全 文 ：高效液相色谱法测定瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花中
7 ,8-二羟基香豆素的含量
田尚衣　魏春雁＊　周道玮　冯　娜　潘　睿
(东北师范大学草地研究所 , 植被生态科学教育部重点实验室 , 长春 130024)
摘　要　建立了反相高效液相色谱法测定瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花中 7 , 8-二羟基香豆素含量的方法 , 同时利用
二极管阵列检测器建立了 7 , 8-二羟基香豆素标准品纯度检测法和植物提取样品中 7 , 8-二羟基香豆素紫外光
谱鉴定方法。色谱柱为Alltech C18柱(250 mm×4.6 mm , 5 μm);流动相为甲醇∶水(40∶60 , V/ V);流速为 1.0 mL/
min;二级管阵列检测器检测 ,检测波长 326 nm;柱温 28℃。线性范围:1.4 ～ 880 mg/ L;线性回归系数大于 0.
9999;检出限为 0.2 mg/L(3σ)。测得瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花中 7 , 8-二羟基香豆素百分含量分别为 0.37%、0.
58%、1.76%和 1.60%;其中叶样品中 7 , 8-二羟基香豆素的回收率为 95.8%～ 100.8%;RSD为 1.92%(n =6)。
该方法简便 ,准确 , 线性范围宽 ,重现性好 , 适于对含有该成分的药物和药材进行质量评价。
关键词　瑞香狼毒 , 7 , 8-二羟基香豆素 ,反相高效液相色谱 ,二极管阵列检测器
　2003-12-17收稿;2004-03-23接受
本文系国家重点基础研究发展规划项目(NO.G2000018606)
1　引　　言
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为有毒药用植物 。主要分布于我国的东北 、华北和西北等草原
区。传统中医以其干燥根入药 ,有逐水祛痰 、破积杀虫等功效。主治水肿腹胀 、慢性气管炎 、淋巴结核及
疥癣等病症[ 1] ;近年来 ,国内外学者研究发现 ,瑞香狼毒根有较强的抗肿瘤和抗 HIV病毒作用[ 2] 。
7 ,8-二羟基香豆素(7 ,8-dihydroxy-coumarin)是一种有生物活性的天然产物 。对中枢神经系统主要表
现为镇痛和镇静催眠作用;对心血管系统表现为抗心肌缺血 、强心 、降压 、降血脂 、抗血栓作用;它还具有
抗炎 、抗菌作用[ 3 , 4] 。2002年 Gregory最新研究发现 ,7 ,8-二羟基香豆素对肾脏癌症有治疗作用[ 5] 。
为了更深入地研究瑞香狼毒独特的抗肿瘤活性物质 ,并发掘该植物不同部位的药用价值 ,从瑞香狼
毒叶中提取 、分离得到活性化合物 7 ,8-二羟基香豆素 ,并对其在瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花中的分布进行了
定量分析 。为开发和利用瑞香狼毒的药用资源提供参考依据。关于 7 ,8-二羟基香豆素的高效液相色谱
分析方法未见文献报道。本实验以瑞香狼毒叶中分离鉴定的 7 ,8-二羟基香豆素单体为标准品 ,建立了
样品预处理快速 、流动相简单 、分离效果好的高效液相色谱分析方法 。
2　实验部分
2.1　仪器 、试剂与材料
HP-1050高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司);UV-2201紫外分光光度计(日本 Shimadzu 公司);
Magna-560型红外光谱仪(美国 Nicolet公司);Avance-600 型超导核磁共振谱仪(瑞士 Bruker公司);A-10
超纯水器(法国Millpore 公司);色谱数据处理系统为HPLC3DChemStation(DOS Series)(美国Agilent公司)。
甲醇(色谱纯 ,美国 Fisher公司);7 ,8-二羟基香豆素标准品(自制),纯度>98%;其余试剂均为分析
纯(天津试剂厂)。实验用水均为超纯水 。瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花样品采自内蒙古自治区赤峰市阿鲁科
尔沁旗道德苏木 ,晾干粉碎备用。高效薄层板(德国Merck公司);硅胶(青岛海洋化工厂)。
2.2　色谱条件
色谱柱:Alltech C18(250 mm×4.6 mm ,5 mm)柱;流动相:甲醇∶水(40∶60 , V/V);流速:1.0 mL/min;检测
波长:326 nm;柱温:28℃;进样量:10μL。
2.3　实验方法
第 32 卷
2004 年 12月
分析化学(FENXI HUAXUE)　研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第 12 期
1627 ～ 1630
2.3.1　7 ,8-二羟基香豆素的提取 、分离与定性鉴定　将瑞香狼毒叶 95%乙醇提取物60 g 用石油醚溶去
非极性组分后 ,乙醚萃取得提取物 4.2 g 加于硅胶柱进行分离 ,在石油醚∶丙酮(100∶4 , V/ V)洗脱液中得淡
黄色针状晶体 16 mg ,分别进行 UV 、IR及1H-NMR光谱测定。
2.3.2　7 ,8-二羟基香豆素对照品峰纯度检验和提取样品中 7 ,8-二羟基香豆素色谱峰的紫外光谱鉴定
利用二极管阵列检测器纯度检测功能 ,在洗脱过程中采集多点光谱 ,通过光谱叠加 ,检查杂质与组分之
间存在的光谱差异 ,由ChemStation软件作图比较 ,给出检测结果。
2.3.3　标准曲线的测定　准确称取 7 ,8-二羟基香豆素 4.43 mg ,用流动相定容至 5 mL 容量瓶中 ,依次
稀释成 0.8860 、0.1772 、0.0354 、0.0071和 0.0014(g/L)的标准溶液系列 , 0.25μm 膜过滤 , 10μL进样 ,平
行3次 ,求其峰面积的平均值得标准曲线 。
2.3.4　样品预处理及测定　经实验确定提取样品的最佳条件为:准确称取 1.0000 g样品 ,75%乙醇超
声浸提1.5 h ,过滤 ,用流动相定容至10 mL容量瓶中。按色谱条件10μL进样 ,对瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花
进行测定 ,计算 7 ,8-二羟基香豆素含量及回收率 。
3　结果与讨论
3.1　7 ,8-二羟基香豆素的定性鉴定结果
“2.3.1”中所得淡黄色针状晶体的波谱数据为:UV λMeOHmax nm(logε):262(3.25)、326(4.10),证实有香
豆素母核 。 IR(KBr) cm-1:3200(宽强峰 , 邻二羟基缔合峰);1710 、1680(C O );1320 、1140
(C O C );1600 、1580 、1512 、1451(苯核 C C )、838(邻二芳氢)。1H-NMR(CDCl3)δ(×10-6):
8.9 ～ 9.5(2H ,Br , Br2 或D2O取代则峰消失 ,邻二酚羟基上的氢), 6.27(1H ,d , J=10Hz ,3-H),7.93(1H ,
d , J=10Hz ,4-H),6.98(1H ,d , J=8.5Hz ,6-H),7.17(1H ,d , J=8.5Hz ,5-H)。上述波谱数据与文献[ 6]记载
7 ,8-二羟基香豆素(7 ,8-dihydroxy-coumarin)一致 。分子式为C9H6O4。
3.2　测定波长的选择
图1为 7 ,8-二羟基香豆素的紫外光谱 。两个特征吸收峰 ,最大吸收波长分别为 262和 326 nm 。因
326 nm处的 ε值大于 262 nm处的ε值 ,故选用 326 nm 为检测波长 。
3.3　7 ,8-二羟基香豆素标准品纯度
图2a为 7 ,8-二羟基香豆素色谱图 ,在该色谱峰顶点 ,起始点和终止点分别进行光谱采集 ,经归一化
及光谱叠加得图 2b。b 图中 3 点光谱曲线完全重合 ,光谱匹配系数为 999.546 ,接近完全匹配系数值
1000 ,故标准品纯度>98%。
3.4　标准曲线
按“2.3.3”测定标准曲线得线性回归方程为 y =11346.08x-55.4517 ,相关系数为 r=0.99996;线性
检测范围为1.4 ～ 880 mg/L ,按 3倍基线噪音计算得检出限为 0.2 mg/L(即3σ)。
1628　　 分 析 化 学 第 32 卷
3.5　样品中 7 ,8-二羟基香豆素色谱峰的紫外光谱鉴定
图3A为瑞香狼毒叶提取物的 HPLC 色谱图 , a 、b 、c峰的强度相对较高 ,这 3个峰的紫外吸收曲线分
别为图3B中的 a′、b′和 c′。由图 2B可知色谱峰 a、b 、c相对应的 3条紫外吸收曲线中只有 b′与标准品
的紫外光谱(图 1)吻合 ,故确定色谱峰 b为被检组分。
　图 3　样品色谱图J及紫外光谱图A
Fig.3　The chromatogram J and UV spectra A of
samples
3.6　瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花中7 ,8-二羟基香豆素含量
每份样品平行测定3次 ,得瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花中7 ,
8-二羟基香豆素平均含量 ,测定结果见表 1。由表 1可知在
瑞香狼毒的根 、茎 、叶 、花中以叶中 7 ,8-二羟基香豆素含量
最高 。
表 1　瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花中7 , 8-二羟基香豆素含量
Table 1　The contents of 7 , 8-dihydroxy-coumarin in the roots ,
stems , leaves and flowers of Stellera chamaejasme L.
根
Roots
茎
Stems
叶
Leaves
花
Flowers
含量 Content(%) 0.37 0.58 1.76 1.60
3.7　回收率的测定
瑞香狼毒叶样品中 7 , 8-二羟基香豆素的回收
率在 95.8%～ 100.8%间 ,RSD=1.92%(n =6)(表
2)。由此可见 ,该方法准确 ,精密度较高。根 、茎 、
花的回收率测定方法相同 ,数据在要求的范围之
内。
4　结　　论
建立了 7 ,8-二羟基香豆素含量的高效液相色
谱定量分析方法 。利用二极管阵列检测器对自制
表 2　7 , 8-二羟基香豆素加样回收率测定结果(n=6)
Table 2　Recovery test of 7 , 8-dihydroxl-coumarin(n=6)
序号
No.
加入量
Added
(μg)
测定值
Found
(μg)
回收率
Recovery
(%)
RSD
(%, n=6)
1 1.30 1.26 96.7
2 1.30 1.25 95.8
3 1.30 1.31 100.8 1.92
4 1.30 1.28 98.3
5 1.30 1.25 95.8
6 1.30 1.27 97.5
标准品的峰纯度进行了检测。样品经预处理后可直接进行 HPLC分析 ,测得 7 ,8-二羟基香豆素在瑞香
狼毒根 、茎 、叶和花中的含量分别为 0.37%、0.58%、1.76%和 1.60%;回收率为 95.8%～ 100.8%;RSD
为1.92%(n=6)。该方法简便 、准确 、线性范围宽 、重现性好 ,适于各种含有 7 ,8-二羟基香豆素药用植
物的检测 。
References
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hai(上海):Shanghai Science &Technology Press(上海科学技术出版社), 1977:1898
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6　Ji Chunru(冀春如).Acta Botanica Sinica(植物学报), 1994 , 13(3):152～ 153
1629第 12期 田尚衣等:高效液相色谱法测定瑞香狼毒根 、茎 、叶 、花中 7 , 8-二羟基香豆素的含量 　　
Determination of 7 ,8-Dihydroxyl-coumarin in Roots ,
Stems , Leaves and Flowers of Stellera Chamaejasme L.by
High Performance Liquid Chromatography
Tian Shangyi , Wei Chunyan＊ , Zhou Daowei , Feng Na, Pan Rui
(Institute of Grassland Science , Northeast Normal University , Key Laboratory for Vegetation Ecology ,
Ministry of Education , Changchun 130024)
Abstract　A determination method of 7 , 8-dihydroxy-coumarin in roots , stems , leaves and flowers of Stellera
chamaejasme L.by reversed-phase high performance liquid chromatography was established and at the same time the
purity of 7 , 8-dihydroxy-coumarin was detected by means of Diode-Array Detector.The chromatographic column ,
Alltech C18(250 mm×4.6 mm , 5 μm), methanol-water(40∶60 , V/ V)mobile phase with 1.0 mL/min flow rate ,
the detected wavelength(326 nm), and the column temperature (28℃)were adopted.The calibration curve was
linear under the concentration of 1.4 ～ 880 mg/L , the correlation coefficient was over 0.9999 , the detected limit
was 0.2 mg/L(3σ).The contents of 7 , 8-dihydroxy-coumarin in roots , stems , leaves and flowers of Stellera
chamaejasme L.were 0.37%, 0.58%, 1.76% and 1.60%, respectively.The recovery was 95.8%～ 100.8%
and RSD was 1.9%(n =6).The method is simple , accurate and has wider linear range.The method can be
adapted to evaluate the quality of medicinal plants that contain 7 ,8-dihydroxy-coumarin.
Keywords 　Stellera chamaejasme L., 7 , 8-dihydroxyl-coumarin , reversed-phase high performance liquid
chromatography , diode-array detector
(Received 17 December 2003;accepted 23 March 2004)
关于召开“第九届全国电分析化学学术会议”的通知
(第一轮通知)
　　中国化学会 、中国金属学会 、中国仪器仪表学会联合主办 、江苏省化学化工学会分析化学专业委员会协办的“第九届
全国电分析化学学术会议”定于 2005 年 10月 28 日～ 11月 1 日在南京召开。本次大会由南京大学负责筹备 , 由汪尔康院
士 、陈洪渊院士任大会主席。会议邀请国内从事电分析化学研究的著名科学家及中青年学者参加 , 并在全国范围内征
文 ,热忱欢迎踊跃投稿并到会交流。有关征文事宜通知如下:
一 、会议主题
(1)电分析化学基础理论与发展综述;(2)生物电分析化学;(3)电化学传感器与电化学免疫分析;(4)化学修饰电极
与微电极;(5)电位法 、伏安法及其它电分析技术;(6)电分析化学联用技术;(7)界面电化学与光谱电化学;(8)纳米电分
析化学;(9)电分析化学仪器的新发展及其应用;(10)其它。
二 、征文内容
(1)凡与上述主题相关的分析新理论 、新方法和新技术均为本次大会的征文范围。已在刊物上发表或全国会议上报
告过的论文不在应征之列。(2)作者需提交电子版论文的详细摘要 , 用WORD软件编辑 ,其中包括题目 、作者 、单位 、主要
结果和讨论 、主要参考文献和英文摘要。全文不超过 2 页(A4 纸 、15 cm×24 cm 、含图表), 题目请用小三号黑体 、全文用
小四号字宋体或 Times New Roman打印。论文务必请提供稿件联系人电话 、通讯地址和 Email地址。
三 、联系方式
(1)应征论文请发至 hxju@nju.edu.cn 电子信箱 , 均注明“会议征文”字样 ,截稿日期 2005 年 6 月 31日。
(2)会议相关事宜请与大会秘书长鞠 先教授联系 , 电话 025-83593593。
欢迎国内外分析仪器公司 、厂商到会介绍和展出产品。
第九届全国电分析化学学术会议筹备组
1630　　 分 析 化 学 第 32 卷