全 文 ：无 根中蛇葡萄素的提取及其对黑色素瘤的抑制作用
刘德育　丘明祺①　梁婷韵
(中山医科大学化学教研室;广州 , 510089)
摘　要　目的:从民间传统中草药无 根中用具有较高产率而又简便实用的方法提取其主要有效成分蛇葡萄素 , 通过对
小鼠 B16黑色素瘤的抑制来考察其抗肿瘤药效。方法:采用经改进的甲醇提取 、水重结晶的方法进行提取分离;急性毒性实
验采用对小鼠一次腹腔注射测定药物的 LD50;以 MTT 法测定药物对肿瘤细胞的抑制作用。 结果:蛇葡萄素的提取率为
10.3%;对昆明小鼠一次腹腔注射 LD50为 1 025 mg/kg;对 C57 小鼠 B16黑色素瘤细胞的 IC50为 9.8×10-5 mol/ L。结论:与氮烯
咪胺比较 ,蛇葡萄素可能是一种高效低毒的新的细胞毒型抗肿瘤植物药。
主题词　蛇葡萄素/治疗应用;黑色素瘤 ,实验性/药物疗法;抗肿瘤药 ,植物;中草药 , 提取;药物筛选试验 , 抗肿瘤;蛇葡
萄素/分离和提纯
中图号　R 979.1
Extraction and Isolation of Ampelopsin from Ampelopsis Cantoniensis
Planch and Its Inhibitory Effect on B16 Melanoma
Liu Deyu　Qiu Mingqi　Liang Tingyun
(Department of Chemistry , Sun Yat-sen University of Medical Sciences , Guangzhou , 510089)
Abstract　Objective:Using the simple and feasible method , the ampelopsin is extracted and isolated from a tradi-
tional Chinese herbal drug , Ampelopsis cantoniensis Planch.The inhibitory effect of ampelopsin on mouse B16melanoma
cells was studied in order to inspect the antitumor activity.Methods:Methyl alcohol extraction and water recrystallization
was adopted to get ampelopsin.Acute toxicity of the ampelopsin by a single ip(intraperitoneal)injection in KM mouse
was evaluated.The inhibitory effect of the drug on tumor cells was evaluated by MTT in vitro drug sensitivity assay .Re-
sults:The yield for the ampelopsin was 10.3%.The LD50 for the natural product was 1 025 mg/kg by ip single adminis-
tration in KM mouse.The IC50 value of ampelopsin for the C57 mouse B16 melanoma cells was 9.8×10-5mol/L.Con-
clusion:Contrasting the dacarbazine(DTIC), ampelopsin probably is a potent new antitumor natural drug with high anti-
tumor effect and low toxicity.
Subject headings　ampelopsin/therapeutic use;melanoma , experimental/drug therapy;antineoplastic agents ,
phytogenic;Chinese herbal drugs , plant extracts;drug screening assays , antitumor;ampelopsin/isolation &purification
　　无 根为葡萄科蛇葡萄属植物粤蛇葡萄
[ Ampelopsis cantoniensis(Hook.et Arn.)Planch.]的
根或全株 ,主要盛产于我国华南一带 ,是民间传统
用药 ,功用消炎解毒 ,主治骨髓炎 、急性淋巴结炎 、
急性乳腺炎 、脓疱疹 、湿疹 、丹毒 、疖肿等[ 1] 。王玫
馨等[ 2]对其化学成分进行研究 ,首次从中分离得到
其主要成分黄酮类化合物蛇葡萄素及杨梅黄素。
赖力等人[ 3]对蛇葡萄素的提取工艺作了研究 。国
外仅有见越南学者[ 4]从 1993年开始对粤蛇葡萄中
的蛇葡萄素进行结构鉴别 、含量测定以及抗氧化作
用的研究。还未见有其它药理作用研究的报道。
最近日本的 Hase Koji等人[ 5]发现在 Hovenia dulcis
Thunb.中 ,对由 CCl4或半乳糖胺/脂多糖诱导的实
验肝损害起保护作用的有效成分为蛇葡萄素 。本
127中山医科大学学报(Acad J SUMS), 1999 , 20(2):127～ 129
① 广东药学院药学班 98届毕业生
DOI :10.13471/j.cnki.j.sun.yat -sen.univ(med.sci).1999.0038
文作者[ 6]首次发现其中的蛇葡萄素及杨梅黄素都
是很强的酪氨酸酶抑制剂。在此基础上本文进行
了蛇葡萄素抗小鼠 B16黑色素瘤的体外实验 ,并做
了急性毒性试验 ,发现蛇葡萄素对黑色素瘤的抑制
率与目前临床抗黑色素瘤的首选药氮烯咪胺相当 ,
而毒性却更低 。对蛇葡萄素的提取工艺也作了进
一步研究 ,获得了收率高而又简单 、经济的提取方
法。
1　材料和方法
1.1　材　料
粤蛇葡萄(干品)及其粗炮制品无 根 ,均由广
东省连州市白云山白茶有限公司提供;氮烯咪胺
(DTIC),南京制药厂 ,批号 971007;MTT[ 3-(4 ,5-双
甲基-2-唑噻)-2 ,5-二苯基溴化四氮唑蓝] , JANSSEN;
DG3022A酶联免疫检测仪;日立 U2000型双光束紫
外分光光度计;昆明小白鼠 ,18 ～ 22 g ,雌雄各半 ,中
山医科大学医学实验动物中心提供;C57/BL6小鼠
黑色素瘤 B16细胞株 ,中山医科大学医学实验动物
中心细胞库提供 。
1.2　蛇葡萄素的提取
参照文献方法[ 3]并作一些修改。称取原料药 ,
粉碎后 ,分别用适量甲醇回流提取 3 次 ,合并提取
液 ,滤过 ,回收甲醇后 ,加入适量水 ,用氯仿反复萃
取至氯仿层无色 ,上层液减压蒸馏除去残余甲醇
后 ,经静置 、析晶 、过滤 ,所得固体再用水和活性炭
反复重结晶去杂质 ,低温干燥后得淡黄色针状结
晶。
1.3　蛇葡萄素的鉴定
薄层层析:分别取杨梅黄素 、所得晶体及二者
的混合物溶于甲醇中 ,点样于含 5 g/L 羧甲基纤维
素二钠的硅胶H 薄层板 ,用氯仿-醋酸乙酯-甲酸(5
∶4∶0.5)展开 , 10 g/L FeCl3 显色后分别呈现紫色斑
点。紫外光谱:晶体配成浓度为 10 mg/L的甲醇溶
液 ,测定紫外吸收光谱。
1.4　急性毒性实验
称取所得晶体用 φ=50%二甲亚砜配制所需
的各种浓度。将小白鼠雌雄分开 ,随机分成 6 组
[不同药物浓度 5组及不含药物的 φ=50%二甲亚
砜空白对照1组] 。腹腔注射给药后饲养观察 7 d ,
最后统计各组死亡数 。
1.5　体外抗肿瘤实验
采用常用的抗肿瘤药物敏感筛选法 ———MTT
(四氮唑蓝)法[ 7] 。试验细胞浓度为 1.4×108/L ,药
物用无血清的 RPMI 1640 培养液稀释。每个实验
孔加入细胞悬液 100 μL 、药物 100μL ,37 ℃培养 72
h后 ,加入 MTT(5 g/L)10 μL , 4 h 后再加入二甲亚
砜150 μL , 于 570 nm 用酶标仪测定各孔吸光度。
每种实验孔采用 6个实验复孔。
2　结　果
2.1　蛇葡萄素的提取与鉴定
200 g无 根提取得到蛇葡萄素 20.6 g ,收率为
10.3%。将所得晶体经薄层层析 ,得到一个斑点 ,
其 Rf值为 0.29。紫外光谱数据为:λmax ,MaOH(logε)∶
290.5(4.27), 226.5(4.41)。这些结果与经聚酰胺
柱色谱分离所得的对照品相同 。
2.2　小鼠腹腔注射蛇葡萄素的 LD50
采用 Bliss法计算半数致死量(LD50)及其可信
限 ,经 3次叠代计算 ,得到 LD50为1 025 mg/kg ,95%
可信限为表913 ～ 1 174 mg/kg ,可信限率为12.73%
(表 1)。
表1　蛇葡萄素对昆明小鼠的急性毒性试验
　 　　Table 1　Acute toxicity assay of ampelopsin by a
single ip in KM mouse
Groups n D /(mg·kg-1) n d/1 r d/ %
Control 10 0 　　0　　 0
1 10 580 　0　　 0
2 10 750 1　　 10
3 10 1000 4　　 40
4 10 1320 9　　 90
5 10 1760 10　　100
　 n b:number of death;r d:death rate
2.3　蛇葡萄素的体外细胞毒抗肿瘤效果
5个成等差系列浓度的药物组 、2 个不同浓度
的DTIC阳性对照组 ,以及不含药物的阴性对照组 ,
测得各种实验复孔的吸光度平均值 A(n =6),由
此计算抑制率 r i(表 2)。
运用 SPSS PC/Windows V 6.0统计软件经回归
作曲线拟合 ,得一条三次曲线回归方程:c/(mmol·
L
-1)=7.41×10-2-6.01×10-3· I +1.09×-4· I 2+
4.5×10-7· I 3, R =0.9999。计算并获蛇葡萄素的
128 中山医科大学学报(Acad J SUMS), 1999 , 20(2)
半数抑制浓度。
表 2　蛇葡萄素对 C57 小鼠 B16 黑色素瘤的体外抑制作用
　Table 2　In vitro inhibitory effect of ampelopsin on C57 mouse
B16 melanoma cell 　(n =6)
Group c/(mol·L)-1 A /1 r i/ %
1 5×10-4 0.162±0.004 79.8
2 1×10-4 0.398±0.031 50.2
3 2×10-5 0.510±0.034 36.2
4 4×10-6 0.555±0.040 30.6
5 8×10-7 0.578±0.050 27.8
DTIC 1×10-4 0.680±0.040 15.0
4×10-4 0.282±0.015 64.7
Control 0 0.800±0.061
3　讨　论
3.1　蛇葡萄素的提取
无 根中蛇葡萄素的含量与药物采集的季节
以及炮制的方法有很大关系。粤北地区人民通常
在端午节前后于清晨露水蒸发前采摘粤蛇葡萄 ,并
作简单炮制 ,其中蛇葡萄素含量很高 ,本文取得了
10.3%的提取率。但若直接采用未炮制的原植物 ,
则提取率很低。
采用水提取乙醇沉淀色谱柱分离的方法所得
提取率仅有约 2%[ 2] ,而且步骤繁杂 。本文采用甲
醇提取氯仿萃取活性碳吸附 ,再用水重结晶方法 ,
不但提取率高很多 ,而且方法简便 ,所得单体的药
用纯度高 ,适合大量生产 。
用水重结晶得到的产物含 52 结晶水 ,为浅黄色
针状结晶 ,分子式以 C15H12O8· 52 H2O 表示 ,相对分
子质量为 365.3[ 8] 。
蛇葡萄属植物全世界共有 20多种 ,我国发现
有15种。在这些植物中也曾报道有几种含有蛇葡
萄素 ,但含量都很低 。陈缵光测定了无 根中蛇葡
萄素的含量 ,达 25.2%之高[ 9] 。周天达等人从显齿
蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata )中用甲醇重结晶
提得蛇葡萄素 ,测得小鼠的腹腔注射 LD50为 1.41
g/kg[ 10] ,略高于本文测得的 LD50数值 ,这可能是采
用不同溶剂进行重结晶造成的晶体结构的差异。
3.2　蛇葡萄素对 B16黑色素瘤的抑制作用
本文所采用的阳性对照药为目前被认为对黑
色素瘤单一给药效果最好的化疗药氮烯咪胺
(DTIC),其对小鼠的单剂量腹腔给药的 LD50为 859
mg/kg[ 11] ,本文测得其在 4×10-4 mol/L 的浓度下
对B16黑色素瘤的抑瘤率为 64.7%。而所提取的
蛇葡萄素在 5×10-4 mol/L的浓度下对 B16黑色素
瘤的抑瘤率为 79.8%,对小鼠的单剂量腹腔给药的
LD50为 1 025 mg/kg 。初步显示蛇葡萄素对 B16黑
色素瘤的抑制效果比 DTIC好 ,但毒性更低 。经采
用C57小鼠进行体内移植 B16黑色素瘤的抑瘤预
实验 ,发现肿块明显萎缩 ,其结果及抗癌机理将另
行发表。由于无 根中的蛇葡萄素含量很高 ,实验
显示出有较低的毒性及较高的抗肿瘤活性 ,因此具
有很高的开发价值。
(中山医科大学实验动物中心黄冰和黄文革老师协助
作了肿瘤细胞抑制实验和小鼠急性毒性实验 , 谨致谢意)
参 考 文 献
1　江苏新医学院.中药大辞典:上册.上海:上海科学技术
出版社 , 1986.342
2　王玫馨 ,刘文粢 , 黄爱东 , 等.无 根黄酮类成分的分
离和鉴定.中药材 , 1989 , 12(7):28
3　赖　力 , 张琳萍 ,周清凯 , 等.蛇葡萄素提取工艺研究.
天然产物研究与开发.1995 , 7(1):88
4　Phung T V , Pham T K , Nguyen T H.Antioxidant activity of
Ampelopsis cantoniensis Planch.Tap Chi Duoc Hoc , 1995
(1):14
5　Hase K , Ohsugi M , Xiong Q , et al .Hepatoprotective effect
of Hovenia dulcis Thunb.on experimental liver injuries in-
duced by carbon tetrachloride of d-galactosamine/
lipopolysaccharide.Biol Pharm Bull , 1997 , 20(4):381
6　刘德育 ,雷焕强.杨梅黄素及蛇葡萄素对酪氨酸酶的
抑制作用.生物化学杂志 , 1996 , 12(5):618
7　韩　锐 , 主编.抗癌药物研究与实验技术.北京:北京
医科大学 、中国协和医科大学联合出版社 , 1997.284～
286
8　Budavari S.TheMerck Index.12 ed.Whitehouse Station , N
J:Merck &Co Inc.1996.97
9　陈缵光 ,王玫馨 , 蔡沛祥 , 等.无 根中蛇葡萄素和杨
梅素的含量测定.中药材 , 1997 , 20(1):21
10　周天达 ,周雪仙.藤茶中双氢黄酮醇的分离 、结构鉴定
及其药理活性.中国药学杂志 , 1996 , 31(8):458
11　Venditti J M.Antitumor activity of DTIC(NSC-45388)in an-
imals.Cancer Treat Rep , 1976 , 60(2):135
(1998- 07- 01 收稿　1999- 01- 20 修回)
129第 2期　刘德育 ,等.无 根中蛇葡萄素的提取及其对黑色素瘤的抑制作用