全 文 ：2013 年 2 月 Vol． 31 No． 2
February 2013 Chinese Journal of Chromatography 122 ～ 126
研究论文 DOI: 10． 3724 /SP． J． 1123． 2012． 09047
* 通讯联系人． Tel:(021)64252145，E-mail:weibingzhang@ ecust． edu． cn．
基金项目:国家青年科学基金项目(21105027)．
收稿日期:2012-10-08
超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定葡萄中
单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯
张凌怡， 王智聪， 张维冰*
(华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237)
摘要:建立了超高效液相色谱-串联四极杆质谱测定葡萄汁、皮和籽中羟基桂皮酒石酰酯类化合物含量的方法。采
用的色谱柱为 Waters UPLC HSS T3 (150 mm × 2. 1 mm，1. 7 μm) ，流动相为含 0. 1%甲酸的水-乙腈体系，梯度洗
脱，流速 0. 3 mL /min，柱温 35 ℃;质谱采用电喷雾离子源、负离子多反应检测模式。对单香豆酰酒石酸酯和单阿魏
酰酒石酸酯，其含量以单咖啡酰酒石酸酯当量表示。结果表明，单咖啡酰酒石酸酯在 25 ～ 2 000 μg /L 范围内线性
关系良好(r2 = 0. 998 9) ;检出限为 0. 25 μg /L，定量限为 25 μg /L;在 250、750、1 200 μg /L添加水平下单咖啡酰酒石
酸酯的平均回收率为 97. 7% ～ 99. 5%，相对标准偏差小于 2. 5%。实验结果表明，葡萄汁、皮和籽中羟基桂皮酒石酰
酯类化合物的含量差异显著。该方法简单快速、灵敏度高、回收率高、准确性好，可用于葡萄产品中单咖啡酰酒石
酸酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯的分析。
关键词:超高效液相色谱-串联质谱;羟基桂皮酒石酰酯;单咖啡酰酒石酸酯;单香豆酰酒石酸酯;单阿魏酰酒石酸
酯;葡萄汁;葡萄皮;葡萄籽
中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2013)02-0122-05
Determination of caftaric acid，p-coutaric acid and fertaric
acid in grape juice，peel and seeds by ultra-high
performance liquid chromatography-tandem
quadrupole mass spectrometry
ZHANG Lingyi，WANG Zhicong，ZHANG Weibing*
(School of Chemistry and Molecular Engineering，East China University of Science
and Technology，Shanghai 200237，China)
Abstract:An ultra-high performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (UP-
LC-MS /MS)method was developed for the determination of hydroxycinnamoyltartaric esters，such as caf-
taric acid，p-coutaric acid and fertaric acid in grape juice，peel and seed． The target analytes were sepa-
rated on a Waters UPLC HSS T3 column (150 mm ×2. 1 mm，1. 7 μm)at 35 ℃ with gradient elution at
a flow rate of 0. 3 mL /min． The grape juice was freeze-centrifuged，the supernatant was diluted with
20% methanol． The grape peel and grape seed samples were extracted with 80% ethanol． The extract
was cleaned-up on-line with the analytical column by valve switching technology． The mobile phases were
water-acetonitrile (both containing 0. 1% formic acid)． The identification and quantification were a-
chieved by MS /MS in multiple reaction monitoring (MRM)mode via negative electrospray ionization． As
lack of commercial standards，p-coutaric acid and fertaric acid were quantified by caftaric acid equiva-
lent． The developed method showed a good linearity over the range of 25 － 2 000 μg /L with good correla-
tion coefficient (r2 = 0. 998 9)． The limit of detection was 0. 25 μg /L，and the limit of quantification was
25 μg /L． The average recoveries of caftaric acid were between 97. 7% －99. 5% and the precisions were
within 2. 5% at the spiked levels of 250，750 and 1 200 μg /L． The working solutions were stable for 74
h at room temperature． The results showed that there are significant differences of hydroxycinnamoyltartar-
第 2 期
张凌怡，等:超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定葡萄中
单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯
ic esters distribution in grape juice，peel and seeds． Therefore，this method，owing to its simplicity，rapid-
ity，good recovery，high sensitivity and accuracy，can be used for the analysis of caftaric acid，p-coutaric
acid and fertaric acid in grape juice，peel and seeds．
Key words:ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS /MS) ;
hydroxycinnamoyltartaric esters;caftaric acid;p-coutaric acid;fertaric acid;grape juice;grape peel;
grape seed
葡萄属葡萄科，为落叶藤本植物，果实药食兼
用。近几年，众多学者的研究证实葡萄具有抗毒杀
菌、抗氧化减缓衰老、防癌、抗癌、抗贫血、降低胃酸、
利胆、抗动脉粥样硬化、补益和兴奋大脑神经、利尿
消肿等功效［1 － 4］。葡萄多酚是葡萄中天然植物多酚
类活性物质，是葡萄中存在的所有酚类物质的总称。
羟基桂皮酒石酰酯(hydroxycinnamoyltartaric esters)
是葡萄产品中主要的一类酚酸类多酚物质，其含量
占白葡萄汁总多酚含量的 80%［5］。含量较高的主
要有单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿
魏酰酒石酸酯，其结构如图 1 所示。
图 1 羟基桂皮酒石酰酯类化合物的结构式
Fig． 1 Structures of hydroxycinnamoyltartaric esters
总多酚的分析通常采用光谱法，如 Folin-Ciocal-
teu法，但光谱法干扰较大，对多酚的准确定量有一
定的误差。色谱法可以进一步分离确定多酚成分，
广泛用于植物多酚类化合物的分离分析［6 － 8］。由于
缺乏羟基桂皮酒石酰酯类化合物的标准品，目前市
售的只有单咖啡酰酒石酸酯标准品;而对单香豆酰
酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯，在实际样品分析中
通常采用自制的标准品进行定量［9，10］，或采用结构
类似的化合物如羟基桂皮酒石酰酯对应的羟基桂皮
酸即咖啡酸、香豆酸和阿魏酸进行定量［11 － 14］，并结
合质谱进行结构确认［15 － 17］。
葡萄及葡萄衍生产品如葡萄汁、葡萄干、葡萄酒
等是国内很受欢迎的食物，羟基桂皮酒石酰酯类化
合物是葡萄多酚中重要的酚类物质，也是葡萄产品
中的特征化学成分，其组成及含量的测定对葡萄品
质的鉴定、葡萄衍生产品的质量控制、葡萄加工副产
物的有效利用等具有非常重要的意义。但国内还未
见有羟基桂皮酒石酰酯类化合物如单咖啡酰酒石酸
酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯分析的
报道。另外，如前所述，由于缺乏羟基桂皮酒石酰酯
类化合物的标准品，通常采用自制或羟基桂皮酒石
酰酯对应的羟基桂皮酸进行定量，分析中大多采用
紫外检测方法，杂质干扰较多，灵敏度也较低，对某
些含量较低组分的定性、定量造成一定的影响。本
文采用超高效液相色谱-串联四极杆质谱方法(UP-
LC-MS /MS)检测，灵敏度高;对单香豆酰酒石酸酯
和单阿魏酰酒石酸酯，采用结构相似的单咖啡酰酒
石酸酯进行定量，结果准确、可靠。对红葡萄的葡萄
汁、葡萄皮和葡萄籽进行了分析，测定其中单咖啡酰
酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯
的含量并探讨其分布特征。
1 实验部分
1． 1 仪器、试剂与材料
ACQUITY超高效液相色谱系统，配 TQD 三重
四极杆质谱检测器(美国 Waters 公司) ;5810R 型
高速冷冻离心机(Eppendorf 公司) ;Milli-Q 超纯水
器(美国 Millipore 公司) ;KQ-100DE 型数控超声波
清洗器(昆山超声仪器有限公司) ;0. 22 μm PTFE
针式过滤器(上海安谱科学仪器有限公司)。
甲醇、乙醇、乙腈和甲酸均为色谱纯，购自德国
Merck 公司;其余试剂均为分析纯;实验用水为
Milli-Q制备的超纯水;红葡萄样品购自当地超市。
1． 2 实验条件
1． 2． 1 标准溶液的配制
准确称取适量的单咖啡酰酒石酸酯固体标准
品，加入适量的甲醇超声溶解，配制质量浓度为
1. 00 g /L的母液。用 20%甲醇稀释，分别配制质量
浓度为 25、50、75、100、250、500、1 000、2 000 μg /L
的标准工作溶液。再配制质量浓度分别为 200、
800、1 500 μg /L的质量控制溶液。
1． 2． 2 试样的制备
取新鲜、表面光滑无污点的葡萄粒。小心挤出
葡萄汁，于 4 000 r /min 速率下冷冻离心 10 min，取
上清液，用 20%甲醇适当稀释，经 PTFE针式过滤器
·321·
色 谱 第 31 卷
过滤后供 UPLC-MS /MS 分析。对去除果肉的葡萄
皮及葡萄籽用超纯水洗涤数次，晒干，粉碎，过 20 目
筛。精确称取筛下物 2 g于 50 mL带盖聚四氟乙烯
离心管中，加入 20 mL 80%乙醇，漩涡混合，浸泡 10
min后超声萃取 10 min，以 4 000 r /min 速率冷冻离
心 10 min，收集上清液;残渣再用 10 mL 80%乙醇重
复提取一次;合并上清液，用 20%甲醇适当稀释，经
PTFE针式过滤器过滤后供 UPLC-MS /MS分析。
1． 2． 3 UPLC条件
色谱柱:ACQUITY UPLC HSS T3 柱(150 mm ×
2. 1 mm，1. 7 μm;美国 Waters 公司) ;柱温:35 ℃;
进样体积:2 μL;流动相 A:水(含 0. 1% (v /v)甲
酸) ;流动相 B:乙腈(含 0. 1%(v /v)甲酸) ;流速:
0. 3 mL /min。梯度程序:0 ～ 1 min，3% B ～ 10% B;
1 ～ 6 min，10% B ～ 30% B;6 ～ 6. 1 min，30% B ～
95% B;6. 1 ～ 8 min，95% B;8 ～ 8. 1 min，95% B ～
3%B;8. 1 ～ 10 min，3%B。
1． 2． 4 MS /MS条件
采用电喷雾离子源，负离子多反应检测(MRM)
模式。毛细管电压 － 3. 0 kV，离子源温度 150 ℃，脱
溶剂气(氮气)温度 350 ℃，脱溶剂气流速 800 L /h，
碰撞气流速 50 L /h，0 ～ 2. 5 min阀切换到废液。单
咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒
石酸酯的检测离子、锥孔电压(cone voltage)和碰撞
能量(collision energy)见表 1。
表 1 单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿魏
酰酒石酸酯的 UPLC-MS /MS分析参数
Table 1 UPLC-MS /MS parameters of caftaric acid，
p-coutaric acid and fertaric acid
Compound
MRM
channel
(m/z)
Dwell
time /s
Cone
voltage /
V
Collision
energy /
V
Caftaric acid 311． 01 ＞ 179． 0 0． 1 － 20 13
p-Coutaric acid 296． 05 ＞ 163． 0 0． 1 － 25 15
Fertaric acid 325． 06 ＞ 193． 0 0． 1 － 25 15
2 结果与讨论
2． 1 UPLC-MS /MS条件的优化
葡萄汁及葡萄皮、葡萄籽的提取物中含有糖及
无机盐等，质谱检测中应该尽量避免这些糖分及无
机盐直接进入质谱仪而污染离子源及影响电离，因
此在进入质谱前需要去除这些组分。在样品前处理
中采用固相萃取的方法可以得到比较干净的洗脱
物，但固相萃取大多需要离线操作，而且需要活化、
上样、洗脱等多个步骤。本文利用类似的原理，将色
谱分析柱当作固相萃取柱，采用阀切换的方法将这
些干扰组分切换到废液中。实验中在 0. 3 mL /min
的流速下系统死时间约为 2 min，样品中糖及无机盐
等不保留组分在此时间流出，待测化合物中最先流
出的单咖啡酰酒石酸酯的保留时间为 3. 17 min，实
验中将色谱流出物前 2. 5 min 的组分切换到废液
中，而把 2. 5 min以后的色谱流出物导入质谱，同时
在梯度洗脱设置中将 1 min 时的有机相比例提高到
10%，不仅可以去除糖分和无机盐，还可以去除一些
极性较大、色谱保留较小的干扰组分，从而提高质谱
灵敏度。
图 2 单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯质谱参数的优化
Fig． 2 MS /MS parameter optimization of p-coutaric
acid and fertaric acid
对单咖啡酰酒石酸酯，采用调谐的方法确定最
佳的锥孔电压和碰撞能量。而单香豆酰酒石酸酯和
单阿魏酰酒石酸酯，由于无法得到标准品，不能采用
调谐的方法对其质谱参数进行优化，本文采用 MRM
模式，分别逐步改变锥孔电压和碰撞能量，观察质谱
响应信号，从而确定最优的质谱参数。如图 2 所示，
加大锥孔电压，有利于化合物电离，而太大的锥孔电
压又会使母离子碎裂;同理，增大碰撞能量，有利于
子离子的电离，但碰撞能量太大，又会进一步使子离
子碎裂。由于单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸
酯和单阿魏酰酒石酸酯的结构相似，子离子均为丢
失酒石酸部分的碎片离子，因而最佳的锥孔电压和
碰撞能量均相似，如锥孔电压在 － 20 ～ － 25 V，碰撞
能量为 15 V左右。
2． 2 方法学验证
·421·
第 2 期
张凌怡，等:超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定葡萄中
单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯
2． 2． 1 线性关系、检出限和定量限
在优化的实验条件下，对质量浓度为 25、50、
75、100、250、500、1 000、2 000 μg /L 的标准工作溶
液进行测定，以质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)
为纵坐标进行曲线回归，在 25 ～ 2 000 μg /L 范围
内，单咖啡酰酒石酸酯呈良好的线性关系，线性方程
为 y = 3. 381 44 x － 7. 739 87，线性相关系数 r2 =
0. 998 895。根据 3 倍信噪比(S /N = 3)确定检出限
为 0. 25 μg /L。以标准曲线的最低点为定量限，其
值为 25 μg /L。
2． 2． 2 基质加标回收率的考察
取 1. 2. 2 节制备的葡萄汁样品，用 20%甲醇适
当稀释，分别添加 0、250、750、1 200 μg /L 的单咖啡
酰酒石酸酯标准溶液，每个浓度水平重复测定 3 次，
得到的平均加标回收率为 97. 7% ～ 99. 5%，相对标
准偏差(RSD)小于 2. 5%，如表 2 所示。
表 2 单咖啡酰酒石酸酯的基质加标回收率(n =3)
Table 2 Recovery of caftaric acid spiked in
matrix sample (n =3)
Background /
(μg /L)
Spiked /
(μg /L)
Found /
(μg /L)
Recovery /
%
RSD /
%
238． 9 250 483． 2 97． 7 2． 2
238． 9 750 978． 0 98． 6 0． 5
238． 9 1200 1432． 4 99． 5 1． 4
2． 2． 3 标准溶液的稳定性
对室温放置 74 h 的质量浓度分别为 200、800、
1 500 μg /L的质量控制溶液进行测定，每个浓度水
平重复测定 3 次，并与新鲜配制的相同浓度的质量
控制溶液进行比较，低、中、高 3 个浓度水平的标准
溶液的平均偏差小于 5%;各浓度水平 3 次重复测定
的 RSD小于 2. 1%，表明单咖啡酰酒石酸酯的标准
溶液在室温下放置 74 h稳定。
2． 3 实际样品的分析
对 1. 2. 2 节制备的葡萄汁、葡萄皮及葡萄籽样
品进行测定，每个样品重复测定 3 次，结果用平均值
±标准偏差(SD)表示，结果如表 3 所示。葡萄汁、
葡萄皮和葡萄籽样品的 MRM谱图见图 3。
由于无法得到单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒
石酸酯的标准品，在对其进行定量时，用单咖啡酰酒
石酸酯当量予以表示，计算公式如式(1)。式(1)
中，Cj 表示单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯
的浓度，C i 表示单咖啡酰酒石酸酯的浓度，Aj 表示
单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯的峰面积，
Mj 表示单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯的
摩尔质量，而 Ai、Mi 分别表示单咖啡酰酒石酸酯的
峰面积和摩尔质量。
Cj =
AjMjC i
AiMi
(1)
表 3 葡萄汁、葡萄皮和葡萄籽中单咖啡酰酒石酸酯、
单香豆酰酒石酸酯和单阿魏酰酒石酸酯的含量
(mean ± SD，n =3)
Table 3 Contents of caftaric acid，p-coutaric
acid and fertaric acid in grape juice，
peel and seed (mean ± SD，n =3) mg /kg
Sample Caftaric acid p-Coutaric acid Fertaric acid
Grape juice 12． 8 ± 0． 3 4． 9 ± 0． 1 1． 7 ± 0． 1
Grape peel 363 ± 16． 5 378． 1 ± 24． 2 69． 0 ± 7． 7
Grape seed 4． 5 ± 0． 1 15． 6 ± 1． 6 18． 9 ± 3． 8
图 3 (a)葡萄皮、(b)葡萄汁和(c)葡萄籽样品的 MRM谱图
Fig． 3 MRM chromatograms of (a)grape peel，
(b)grape juice and (c)grape seed
Peaks:1． caftaric acid;2． p-coutaric acid;3． fertaric acid．
从表 3 可以看出，葡萄皮中的单咖啡酰酒石酸
酯和单香豆酰酒石酸酯含量相当，而单阿魏酰酒石
酸酯的含量为其 1 /6 左右;葡萄籽中，含量最高的是
单阿魏酰酒石酸酯，含量最少的是单咖啡酰酒石酸
酯;而葡萄汁则相反，单咖啡酰酒石酸酯含量最高，
其次是单香豆酰酒石酸酯，含量最少的是单阿魏酰
酒石酸酯。Mullen 等［12］在测定红葡萄饮料中的多
酚类化合物时，单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸
酯和单阿魏酰酒石酸酯的含量也符合这样的规律。
另外，从葡萄皮、葡萄汁和葡萄籽的测定结果来看，
葡萄皮中的单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯
和单阿魏酰酒石酸酯含量均比葡萄汁和葡萄籽高，
总羟基桂皮酒石酰酯含量达到 810. 1 mg /kg，说明
葡萄皮中含有大量的多羟基酚类物质。同时，葡萄
皮中单香豆酰酒石酸酯的含量显著高于葡萄汁中的
含量，说明葡萄在生长、加工过程中，单香豆酰酒石
酸酯较难转移至葡萄汁中。Mozetic 等［15］在研究白
·521·
色 谱 第 31 卷
葡萄中的羟基桂皮酒石酰酯类化合物时，也发现葡
萄汁中的含量低于去籽葡萄产品。另外，葡萄籽中
也含有较高的羟基桂皮酒石酰酯类化合物，尤其是
单阿魏酰酒石酸酯，其含量占到总羟基桂皮酒石酰
酯含量的 41%。通过以上分析，可以看出葡萄汁、葡
萄皮以及葡萄籽中羟基桂皮酒石酰酯类化合物分布
差异显著，这对葡萄产物的综合利用有一定的指导
意义。
3 结论
本文建立了超高效液相色谱-串联四极杆质谱
检测葡萄汁、葡萄皮和葡萄籽中羟基桂皮酒石酰酯
化合物分析的方法。样品前处理中采用固相萃取的
原理，使用在线的方式通过阀切换利用色谱分析柱
去除干扰组分。对葡萄汁、葡萄皮和葡萄籽样品的
测定结果表明，羟基桂皮酒石酰酯化合物的含量差
异显著，并且单咖啡酰酒石酸酯、单香豆酰酒石酸酯
和单阿魏酰酒石酸酯的分布特征也不一样。所建立
的方法可用于葡萄产品的分析，对葡萄品质研究及
葡萄衍生产品的质量控制有重要的意义。
参考文献:
［1］ Williamson G，Carughi A． Nutr Res，2010，30:511
［2］ Boselli E，Minardi M，Giomo A，et al． Anal Chim Acta，2006，
563:93
［3］ Rózek A，Achaerandio I，Almajano M P，et al． J Agric Food
Chem，2007，55:5147
［4］ Felice F，Zambito Y，Colo G D，et al． Eur J Pharm Biopharm，
2012，80:176
［5］ Saura C B，Lacueva C A，Lamuela R R M． J Agric Food Chem，
1996，44:3040
［6］ Novakova L，Spacil Z，Seifrtova M，et al． Talanta，2010，80:
1970
［7］ Gruz J，Novak O，Strnad M． Food Chem，2008，111:789
［8］ Sakakibara H，Honda Y，Nakagawa S，et al． J Agric Food Chem，
2003，51:571
［9］ Souquet J M，Labarbe B，Guernevé C L，et al． J Agric Food
Chem，2000，48:1076
［10］ Vrhovsek U． J Agric Food Chem，1998，46:4203
［11］ Montealegre R R，Peces R R，Vozmediano J L C，et al． J Food
Comp Anal，2006，19:687
［12］ Mullen W，Marks S C，Crozier A． J Agric Food Chem，2007，
55:3148
［13］ Vanzela E S L，Silva R D，Gomes E，et al． J Agric Food Chem，
2011，59:13136
［14］ Vanzela E S L，Silva R D，Gomes E，et al． J Agric Food Chem，
2011，59:8314
［15］ Mozetic B，Tomazic I，Skvarc A，et al． Acta Chim Slov，2006，
53:58
［16］ Kammerer D，Claus A，Carle R，et al． J Agric Food Chem，
2004，52:4360
［17］ Stalmach A，Edwards C A，Wightman J D，et al． J Agric Food
Chem，2011，59:9512
·621·