全 文 ：2007年第06期
Vol.28,No.06,2007
研究与探讨
食品工业科技
金 线 兰 提 取 液
清除 NO2-·作用的实验研究
龚宁 1,2,蔡宜伶 1,莫稳方 1,石丽霞 1,孙 辉 1,郭 义 1
(1.贵州师范大学生物技术与工程学院,贵州贵阳550001;
2.贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室,贵州贵阳550001)
摘 要:按国家标准 GB\T5009.33—1996中“格里斯试剂比色法”
测定了金线兰全草水提液、各营养器官水提液和金线兰
全草石油醚提取部位(AP)、氯仿提取部位(AC)、乙醇提
取部位(AE)以及水提取部位(AW1、AW2)在模拟胃液条
件下对NO2-·的清除作用。结果表明,金线兰全草水提液
对NO2-·具有清除作用,清除率对提取液浓度的曲线为
抛物线型;在各营养器官中,叶水提液的清除作用最强;
在各提取部位中,水提取部位的清除能力明显高于其它
提取部位,说明金线兰清除NO2-·的活性物质主要是水
溶性的极性分子。
关键词:金线兰,清除,NO2-
Abstract:Aqueousextractsofwholeplant,leaf,aerialstem,
rhizome,rootofAnoectochilusroxburghi(Wal.)Lindl.
withpetroleum (AP),chloroform (AC),ethanol(AE),
water(AW1,AW2)ofwholeplanofAnoectochilus
roxburghi (Wal.)Lindlwere prepared,and their
scavenging ofNO2 -· underthe condition of
simulatedgastricjuiceinvitrowasestimatedby
methodsbasedonnationalstandardGB\T5009.33—
1996.Theresultsdemonstratedthattheaqueous
extractofwholeplantofAnoectochilusroxburghi(Wal.)
Lindl.hadcapacityofscavengingNO2-·.Invegetative
tissues,theaqueousextractofleafhadthehighest
capacityofscavenging NO2-· .Thecapacityof
scavengingNO2-·byAW1andAW2wasobviously
higherthanthatbyAP,ACandAE.
Keywords:Anoectochilusroxburghi(Wal.)Lindl.;scavenging;
NO2-·
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A
文 章 编 号 :1002-0306(2007)06-0057-03
收稿日期:2006-08-02
作者简介:龚宁(1963-),女,副教授,研究方向:药用植物开发与利
用,植物生理。
基金项目:贵州省科学技术基金资助项目 [黔科合 J字(2005)2040
号];贵州省高校发展专项资金自然科学类重点项目(黔教
科2004110)。
金线兰 (Anoectochilusroxburghi(Wal.)Lindl.)又
名花叶开唇兰,为兰科开唇兰属植物[1],是民间作为
“金线莲”药材使用的正品,具有多种药用和保健作
用[2]。近年来,台湾地区居民将其作为珍贵的健康补
品使用,开发出饮料、口服液等系列产品[3],但目前对
其药用和保健作用的机理却研究很少。NO2-·是广泛
存在于蔬菜、腌制品等食品中的有害物质,人体吸入
的NO2-·在一定条件下可转化成具有强致癌作用的
亚硝胺,进而诱发消化系统癌变[4]。金线兰是否具
有 NO2-·清除作用尚未见报道。本文测定了金线兰
提取液在体外模拟胃液条件下对 NO2-·的清除作
用,并对其各器官及各提取部位的清除能力进行了
比较研究。
1材料与方法
1.1材料与仪器
金线兰 (Anoectochilusroxburghi(Wal.)Lindl.)
采集自贵州省荔波县翁昂乡,经贵州师范大学王承
录副教授鉴定,标本保存于贵州师范大学生物技术
与工程学院;亚硝酸钠 为国产光谱纯;其余试剂 均
为国产分析纯。
722分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;电子
恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;JD200-3
电子天平 沈阳龙腾电子有限公司;THZ-82数显恒
温震荡器 国华电器有限公司。
1.2实验方法
1.2.1提取液制备 金线兰全草、叶、地上茎、根状茎
和根均于 40℃烘干至恒重,干/鲜分别为 11.23%、
13.06%、8.86%、5.33%和57.14%。分别称取干品,粉
碎过 2号筛,加入 15倍蒸馏水 80℃恒温震荡提取
1h,过滤,滤渣再加6倍蒸馏水80℃恒温震荡提取
1h,过滤,合并两次滤液即得金线兰全草水提液、叶
水提液、地上茎水提液、根状茎水提液和根水提液。
根据确定有效成分的部位分离原理[5]制备各提取部
位:取全草干品,粉碎过 2号筛,加入 10倍石油醚,
室温下震荡提取4h,过滤,滤液即为石油醚提取部位
(AP);滤渣风干后加入10倍氯仿,40℃恒温震荡提
取4h,过滤,滤液为氯仿提取部位(AC);滤渣风干后
加入10倍无水乙醇,60℃恒温震荡提取4h,过滤,滤
液为乙醇提取部位(AE);滤渣风干后均分为两份,一
份加入10倍蒸馏水于80℃恒温震荡提取4h,过滤,
滤液为水提取部位 1(AW1),另一份用 10倍蒸馏水
57
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2007.06.008
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
研究与探讨
2007年第06期
食品工业科技
于80℃恒温震荡提取 2次,每次 1h,过滤,合并两次
滤液即为水提取部位2(AW2)。将上述各提取液置于
冰箱备用,用时根据预实验结果配成不同浓度供试
液,浓度以每毫升相当于多少毫克金线兰干品表示。
1.2.2体外模拟胃液条件下的 NO2-·清除反应 在一
系列装有1.5mLpH=3的柠檬酸-磷酸缓冲液 (模拟
胃液 pH条件)的试管中,于样品管中加入 0.5mL不
同浓度的供试液和0.5mL浓度为5.0!g·mL-1的标准
NaNO2溶液;样品空白管中加入 0.5mL不同浓度的
供试液和0.5mL蒸馏水;对照管中加入0.5mL提取
介质(即供试液浓度为零)和 0.5mL浓度为 5.0!g·
mL-1的标准NaNO2溶液;对照空白管中加入 0.5mL
提取介质和0.5mL蒸馏水。混匀后于37℃(模拟胃液
温度条件)恒温水浴中保温30min,取出冷却至室温,
之后按国标GB\T5009.33-1996中 “格里斯试剂比色
法”[6]测定各管的吸光度,样品管的吸光度记为A样品,
样品空白管的吸光度记为A样品空白,对照管的吸光度
记为A对照,对照空白管的吸光度记为A对照空白。清除
率按下式计算:清除率=[(原 NaNO2的量-残余
NaNO2的量)/原 NaNO2的量]×100%={[(A对照-A对照空
白)-(A样品-A样品空白)]/(A对照-A对照空白)}×100%。测定
重复三次。
2实验结果
2.1金线兰水提液对NO2-·的清除作用
金线兰全草水提液对NO2-·具有清除作用,其清
除率对提取液浓度的曲线呈抛物线型,即在低浓度
时随浓度增加清除率增加较快,当浓度增加到一定
高度时,随浓度增加其清除率增加变得缓慢,见图1。
金线兰各营养器官水提液对 NO2-·的清除作用见图
2。图2表明,金线兰各营养器官均具有清除NO2-·的
作用,其中根部的作用相对较弱,叶的作用最强,根
状茎和地上茎的作用介于二者之间,说明叶中存在
更多的清除NO2-·的活性物质。
2.2金线兰各提取部位对NO2-·的清除作用
测定了石油醚提取部位 AP、氯仿提取部位 AC、
乙醇提取部位 AE以及用两种方法得到的水提取部
位AW1和AW2对NO2-·的清除作用,结果表明,AP
对 NO2-·的清除作用很弱,AC和 AE渐强,AW1和
AW2的作用非常强,明显强于其余部位,说明金线兰
清除NO2-·的有效成分主要存在于其水提取部位中,
见表1。
3讨论
本实验证明金线兰具有清除NO2-·的作用,我们
还发现金线兰能清除超氧阴离子自由基和羟自由
基[7],这些结果对于认识金线兰的保健作用机理具有
一定价值。
在各营养器官中,金线兰叶提取液对NO2-·的清
除作用最强,但植物各器官中化学成分的含量有可
能会随季节而变化。我们实验用材料采自2005年7
月,各器官对NO2-·的清除能力是否会随季节而变化
以及变化规律等问题有待进一步研究。
由于柠檬酸具有清除NO2-·的作用,我们实验中
设了平行对照,在所有管中均加入等量柠檬酸-磷酸
缓冲液,以消除因柠檬酸对NO2-·的清除作用而损失
的NaNO2量。金线兰提取液呈粉红色,这会对吸光度
的测定产生影响,我们在实验中设了空白,以消除因
提取液带有颜色对测定结果的影响。
几个提取部位对 NO2-·的清除作用表现出随提
取介质极性的增高而增强,在四种提取介质中,水的
极性最高,水提取部位的清除作用也最强,明显强于
其余三个部位,说明金线兰清除NO2-·的有效成分主
100.00
90.00
80.00
70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
清
除
率
( %
)
0.00 1.28 2.56 3.84 5.12 6.40
反应体系中金线兰全草水提液的浓度(mg/mL)
图1金线兰全草水提液对NO2-·的清除作用
提取部位
NO2-·清除率(%)
6.40(mg/mL) 12.80(mg/mL)
AP 3.59±0.47 4.33±0.68
AC 8.82±1.59 14.18±0.46
AE 17.16±0.69 44.92±1.29
AW1 76.69±3.49 83.34±0.52
AW2 90.46±0.41 92.15±0.80
表1金线兰各提取部位对NO2-·的清除作用(%)
注:表中数据根据三次测定结果算出,以x±s表示。
100.00
90.00
80.00
70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
清
除
率
( %
)
叶
地上茎
根状茎
根
反应体系中金线兰各营养器官水提液的浓度(mg/mL)
图2金线兰各营养器官水提液对NO2-·的清除作用
0.00 1.28 2.56 3.84 5.12 6.40
(下转第124页)
58
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
研究与探讨
2007年第06期
食品工业科技
要是水溶性的极性分子,可能是这类成分活性高,也可
能是这类成分含量多。对开唇兰属植物化学成分的研
究自20世纪90年代初陆续有了报道,到目前为止,
中外学者从本属中得到了甾体、有机酸、苷类、黄酮、
氨基酸、微量元素和糖类[9],而有机酸、黄酮、还原糖和
多糖是可以清除 NO2-·的 [9]。金线兰中含有高达
13.326%的多糖成分[10],它对NO2-·的清除作用很可能
主要是其多糖的贡献,进一步的实验在进行之中。
参考文献:
[1]中国科学院中国植物志编委会.中国植物志(第 17卷)[M].
北京:科学出版社,2000.220.
[2]郑纯,黄以钟,季莲芳.金线莲文献考证、原植物及商品调查
[J].中草药,1996,27(3):169～171.
[3]刘国民,李薇,李娟玲.开唇兰的价值与研发概况[J].贵州科
学,2001,19(2):27～36.
[4]周泽义,胡长敏,王敏健,等.中国蔬菜硝酸盐和亚硝酸盐污
染因素及控制研究[J].环境科学进展,1998,7(5):1～13.
[5]王宁.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,2002.119～
120.
[6]GB\T5009.33—1996,中华人民共和国国家标准-食品中亚
硝酸盐与硝酸盐的测定方法[S].
[7]龚宁,邓琳琼,唐兰秀,等.花叶开唇兰清除活性氧作用研究
[J].中药药理与临床,2006,22(2):39～41.
[8]何春年,王春兰,郭顺星,等.兰科开唇兰属植物的化学成分
和药理活性研究进展[J].中国药学杂志,2004,39(2):81～84.
[9]宁正祥,赵谋明,邝荣泽.新鲜果蔬保健作用的探讨[J].营养
学报,1992,14(3):260～265.
[10]赖应辉,吴锦忠.金线莲中无机元素及糖类的分析[J].中药
材,1997,20(2):84～85.
其单位面积的利用率。另外,此种亲和膜具有低特异
性相互作用、易制备、不易变形等优点,因此具有一
定的应用前景。但是此亲和膜也存在不稳定的缺点,
因为影响它的因素较多,因此有待于进一步研究。
参考文献:
[1]PorothJ,CarlssonI,BelfrageG.Metalionafinityadsorption
and immobilized metal ion afinity chromatography of
biomaterials:Serum proteinafinitiesforgel-immobilizediron
andnickelions[J].Nature,1975,258(5536):598～599.
[2] Rassi Z E,Horvath C. Metal chelate-interaction
chromatographyofproteinswithiminodiaceticacid-bonded
stationaryphasesonsilicasupport[J].Chromatography,1986,
(359):241～253.
[3]PRHari,WiliPaul,ChandraPSharma.Adsorptionof
humanIgGonCu2+-immobilizedceluloseafinitymembrane:
Preliminarystudy[J].BiomedMaterRes,2000,50:110～113.
[4]EliRuckenstein,WeiGuo.Crosslinkedmercerizedcelulose
membranes and their application to membrane afinity
chromatography[J].JournalofMembraneScience,2001,187:
277～286.
[5] Yueh-Hua Tsai,Min-Ying Wang,Shing-YiSuen.
Purificationofhepatocytegrowthfactorusingpolyvinylaiene
fluoride -based immobilized metal afinity membranes:
equilibriumadsorptionstudy[J].JournalofChromatographyB,
2001,766:133～143.
[6]WeiGuo,EliRuckenstein.Anewmatrixformembrane
afinitychromatographyanditsapplicationtothepurificationof
concanavalinA [J].JournalofMembraneScience,2001,182:
227～234.
[7] LYang,WWHsiao,PChen.Chitosan-celulosecomposite
membrane for afinity purification of biopolymers and
immunoadsorption[J].JournalofMembraneScience,2002,197:
185～197.
[8]LYang,PChen.Chitosan/coarsefilterpapercomposite
membraneforfastpurificationofIgGfrom humanserum[J].
JournalofMembraneScience,2002,205:141～153.
[9]Chun-YiWu,Shing-YiSuen,Shiow-ChingChen,etal.
Analysisofproteinadsorptiononregeneratedcelulose-based
immobilized copperion afinity membranea [J].Journalof
ChromatographyA,2003,996:53～70.
[10]LarsSundberg,JerkerPorath.Preparationofadsorbentsfor
biospecificafinitychromatographyI.Atachmentofgroup-
containingligandstoinsolublepolymersbymeansofbifunctional
oxiranes[J].JournalofChromatographyA,1974,90(1):87～98.
[11]张亚辉,杨严俊.纤维素金属螯合亲和膜的制备及其对牛
血清白蛋白的吸附研究[J].食品工业科技,2005,26(3):89～92.
[12]FengnaXi,JianminWu.Macroporouschitosanlayercoated
onnon-poroussilicagelasasupportformatalchelateafinity
chromatographicadsorbent[J].JournalofchromatographyA,
2004,1057:41～47.
[13]MohamedHashem,RakiaRefaie,AliHebeish.Crosslinking
ofpartialycarboxymethylatedcotonfabricviacationization[J].
JournalofCleanerProduction,2005,13:947～954.
[14]Yung-ChuanLiu,Chih-ChiangChangChien,Shing-Yi
Suen.PurificationofpenicilinG acylaseusingimmobilized
metalafinitymembranea [J].JournalofChromatographyB,
2003,794:67～76.
[15]ThomasBeeskow,KarlHeinzKroner,FriedrichBirger
Anspach.Nylon-BasedAfinityMembranes:ImpactsofSurface
ModificationonProteinAdsorption[J].Journalofcoloidand
interfacescience,1997,196:278～291.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
(上接第58页)
124