全 文 ：分子植物育种，2008年，第6卷，第2期，第297-301页
MolecularPlantBreeding,2008,Vol.6,No.2,297-301
研究报告
ResearchReport
催眠睡茄的离体快繁及四倍体的诱导
林春来 1 汪卫星 1 梁国鲁 1* 郭启高 1 聂振鹏 2 向素琼 1 李晓林 1 梁君 1 秦川 3
1西南大学园艺园林学院,重庆,400716;2浙江省柑桔研究所,台州,318020;3西南大学药学院,重庆,400716
*通讯作者,lianggl@swu.edu.cn
摘 要 以催眠睡茄腋芽为外植体建立快繁体系，利用秋水仙素进行催眠睡茄四倍体诱导，并将其与二倍体
进行了初步的形态学和细胞学方面的比较。结果发现：催眠睡茄二倍体(2n=2×=48)最适增殖培养基为MS+
6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L；生根培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L；四倍体(2n=4×=96)诱导率因秋水仙素浓
度和处理时间的不同而异，其中用0.5%的秋水仙素对丛生芽浸泡处理48h诱导率最高，诱导率可达13.79%。
四倍体与二倍体相比：叶片明显变厚，颜色加深，叶片气孔及其保卫细胞大小增大，气孔密度减小，且保卫细胞
内叶绿体数目增加。
关键词 催眠睡茄,离体,快繁,四倍体,诱导
RapidPropagationandTetraploidInductionofWithaniasomnifera
LinChunlai1 WangWeixing1 LiangGuolu1* GuoQigao1 NieZhenpeng2 XiangSuqiong1 LiXiaolin1
LiangJun1 QinChuan3
1HorticultureandLandscapeColege,SouthwestUniversity,Chongqing,400716;2ZhejiangCitrusResearchInstitute,Taizhou,318020;3Colegeof
PharmaceuticalScience,Chongqing,400716
*Corespondingauthor,lianggl@swu.edu.cn
Abstract AnefectiveprotocolforplantgenerationwasdevelopedfromaxilaryshootofWithaniasomnifera
(L.)Dunal.Tetraploid(2n=4x=96)wasinductedinWithaniasomnifera(L.)Dunalbyusingcolchicinetreatment
method.Comparisonofplantsbetweentetraploidanddiploid(2n=2x=48)bymorphologyandcelmethod.There-
sultsshowedthatthepropermediaMS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%sucroseisformultiplication,and
1/2MS+IBA0.2mg/L+1.5%sucroseforrooting.Theinductionrateoftetraploidinvitrodependedonconcentra-
tionofcolchicineanddurationoftreatment.Thehighestinductionrateoftetraploid,13.79%,wasobtainedfrom
invitroplantletswith0.5%colchicinefor48h.TetraploidofWithaniasomniferawascharacterizedbythicker
leavesanddeepercolours;Itssizeofstomataandguardcelwerelargerandthedensityofstomatawaslowerthan
diploid.
Keywords Withaniasomnifera(L.)Dunal,Invitro,Rapidpropagation,Tetraploid,Induction
催眠睡茄属茄科(Solanaceae)睡茄属(Withania)植
物，高约1.5m，叶为卵形，花绿色或灰黄色，浆果为
红色。它的别名众多，如印度人参、南非醉茄、心叶青
牛胆、冬樱桃等。主要生长在印度、南非、巴基斯坦等
地。催眠睡茄用于印度草医学已有3000多年历史，
可全草入药，其中主要的药用成分集中在植株的根
部。催眠睡茄主要用作壮阳药和肝脏滋补品。临床和
动物实验证明它可用于治疗支气管炎、哮喘、溃疡、
衰弱、失眠、老年痴呆、焦虑、认知和神经混乱、帕金
森症等。在抗菌、抗炎症、细胞毒和细胞免疫等方面
表现出显著的生理作用 (ArchanaandNamasivayam,
1998;Devi,1996;Dhuley,1998;DavisandKutan,
2002)。新的研究发现它还具抗癌作用和放射增敏作
用，即低剂量放疗便可增加癌细胞的死亡，从而减少
放疗副作用(Sharadetal.,1996)。此外，催眠睡茄含有
大量铁，可用于贫血症(DavisandKutan,1998)。随着
催眠睡茄的在保健及医药中的应用，市场前景非常
广阔。
目前，国内外对催眠睡茄的研究大多集中在其
二倍体药理应用方面，而在通过倍性育种提高其药
用成份方面的研究尚属空白。本研究结合组织培养
和多倍体诱导技术，一方面建立催眠睡茄离体快繁
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
体系，为其工厂化生产育苗提供理论支持；另一方
面，利用秋水仙素溶液离体诱导，摸索最适的诱导条
件，并获得四倍体突变类型，为今后催眠睡茄倍性育
种以及由此获得单株药用成份更高的多倍体新种质
等相关研究打下基础。
1材料与方法
1.1外植体的准备及培养条件的选择
供试材料为我校农业综合开发实验室从印度引
种的催眠睡茄(Withaniasomnifera(L.)Dunal)，选择
田间当年生、健壮枝条上带腋芽的茎段为外植体，常
规表面消毒，接种到MS培养基上。
以MS培养基为增殖培养基，植物生长调节剂
选择 6-BA (0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L)和 NAA
(0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L)，组合成9个浓度
梯度(表 1)，蔗糖为 3%，pH5.6~5.8，卡拉胶 0.6%；
1/2MS培养基为生根培养基，植物生长调节剂选择
IBA(0mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L)和 NAA(0mg/L、
0.1mg/L、0.2mg/L)，组合为 9个浓度梯度(表 2），
蔗糖为1.5%，pH5.6~5.8，卡拉胶0.6%。培养温度为
25℃±2℃，光照强度 1500~2000lx，光照时间
10~12h/d。
表1增殖培养基的植物生长调节剂浓度
Table1Concentrationofplantgrowthregulatorsformultiplication
激素
Concentration
6-BA(mg/L)
NAA(mg/L)
M1
0.1
0.02
M2
0.1
0.05
M3
0.1
0.1
M4
0.5
0.02
M5
0.5
0.05
M6
0.5
0.1
M7
1
0.02
M8
1
0.05
M9
1
0.1
编号
SerialNo.
表2生根培养基的植物生长调节剂浓度
Table2Concentrationofplantgrowthregulatorsforrooting
激素
Concentration
IBA(mg/L)
NAA(mg/L)
R1
0
0
R2
0
0.1
R3
0
0.2
R4
0.2
0
R5
0.2
0.1
R6
0.2
0.2
R7
0.5
0
R8
0.5
0.1
R9
0.5
0.2
编号
SerialNo.
1.2四倍体的诱导
利用秋水仙素溶液浸泡法对丛生芽进行处理，设
定0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%等6个处理浓
度。从刚长出来的1cm的生长健康旺盛的丛生芽上
取0.3~0.5cm的茎尖分别浸泡24h、48h和72h后，
用无菌水清洗3~5次，接种到增殖培养基上。待新生
的茎尖长至3~5cm，转入生根培养基中生根。
1.3四倍体与二倍体倍性鉴定及比较
染色体数目检测采用改良压片法进行染色体数
目检测(李懋学和陈瑞阳,1985)。
形态学特征比较主要是比较四倍体与二倍体之
间在植株形态、生长势、叶色、气孔特征、叶绿体数目
等方面的差异。随机统计在16倍物镜10个视野的
气孔数目及在40倍物镜下统计50对保卫细胞叶绿
体数目(张凌媛等,2005)，计算单位面积平均气孔数，
并进行方差分析。
2结果与分析
2.1植物生长调节剂对催眠睡茄增殖和生根的影响
以带腋芽的茎段作为外植体，培养20d左右就
可获得高1~2cm健壮的无菌苗，把它们切割下来分
别接种在培养基M1~9上。实验表明，M5增殖培养基
(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+3%sucrose)最
利于催眠睡茄丛生芽的分化和生长，芽的分化率最
高，可达90%以上，而且长势也最旺盛(图1a)。M1、M7
和M4号培养基上情况类似，愈伤生长不好，颜色多呈
淡黄色，少数为绿色，芽分化率相对较低，在这三种培
养基中，M4的分化率要比另外两个略高；M3培养基
中，愈伤较好，但分化率低；M6号培养基上愈伤较大，
多为绿色，也有较好的分化，分化率为83%不及M5的
高；M2、M8和M9号培养基上愈伤都比较好，但分化却
不太好，特别是M9，分化出许多畸形的簇状叶片，很
难长大形成独立的再生小植株。生根培养基的筛选结
果表明：在没加激素的1/2MS培养基上长出的根少且
细，很难移栽存活。在含有IBA的培养基上，一个星期
左右就能长出2~3条健壮的小根，一个月左右就能长
到4~6cm长，而且还有须根长出，移栽存活率可达
90%以上(图1b)。而加入了NAA的培养基，长出的根
虽也健壮，但通常都伴有愈伤，且容易从植株上脱落
下来，从而降低了存活率。因此最好的生根培养基为
R4号培养基(1/2MS+IBA0.2mg/L+1.5%sucrose)。
2.2不同浓度和处理时间对催眠睡茄四倍体诱导的
影响
采用了秋水仙素处理丛生芽的方法对催眠睡茄
进行了四倍体诱导(表3)。结果发现，催眠睡茄经秋
水仙素处理后，生长速度明显减慢。在0.1%~0.6%这
几个浓度中，用0.5%的秋水仙素溶液处理48h诱导
率最高，且得到了较多的纯合体，纯合体诱导率为
298
图1催眠睡茄组织培养
注:a:芽分化;b:生根
Figure1TissuecultureofWithaniasomnifera(L.)Dunal
Note:a:Shootproliferation;b:Rooting
13.79%。对未经秋水仙素处理得催眠睡茄中未发现
有四倍体植株，说明秋水仙素能有效诱导催眠睡茄
四倍体产生。从表3可以看出催眠睡茄用秋水仙素诱
导时常出现嵌合体现象，植株表现为混倍体(2×~4×)，
此时我们为了防止它回复突变，应尽快地进行切割
繁殖和筛选四倍体。继续多次进行检测，直到四倍体
植株逐渐趋于稳定，不再分化出二倍体植株。
2.3催眠睡茄四倍体的鉴定和形态学比较
催眠睡茄四倍体的染色体数目检测，采用了压片
表3秋水仙素的不同浓度和不同处理时间对诱导多倍体的影响
Table3Efectofcolchicineatdiferentconcentrationanddiferentlongtimeonpolyploidinduction
处理时间(h)
Duration of
treatment(h)
24
24
24
24
24
24
48
48
48
48
48
48
72
72
72
72
72
72
秋水仙素(%)
Concentrationof
colchicines(%)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
处理数(个)
Treatednumbers
30
30
28
27
30
30
30
29
30
30
29
28
30
30
27
30
30
28
存活率(%)
Liveratio(%)
100
100
100
100
96.67
86.67
100
100
100
93.33
82.76
64.29
100
96.67
81.48
73.33
50
32.14
四倍体株数(个)
Numberoftetraploid
plants
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4
1
0
0
0
0
1
0
混倍株数(个)
Numberofchimeras
0
0
0
1
1
2
0
0
1
2
6
3
1
3
2
2
3
1
诱导率(%)
Inducingratio(%)
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
13.79
3.57
0.00
0.00
0.00
0.00
3.33
0.00
法对二倍体和四倍体的再生植株进行染色体数目检
测。结果发现，催眠睡茄的四倍体染色体数为2n=4×=96
(图2a)，二倍体染色体数为2n=2×=48(图2b)。
植株、气孔特征及根比较，四倍体植株生长势
图2体细胞的中期染色体
注:a:四倍体;b:二倍体
Figure2Chromosomesoftetraploidanddiploid
Note:a:Tetraploid;b:Diploid
强，茎更加粗壮，节间变短，叶片增大，且明显变
厚，颜色变深，出现褶皱(图 3)。将二者的气孔密
度、保卫细胞长度、宽度及叶绿体数进行统计分
析，结果发现：在催眠睡茄的四倍体和二倍体的气
图3四倍体和二倍体植株比较
注:a:四倍体植株;b:二倍体植株
Figure3Comparisonofplantsbetweentetraploidanddiploid
Note:a:Tetraploid;b:Diploid
催眠睡茄的离体快繁及四倍体的诱导
RapidPropagationandTetraploidInductionofWithaniasomnifera
299
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
孔保卫细胞长度和气孔密度上存在明显的差异(图
4)，四倍体的气孔长度明显大于二倍体，长度为二
倍体的171.72%，保卫细胞中的叶绿体数目明显增
图4四倍体及二倍体气孔密度及叶绿体数目
注:a:四倍体气孔密度;b:二倍体气孔密度;c:四倍体叶绿体;d:二倍体叶绿体
Figure4Densityofstomaandchloroplastsoftetraploidanddiploid
Note:a:Densityofstomaoftetraploid;b:Densityofstomaofdiploid;c:Chloroplastsoftetraploid;d:Chloroplastsofdiploid
表4四倍体和二倍体气孔差异显著性比较
Table4Comparisonofsignificanceofdiferenceofstomatabetweentetraploidanddiploid
倍性
Ploidy
四倍体
Tetraploid
二倍体
Diploid
保卫细胞长度(μm)
Lengthofguardcel(μm)
62.25±3.82Aa
36.25±2.20Bb
保卫细胞宽度(μm)
Widthofguardcel(μm)
26±1.41Aa
15.75±1.58Bb
气孔密度(个/mm2)
Densityofstoma
52.28±3.10Aa
93.65±4.82Bb
叶绿体(个)
Chloroplasts
44.6±1.96Aa
23.7±1.49Bb
注:表中数据为平均值±标准差;数字后的大、小写字母表示显著水平为0.01和0.05
Note:Thedataismeans±SD;Thecapitalleterandlowercaseafterthenumbersmeanthesignificantlevelis0.01and0.05
多，为二倍体的188.87%，气孔密度下降，为二倍体
的55.83%。经方差分析，各项指标均达显著水平
(表4)。
3讨论
3.1催眠睡茄离体快繁研究
增殖系数和增殖周期一直是人们关心的问题，
只有增殖速度快，在生产实践中才有应用价值。本试
验表明：通过合适的细胞分裂素和生长素的浓度组
合，催眠睡茄组培可以取得理想的增殖效果。如组培
苗用于扩繁，两星期转接一次，而用于生根则一个月
转接一次，因为在两个星期时，丛生芽的增长率达到
了最大值，而在一个月左右时，丛生芽大部分都长到
了2~3cm，此时用去生根正好。
3.2催眠睡茄四倍体的诱导、鉴定及其形态学比较
组织培养和秋水仙素诱导技术相结合培养植物
多倍体在短期内可以达到改良植物品种和丰富种质
资源的目的(谭德冠等,2005)。本试验采取了此种方法
虽然获得催眠睡茄的纯合多倍体，但在此过程中也出
现了嵌合体现象，如果对嵌合体没有及时的分离，很
容易发生回复突变，在以后的试验中，希望能找到一
种比秋水仙素诱导催眠睡茄效果更好的诱导剂。
300
植物多倍体的鉴定方法从原理上是依据其外在
和内在的特征特性衍生而来的。在本文中，一般而
言，可以形态外形观察为基础，组织化学、叶绿体计
数为辅助，细胞学观察染色体数来确定(王丽艳和梁
国鲁,2004)。在本文中，不仅用改良压片法观察催眠
睡茄染色体加倍，而且对其叶片下表皮进行观察，发
现保卫细胞大小，单个保卫细胞中叶绿体数量和气
孔密度等都有了明显的变化，从而从形态学对催眠
睡茄倍性变异作了鉴定，为以后催眠睡茄的倍性鉴
定，找到了简易的、可靠的形态学辅助参数。
3.3催眠睡茄四倍体的应用前景
多倍体在植物中广泛存在，由于其具有一些独
特的性质，历来受到广大育种工作者的重视。由于同
源多倍体更易直接与经济效益相关，因此多倍体育
种研究主要集中在同源多倍体尤其是同源四倍体上
(邓云等,2006)。同源多倍体构成基因多次重复基础
上的可靠遗传系统，提高了基因功能的保险性，显著
降低了突变和隐性基因纯合表现的可能性，在严酷
的自然条件下为生存竞争提供了稳定的系统空间
(SoltisandSoltis,2000)，增强了其抗逆境的能力。多
倍体由于基因倍增、基因组冲击而引起基因表达变
化，因此不仅会使原有的次生代谢产物含量提高，还
可能会产生新的次生代谢产物(SoltisandSoltis,1999;
DhawanandLavania,1996)。对于药用植物，这一点有
非常重要的影响。目前人们利用这一点，成功地运用
到了药用植物上，已得到几十种优品质的多倍体药
用植物(乔传卓和崔熙,1981)，如丹参、当归、杜仲、福
录考等。催眠睡茄作为一种多用途的药用植物，开展
多倍体育种，是培育含更高药效成分和更强抗性的
催眠睡茄新品种的一条非常重要的途径。本研究建
立了催眠睡茄离体快繁体系并结合秋水仙素诱导技
术得到了催眠睡茄的四倍体植株，丰富了种质资源，
为我国优质催眠睡茄的保存和推广提供了条件。由
于同源多倍体对种间、属间远缘杂交的可交配性有
一定的促进作用，本研究由体细胞人工加倍所得的
同源四倍体，还可用作远缘杂交的桥梁。
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催眠睡茄的离体快繁及四倍体的诱导
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