全 文 ：第 31卷 第 1期 西 南 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 2006年 2月
Vol. 31 N o. 1 Journal of Southwest China Normal University (Natural Science) Feb. 2006
文章编号:1000 5471(2006)01 0134 04
南方红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离和筛选①
胡 凯1 , 2 , 谈 锋1 , 唐克轩3 , 祝顺琴1 , 王 微2
1. 西南大学 生命科学学院 , 三峡库区生态环境教育部重点实验室 , 重庆 400715;
2. 重庆文理学院 生命科学系, 重庆 永川 402168;
3. 上海交通大学 农业与生物学院植物生物技术研究中心, 上海 200030
摘要:从南方红豆杉中分离得到 21 株内生真菌 , 在 PDA 液体培养基中发酵后经 HPLC 检测 , 发现有 3 株能够产
生紫杉醇 , 它们是 XT5(Ectostroma sp.)、 XT2(botrytis sp. )和 XT17(Pa pulaspora sp. ), 其紫杉醇产率分别是
276. 75 μg / L、 161. 24 μg / L 和 10. 25 μg /L.
关 键 词:南方红豆杉;内生真菌;紫杉醇;高效液相色谱
中图分类号:Q946 文献标识码:A
Wani等[ 1] 从短叶红豆杉(Taxus brev i folia N ut t. )的树皮中分离得到紫杉醇(Taxol), 并发现其具有
抗癌作用 , 其作用机理是紫杉醇与微管蛋白结合 , 促进其聚合 , 抑制癌细胞有丝分裂 , 阻止癌细胞的无限
增殖[ 2] , 以后人们开始大量地从红豆杉的树皮中提取紫杉醇以满足需求. 由于红豆杉系珍稀植物 , 而树皮
中的紫杉醇含量很低 , 靠树皮提取紫杉醇不能满足需求 , 并且严重地破坏自然资源 , 危及生态平衡. 为了
解决药源紧缺状况 , 国内外学者在红豆杉的细胞培养和紫杉醇的化学合成等方面进行了许多研究. 但是由
于上述方法生产的紫杉醇成本昂贵 , 目前还没有广泛应用的价值.
S tierle与 Stroble[ 3] 首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌(Taxomyces an-
dreanae), 其紫杉醇含量为 24 ～ 50 ng /L , 为人们展示了一个可能生产紫杉醇的诱人的新途径. 利用微生物
发酵生产紫杉醇具有许多优点:内生真菌生长迅速 , 易于培养 , 可以在发酵罐中进行工业化生产;所用的
培养基成本相对较低;可以通过优化发酵条件 、利用生物技术改良菌种 , 大幅度提高产量 , 满足市场的需
求 , 降低紫杉醇的价格. 所以筛选产紫杉醇内生真菌 , 用微生物发酵的方法生产紫杉醇 , 是解决药源问题
的有效途径.
1 材料与方法
1. 1 材 料
红豆杉树皮和枝条采自生长在重庆缙云山的南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei).
1. 2 试 剂
紫杉醇标准品购于 sigma公司 , 链霉素购于华美生物工程公司 , 其余试剂均为国产分析纯.
1. 3 培养基
固体培养基选用 PDA 培养基[ 4] . 马铃薯 200 g , 葡萄糖 20 g , 琼脂粉 5 g , 蒸馏水 1 000 mL , pH 自然 ,
121 ℃, 20 min灭菌 , 冷却至 60 ～ 70 ℃加入 25 mg /L 链霉素. 液体培养基选用 PDA 培养基不加琼脂.
1. 4 内生真菌分离
将南方红豆杉的树皮和枝条切成约 1. 5 cm 的小段 , 分别经 75%的酒精消毒 10 min和 0. 1%的升汞溶
① 收稿日期:2005 03 28
基金项目:国家“ 863”资助项目(2002AA212191).
作者简介:胡 凯(1980 ), 男 , 四川资中人 , 硕士研究生 , 主要从事药用植物生物技术与生化工程的研究.
通讯作者:谈 锋 , 教授;唐克轩 , 教授.
DOI牶牨牥牣牨牫牱牨牳牤j牣cnki牣xsxb牣牪牥牥牰牣牥牨牣牥牪牴
液处理 15 min , 然后用无菌水冲洗 , 接种于含链霉素的 PDA固体培养基平皿上 , 放置于 25 ℃恒温箱中培
养 , 待长出菌落后 , 按无菌操作程序挑出 , 在PDA 斜面培养基上纯化 3次以上. 然后将纯化后保存在 PDA
斜面培养基上的菌株放入冰箱中 4 ℃保藏备用.
1. 5 内生真菌的液体培养
将分离纯化后得到的真菌菌株进行摇床液体扩大培养 , 用无菌 PDA 液体培养基将真菌菌丝体和孢子
洗下接入 250 mL 三角瓶 , 28 ℃, 200 r /min培养 3 d作种子培养基 , 种子培养基再接入 1 L 摇瓶扩大培养
8 d. 每种菌保证初始液体培养基为 1 L.
1. 6 紫杉醇的提取分离及高效液相色谱的定性和定量鉴定[ 5 9]
利用 HPLC 建立紫杉醇标准曲线:以甲醇∶水(v /v)=65∶35 为流动相 , 将紫杉醇标准品分别配制
成:5 μg /mL , 10μg /mL ,15 μg /mL , 20μg /mL ,40μg /mL ,60μg /mL ,80μg /mL ,的浓度梯度 , 进样量 20μL ,
用高效液相色谱(HPLC)测定 , 条件为:流动相 , 甲醇∶水(v /v)=65∶35;反向C18柱(250 mm×4. 6 mm , 5
μm), 流速 1 mL /min , 检测波长 228 nm. 每种浓度重复测定 3次 , 绘制标准曲线.
样品紫杉醇含量测定:将发酵液 4 000 r /min离心 , 取上清液于 60 ℃旋转蒸发至 1 /10体积后 , 加入等
体积的乙酸乙酯在超声波下萃取 1 h , 收集乙酸乙酯相 , 沉淀的菌体用组织捣碎仪处理后 , 经低温冻溶 2
次 , 加入一定量乙酸乙酯用超声波细胞破碎仪破碎细胞. 加入等体积乙酸乙酯超声波提取 1 h , 收集乙酸乙
酯相. 菌体沉淀和上清液再加入等体积的乙酸乙酯超声波提取 2次. 合并乙酸乙酯相 , 并于50 ℃旋转蒸发
至干 , 加入适量甲醇溶解洗涤固体物 , 再加入二氯甲烷和水 1∶1(v /v)萃取后 , 将二氯甲烷相 45 ℃旋转蒸
发至干 , 用少量乙醇溶解过滤后上高效液相色谱做定性及定量检测 , 检测条件同上.
2 结 果
2. 1 内生真菌分离和菌种鉴定
从南方红豆杉树皮中分离出21株内生真菌 , 测定其发酵物的紫杉醇含量;根据菌落 、菌丝体 、分生孢子 、
分生孢子梗和菌核的形态 , 参考《真菌鉴定手册》[ 10]对分离的 7种内生真菌进行了分类学鉴定. 结果见表 1.
表 1 从南方红豆杉树皮中分离的内生真菌的培养特性和紫杉醇含量
Table 1 The Taxol Content , Culture Characteristic and Mo rpholo gy of Endophy tic Fungus
f rom Taxus chinensis var. mairei
菌株代号
(分类地位) 培 养 特 性 形 态 特 点
紫杉醇含量
/μg L - 1
XT2 葡萄孢属
(botry tis sp.)
菌落初为白色 , 渐变为墨绿色后表面覆盖灰白色
菌丝体 , 菌丝体密集生长迅速 , 基质深黑色.
菌丝无隔膜 , 分生孢子梗无色
细长 , 分枝顶生芽孢子. 161. 24
XT3 头孢霉属
(Cephalosporium sp. )
菌落白色短绒毛状 , 菌丝贴培养基生长呈绒膏
状 , 基质无色 ,
不孕菌丝匍匐状 , 分生孢子梗
长 , 分生孢子生于小梗上 , 埋
于胶质中.
未检出
XT5 茎叶核菌属
(Ectostroma sp. )
菌落白色 , 后期为米黄色 , 长绒毛状 , 生长迅速 ,
后期形成圆形小颗粒状暗色菌核.
不孕性菌丝棉絮状 , 未发现有
性和无性孢子 , 菌核外层分化
不明显 , 中心无色.
276. 75
XT6 拟茎点霉属
(Phomopsis sp.)
菌落灰白色 , 短绒毛状 , 菌丝体泡状堆积 , 生长
迅速 , 基质无色.
分生孢子器球形 , 分生孢子长
梭形 , 无色. 未检出
XT8 短链孢霉属
(S elenotila sp. ) 菌落灰色 , 短绒毛状 , 生长较慢 , 基质灰褐色.
菌丝体有隔膜 , 分生孢子 2 ～
3 个相联 , 不串生 , 无色 . 分
生孢子梗几乎不存在.
未检出
XT12链孢属
(S irococcus sp. )
菌落黑色 , 绒状 , 表面散布白色绒状菌丝 , 基质
深黑色 , 生长迅速.
分生孢子器卵圆形 , 分散 , 粗
糙 , 分生孢子串生. 未检出
XT17团丝核菌属
(Papulaspora sp. )
菌落粉红色 , 短绒毛状 , 在培养基上平铺生长呈
粉色绒膏状 , 基质粉红色 , 生长较慢. 后期形成
菌核.
菌丝淡粉色 , 菌核由小球形细
胞组成 , 黑色. 10. 25
135第 1期 胡 凯 , 等:南方红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离和筛选
2. 2 紫杉醇的标准曲线
结果表明 , 紫杉醇的进样量在0. 1 ～ 1. 6μg 范围内具有良好的线性关系 , 其回归方程为Y =16 335. 6+
18 672. 3 X , 相关系数为 0. 999 56(图 1 ,2).
2. 3 内生真菌发酵物中紫杉醇含量的检测
对 21株内生真菌发酵产物进行高效液相色谱检测(图 1 ,3), 结果发现 XT2 、XT5和XT17三个内生真
菌菌株能够产生紫杉醇.
图 1 紫杉醇标准品 HPLC 的 UV 检测图谱
Fig. 1 The HPLC Chromatog ram of Taxol Standard
图 2 紫杉醇标准曲线
Fig. 2 The S tandard Curve of Taxo l
图 3 XT5发酵提取物 HPLC
的 UV 检测图谱
Fig. 3 The HPLC Chromatog ram
of XT5 Ex traction
3 讨 论
到目前为止 , 人们已经从红豆杉中分离出了多种产紫杉醇的
内生真菌. St ie rle 博士等[ 2] 从短叶红豆杉的韧皮部中分离得到安
德鲁紫杉菌 , 邱德有等[ 11] 从云南红豆杉树皮中分离出一种内生真
菌 YFI , S trobel等[ 12]从西藏红豆杉中分离到一株产生紫杉醇的内
生真菌小孢拟盘多毛孢 , 尼泊尔盘端鹿角菌 , 王建峰等[ 13] 从南方
红豆杉中分离到一种可以产生紫杉醇的内生真菌瘤座菌属 , 周东
坡等[ 14] 从东北红豆杉中发现一种内生真菌—树状多节孢. 这些菌
的产量范围为 25 ～ 184 μg /L , 具有形态和地域的多样性 , 紫杉醇
产率有很大差异 , 但是距工业化生产还有一定差距. 一般来说 , 产
量能达到 1 mg /L 才能达到大生产盈亏平衡.
本实验从南方红豆杉的树皮中分离得到 21个内生真菌 , 通过
HPLC对其发酵物中紫杉醇含量进行了检测 , 发现有 3个菌株能
够产生紫杉醇 , 其中 , XT2 和 XT5 菌株的含量较高 , 分别为
161. 24μg /L 和 276. 76 μg /L , 后者高于王建锋等[ 13] 的报道 , 是目前产率最高的菌株之一. XT5在常规的
PDA 液体培养基中易于培养 、生长迅速 , 8 d的生物量就达到了298 g /L(湿重), 是一株很有前途的产紫杉
醇内生真菌. 相信通过发酵条件的优化和生物技术的改良 , 其紫杉醇含量能够继续提高.
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Isolation and Screening of Endophytic Fungi
Synthesizing Taxol from Taxus chinensis var. mairei
HU Kai1 , 2 , TAN Feng1 , TANG Ke-xuan3 ,
ZHU Shun-qin1 , WANG Wei2
1. School of Life Sciences , Southwest University , Key Laboratory of the Three
Gorges Reservoir Regions Eco-Environment (Ministry of Education), Chongqing 400715 , China;
2. Life Science Department , ChongqingUniversity of Arts and Sciences , Yongchuan , Chongqing 402168 , China;
3. Plant Biotechnology Research Center , School of Agriculture and Biology , Shanghai Jiao Tong University , Shanghai 200433 , China
Abstract:Tw enty-one endophyt ic fungi have been already iso lated f rom Taxus chinensis var. mairei. T hree
st rainscul tures have been checked out taxo l by HPLC in these endophy tic fungus. The tax ol yield of XT5
(Ectostroma sp. ), XT2(botry t is sp. )and XT17(Papulaspora sp.)we re 276. 75 μg /L , 161. 24 μg /L and
10. 25μg /L respect ively.
Key words:Taxus chinensis var. mairei;endophy tic fungus;taxo l;HPLC
责任编辑 胡 杨
137第 1期 胡 凯 , 等:南方红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离和筛选