] .Nucleic Acids Research ,1998 , 26(11):2586-2592.[ 4] Schena M , Shalon D , Davis RW , et al.Quantitative moni toring of gene ex-
pression patterns with a complementary DNA microarray[ J] .Science , 1995 , 270(5235):467-470.[ 5] Zheng W , MaW , Waes CV.The differential di splay of poly A polymerase
in tumor cells of differential malignancy.In:Ye XS , et al.ed.Investigation
on Cell Modulation(in Chinese)[M] .Beijing:Uniform Medical Publishing ,
1998, 73-79.[ 6] Chmezynski P , Sacchi N.Single -step method of RNA isolat ion by acid
guanidinium thiocyanate-phenol -cloloform extraction[ J] .Anal Biochem ,
1987, 162:156-159.
红 木的 3′端延长随机引物扩增 DNA(3′-ERPAD)标记
李晨东1 ,唐前瑞2 ,陈德富1 ,陈喜文1 ,陈友云2(1.南开大学 生物化学与分子生物学系 , 天津 300071;2.湖南农业大学 ,湖南 长沙 410128)摘要:为了对 116 个 10-mer随机引物的 RAPD分子标记进行深入了解 , 探讨分子标记与园艺性状的关系 , 筛选出多态性明显 、重复性好 、亮度大 、分子量也较大(1031bp 以上)的 10-mer随机引物 , 在其3 端添加一任意碱基 , 对14个红木材料和 2个来源不同的生态型木材料进行 3 -ERPAD标记分析。发现在 S2 和 S35 的延伸引物中能够得到最佳扩增结果的引物对是 S2-G+S2-C 和 S35-A+S35-C ,它们的扩增结果都含有与各自基本引物相同的差异扩增带 , 这些差异带分别是 S21500 、S21031和 S353000、
S35900、S35560。通过与园艺性状比较 ,发现 S21500片段可能与控制叶色的基因有关。
关键词:红 木(Loropetalum chinense var.rubrum);3 Extended Random Primer Amplified DNA (3 -ERPAD);分子标记;叶色;
S21500中图分类号:S642.203.2　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2002)04-0003-03
3 Extended random primer amplified DNA(3 -ERPAD)markers
of Loropetalum chinense var.rubrum
LI Chen-dong1 ,TANG Qian-rui2 , CHEN De-fu1 , CHEN Xi-wen1 , CHEN You-yun2(1.Department of Biochemistry andMolecular Biology , Nankai University , Tianjin 300071;2.Department of
第 12卷第 4 期:3
2002年 8 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.12 , No.4:3
Aug.2002
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2002.04.003
Horticulture , Hunan Agricultural University , Changsha 410128 , China)
Abstract:To discuss the relation between molecular markers and horticulture character , primers were screened from the early RAPD analysis with
116 random primers (10 mer)which produce strong repetitive polymorphic bands and whose molecular weight is over 1031bp.Then , a random
oligonucleotide was added at the 3 -end of the primers to form ERPAD primers.3 -ERPAD markers were used to analyze 14 Loropetalum chi-
nense var.rubrum and 2 different Loropetalum chinense ecotypes.The result shows that primer pairs S2-G+S2-C and S35-A+S35-C ex-
tended from S2 and S35 could produce the best result.Their amplified patterns contain the same polymorphic bands as the basic random primers.
These bands are S21500 , S21031 and S353000 , S35900 , S35560.The correlation analysis shows that S21500 maybe correlate to the genes that control leaf
color.
Key words:Loropetalum chinense var.rubrum;3 -ERPAD;molecular markers;leaf color;S21500
4
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12 号的叶色为紫红色 , 15 和 16 号材料的叶色为绿色 , 所以推测S21500片段有可能与控制叶色性状的基因有关。在 S2 的
RPAD与 S2-G+S2-C 的 ERAPD 扩增中 , 11 号材料在 1031bp
位置附近有一特异谱带 ,尤其在延伸引物对 S2-G+S2-C 的扩增结果中亮度很高 ,这条 S21031很有可能是一条非常重要的特异性谱带 ,如果能够继续延伸引物使获得到单一的 S21031扩增带 ,就将对这一重要标记更加清楚。在 S35-A+S35-C 的扩增结果中可以发现 3 条重要的 DNA 差异带 , 这三条差异带都有可能在继续延伸引物之后变为单一的特异带而成为某个性状的重要标记。仅仅添加一个碱基的 ERPAD中没有得到单一的特异带 ,是因为引物序列的特异性还不够 , 继续延长引物就有可能得到单一的 DNA 特异带。根据对 ERPAD结果的分析 ,作者认为对S2-G+S2-C继续添加碱基进行进一步研究更加有意义。如果在继续添加碱基的 ERPAD中仍然可以得到 S21500片段 , 那么对于这个片段的推测就更加能够得到成立。在进一步延伸引物得到 S21500片段后 ,再进行该片段的克隆 、测序 , 与已知的
色素基因序列相比较 , 就能够确定 S21500片段是否是所需要的与控制叶色性状有关的分子标记。参考文献:[ 1]Williams J G K , Kubelik A R , Livak K L , et al.DNA polymorphisms am-
plified by arbit rary primers are useful as genetic markers [ J] .Nucleic Acids
Research , 1990 , 18(22):6531-6535.[ 2] 刘春林 ,官春云 ,李木旬.植物 RAPD标记的可靠性研究[ J] .生物技术通报 , 1999 , 2:31-34.[ 3] Paran I , Michelmore R.Development of reliable PCR-based markers
linked to downy mildew resistance gene in letture [ J] .Theor.Appl.Genet ,
1993, 85:985-993.[ 4] 王晓武 ,方智远 ,孙培田 ,等.甘蓝显性雄性不育基因的延长随机引物扩增 DNA(ERPAD)标记[ J].园艺学报 , 1999 , 26(1):23-27.[ 5]Mitchelson K R , Drenth J , Duong H , et al.Direct sequencing of RAPD
fragments using 3 -extended oligonucleotide primers and dye terminator cycle-sequencing [ J] .Nucl Acids Res., 1999 , 27(19):28.[ 6] 黄瑞康 ,杨金桂 ,贺中华 ,等.红 木资源调查研究[ J] .湖南农业科学 , 1998 , 4:44-45.[ 7] 陈德富 , 陈喜文 , 侯志波 , 等.黄瓜随机扩增多态 DNA(RAPD)研究初报[ J] .南开大学学报(自然科学), 1999 , 32(4):47-50.
罗伯逊易位群体遗传结构的 DNA指纹分析杨建军 ,徐晓立 ,许宗运 ,王小霞(新疆塔里木农垦大学动物科技学院 ,新疆 阿拉尔 843300)
摘要:用微卫星探针(GGAT)4得到了罗伯逊易位猪群体内共 9 个家猪品种的 DNA指纹图。 1 ～ 9 品种依次为:13/17 罗伯逊易位纯合子猪群体 、13/ 17罗伯逊易位杂合子猪群体 、13/17 罗伯逊易位杂合子猪互交所得到的正常核型猪群体(杂交 0 号)、丹系长白猪群体 、加系双肌臀杜洛克猪群体 、加系双肌臀大约克猪群体 、加系双肌臀长白猪群体 、丹系长白猪与 13/17 易位杂合子猪产生的杂交后备猪群体(杂交 1 号)、杜洛克猪与 13/17 易位杂合子猪产生的杂交后备猪群体(杂交 2 号)。根据指纹带型计算了每个群体的相似系数(F)、平均等位基因频率(Q)、最底平均杂合率(H)和遗传距离指数(D)。 9 个品种的相似系数介于 0.546 ～
0.931 ,根据各品种之间的遗传距离指数作出矩阵图 ,并据此绘制出品种间亲缘关系树状聚类图。关键词:罗伯逊易位;DNA指纹;微卫星探针;遗传结构;品种中图分类号:Q755　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2002)04-0005-02
Genetic relationship of 13/17 Robertsonian translocation pig population by DNA
fingerprints in microsatllite(GGAT)4
YANG Jian-jun ,XU Xiao-li ,XU Zong-yun ,WANG Xiao-xia(Xinjiang Tarim Agricultural University , Dep.Animal Husbandry , Ala′r 843300 , China)
Abstract:DNA fingerpringt from microsatllite probe(GGAT)4 of 9 breeds of swine was demonstrated , including the homozygous 13/ 17 Robertsoni-
an translocation pig population , the heterozygous 13/ 17 Robertsonian translocation pig population and the normal pig population hybridized No.0 ,
C-Landrace , C-Duroc , C-Large Yorshine , D- Landrace and hybridizing No.1 , hybridizing No.2 , and determined the comparison of the
variability , the mean allelic frequency , the minimum heterozygosity , the genetic distans from the result.The comparison of the variability indicat-
ed that it was between 0.546 and 0.931 in 9 breeds;the parsimony trees of 9 groups were drawn based on the genetic diversity index.The result
from DNA fingerprint indicated the genetic relationship among 9 breeds.
Key words:13/17 robertsonian translocation;DNA fingerprints;microsatellite probe;genetic structure;breed
收稿日期:2001-11-30;修回日期:2002-01-15作者简介:杨建军(1969-),男 ,学士 ,讲师 ,研究方向:分子生物学。
　　用微卫星绘制 DNA 指纹图 ,是近年来 DNA 指纹作图的一个较大发展。由于不同个体 、品种 、品系或群体在被检测的位点上存在一定的差异 ,通过电泳及杂交 , 这些差异就表现为各杂交带的有无 ,即产生微卫星指纹图。人们通过对微卫星序列的克隆 、测序已分析筛选出基因组内的多数微卫星序列。目前观察到的猪的微卫星位点等位基因数的变动范围是 2 ～
16 个[ 2] 。目前 ,在猪的遗传分析中能产生较好的 DNA指纹图的微卫星探针有(TG)n、(TGT)n、(AT)8、(GGAT)4、(GTG)5 、
(TCC)6 等[ 3] 。表 1　9个家猪品种 DNA指纹图变异性的比较品种 F Q H N
易位纯合子猪 0.931±0.132 0.737 0.263 19.8±0.866
易位杂合子猪 0.920±0.091 0.717 0.283 18.8±0.775
杂交 0号 0.843±0.121 0.604 0.396 19.3±0.697
丹系长白猪 0.566±0.225 0.341 0.659 20.3±0.559
加系双肌臀杜洛克猪 0.587±0.071 0.357 0.643 20.7±0.612
加系双肌臀大约克猪 0.546±0.110 0.326 0.674 20.9±0.905
加系双肌臀长白猪 0.636±0.157 0.397 0.603 21.2±0.973
杂交 1号 0.798±0.078 0.551 0.449 19.6±0.654
杂交 2号 0.756±0.062 0.506 0.494 19.3±0.891　　13/17 罗伯逊易位纯合子猪是 1991 年通过 13/17 罗伯逊易位杂合子猪互交而获得的一种新遗传类型家猪(2N=36 , XY
或XX , rob(13/ 17))[ 4] , 数年来因其特有的种质特性和杂交优势 ,已被广泛地应用于商品猪生产的杂交父本或母本 ,近年来更多地利用 13/17 罗伯逊易位杂合子猪与引进的欧洲优良猪种杂交产生杂交后代作为商品猪生产目标。本研究采用人工合成的微卫星探针(GGAT)4 对罗伯逊易位猪群体内 9 个家猪品种的混合 DNA 池进行了 DNA指纹分析 ,获得了清晰且重复性较好的 DNA 指纹图谱 , 根据 DNA 指纹图谱计算出群体遗传参数 , 绘制亲缘关系数状聚类图 , 从
DNA水平上为该新遗传类型家猪的育种实践和种质鉴定提供
依据。
1　材料与方法
1.1　材料:总群体由 9 个品种组成 , 1～ 9 样本分别由 13/ 17 罗伯逊易位纯合子猪 20 头 、13/ 17罗伯逊易位杂合子猪 20头 、杂交 0 号(13/17 罗伯逊易位杂合子猪互交所得到的正常核型猪)20 头均来自山东六合集团种猪场 、丹系长白猪 10 头 、加系双肌臀杜洛克猪群体 10 头 、加系双肌臀大约克猪 12 头 、加系双肌臀长白猪 8 头均为该场 2000 年引进的欧洲猪 、杂交 1 号(丹系长白猪×13/17 易位杂合子猪)18 头 、杂交 2 号(杜洛克猪×13/17 易位杂合子猪)22 头均来自六合猪场 , 每头均取耳组织 1g , 微卫星探针及所有生化试剂均购自 Takala公司。
图 1　由探针(GT)10所得到的 DNA指纹图谱
1.2　DNA模板的制备:从每个个体的耳组织中提取 DNA , 采
用常规酚/仿抽提的方法[ 5] , 并将所得到的 DNA纯化 , 使其纯度达到 90%以上。每个品种样本由各个体各取 DNA 10μg 等
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