全 文 ：茶 叶 科 学 2006，26（1）：11~16
Journal of Tea Science

收稿日期：2005-09-06 修订日期：2005-12-31
基金项目：国家自然科学基金（30070486）、浙江省重点科技项目（2004C22033）、“十五”国家科技攻关计划（2004-07）等
作者简介：赵丽萍(1979-- )，黑龙江肇东人，硕士，从事茶树分子生物学研究。*通讯作者: liangchen@mail.tricaas.com
茶树新梢不同叶片中 β-葡萄糖苷酶和 β-樱草糖苷酶
基因表达的实时定量 PCR分析
赵丽萍，陈亮*，王新超，姚明哲
(中国农业科学院茶叶研究所/农业部茶叶化学工程重点实验室茶树资源遗传改良与分子生物学实验室，浙江 杭州 310008)
摘要：在建立茶树基因表达绝对定量实时 PCR检测方法后，检测了龙井 43新梢不同部位叶片中的 β-葡萄糖苷酶
和 β-樱草糖苷酶基因的表达情况，结果表明 β-葡萄糖苷酶在一芽五叶新梢的第四叶中表达活性最高，为 2.86E+08
拷贝/µl，第四叶>第三叶>第五叶>第二叶>一芽一叶；而 β-樱草糖苷酶基因在一芽一叶中最高，为 4.31E+06拷贝
/µl，一芽一叶>第二叶>第三叶>第四叶>第五叶。与茶叶香气密切相关两个基因在茶树不同部位的叶片中表达量
和表达类型存在明显差异。本实验建立的实时荧光定量 PCR可有效地用于茶树基因表达的定量分析。
关键词：茶树；β-葡萄糖苷酶；β-樱草糖苷酶；实时定量 PCR
中图分类号：S571.1; Q523 文献标识码：A 文章编号：1000-369X（2006）01-011-06

Quantitative Detection of β-glucosidase and β-primeverosidase
Gene Expressions in Different Leaves of Tea Plant (Camellia
sinensis) by Real-Time PCR Analysis
ZHAO Li-ping, CHEN Liang*, WANG Xin-chao, YAO Ming-zhe
(Lab for Tea Germplasm, Genetic Improvement and Molecular Biology, Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences;
Key Laboratory of Tea Chemical Engineering, the Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China)
Abstract: β-glucosidase and β-primeverosidase are considered the most important genes related to made tea aroma.
An absolute quantification method for gene expression in tea plant using real-time PCR analysis was established and,
the expression of β-glucosidase and β-primeverosidase genes in different leaves of Longjing 43 young shoot were
determined using this method. The results indicate that the fourth leaf of the ‘five and a bud’ shoot has the highest
copy number of β-glucosidase mRNA, which is 2.86E+08 copies/µl, the 4th leaf>the 3rd leaf>the 5th leaf>the 2nd
leaf>one and a bud. And the highest β-primeverosidase expression is in the one and a bud, corresponding to
4.31E+06 copies/µl, one and a bud>the 2nd leaf>the 3rd>the 4th leaf> the 5th leaf. The expression intensity and pattern
of these genes, which are closely related to tea aroma, are different in the young shoot. The results illuminate that the
new developed method could be effectively used to detect gene expression quantitatively in tea plant.
Key words: tea plant, β-glucosidase, β-primeverosidase, real-time PCR


茶叶香气是衡量茶叶品质的重要指标之
一，目前茶叶中发现的香气物质有 600多种。
已有研究表明，β-葡萄糖苷酶和 β-樱草糖苷酶
是茶叶中香气释放过程中重要的酶类，它们分
DOI:10.13305/j.cnki.jts.2006.01.002
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解茶叶中的香气前体物质从而释放出醇系香
气 [1,2]。对这些与茶叶香气密切相关重要酶类
的研究，已从分离纯化 [1,2]、在加工过程中的
变化 [2,3]及不同种质资源之间的差异 [4]等生理
生化水平逐步向分子水平发展[5~7]。不过，对
这些基因表达的时空特性研究仍是空白。
荧光定量 PCR 是近年来在 PCR 定性技术
基础上新发展的基因定量技术，它克服了原有
PCR技术存在的不足，是一种通过对荧光信号
的实时检测，快速、灵敏地对核酸进行定量检
测的方法[8~10]，在转基因产品检测以及医学研
究中已经得到了广泛应用[11~13]。本实验通过建
立茶树定量 PCR技术，对两种重要香气相关酶
类基因在茶树新梢各部位的表达进行定量分
析，以在分子水平上揭示它们的表达规律。
1 材料和方法
1.1 材料
春季龙井 43 第一轮一芽五叶新梢上的一
芽一叶、第二叶、第三叶、第四叶和第五叶，
分别采自中国农业科学院茶叶研究所内国家
种质杭州茶树圃，样品采集后立即置于－80℃
冰箱中保存直到总 RNA提取。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA的提取
各部位叶片 100 mg，迅速加液氮冷冻研
磨 成 细 粉 末 状 ， 加 入 2 ml Trizol 试 剂
（GibcoBRL公司）进行提取总 RNA，最后用
20 µl经 DEPC处理过的 ddH2O溶解沉淀，测
定 RNA浓度及 A260与 A280值。
1.2.2 反转录合成 cDNA第一链
取各样本 RNA 2 µg按 First-Strand cDNA
Synthesis Kit 试剂盒 (上海生工公司 )操作方
法：在一个 DEPC 处理过的离心管中加入总
RNA2 µg，primer dT(0.5 µg/µl)1 µl，加 DEPC
处理的灭菌水补至 12 µl，混合后 70℃反应
5 min，取出放于冰上，然后加入 5×buffer 4 µl，
Ribonuclease inhibitor 1 µl，10mmol/L dNTP
mix 2 µl，混匀后 37℃反应 5 min 后加入
MMLV Reverse Transcriptase(200 U/µl) 1 µl，
42℃反应 1 h，取出放于 70℃反应 10 min。获
得 cDNA，产物直接用于 PCR或放-20℃保存。
1.2.3 β-葡萄糖苷酶和 β-樱草糖苷酶基因的克隆
β-葡萄糖苷酶基因的克隆为本实验室通
过 EST测序计划获得，长度 460 bp[7]。β-樱草
糖苷酶基因根据 NCBI 上已经公布的茶树 β-
樱草糖苷酶基因的序列信息（GenBank登录号
为 AB088027）[14]，用 Primer Premier 5软件
设计引物，序列为 TBP1-F 5’-AAA TCT CCT
CCT TCA ACA-3’；TBP1-R 5’-TAC CAA CGA
GTC TAC GC-3’，用此引物从龙井 43一芽二
叶的 cDNA 中扩增出长 870 bp 的 β-樱草糖苷
酶片段，并克隆到大肠杆菌中，克隆产物进行
测序验证。
1.2.4 荧光定量 PCR
标准品质粒的制备：两个基因的克隆提取
质粒 DNA后使用紫外分光光度计定量，定量
得到的数据单位为 ng/µl，根据计算公式（浓
度×6.02×1023）/（分子质量×109）将其转换为
拷贝数。而后进行梯度稀释作为制备标准曲线
的 DNA模板。
定量 PCR引物设计：用 primer premier 5
软件在已获得克隆的序列内部设计两个基因
的定量 PCR引物，要求扩增片段小于 300 bp，
引物不存在复杂的结构。β-葡萄糖苷酶的引物
序列为：为 TBG-F: 5’-AGA ATG TCA AGG
CTG CTC-3’；TBG-R: 5’-AAA CTC TGT CCT
CCT CAC T-3’，PCR产物长度为 235 bp；β-
樱草糖苷酶的引物序列为：TBP2-F 5’-TGC
CTC TTC TGC CTA CC-3’；TBP2-R: 5’-TGT
TCA CTC CTC CGC TAA-3’，PCR产物长度
为 251 bp。
荧光定量 PCR：荧光定量 PCR 在 icycler
real-time quantity PCR仪（BIO-RAD公司）上
进行。在定量 PCR 专用的反应管中加入 IQ
SYBR Green Supermix（大连宝生物 SYBR
Premix EX Taq）12.5 µl，10µmol/L的引物各
1期 赵丽萍，等：茶树新梢不同叶片中 β-葡萄糖苷酶和 β-樱草糖……

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0.5 µl，H2O 10.5 µl，各反应管中加入质粒 DNA
稀释的标准品以及待测样品 cDNA各 1 µl，总
反应体系为 25 µl，每个样品做 3 个重复。反
应条件为 94℃预变性 3 min，94℃变性 30 s、
50℃复性 30 s、72℃延伸 30 s，35个循环，72℃
采集荧光。结束后做 94~50℃的熔解曲线分
析，荧光波长为 FAM 490 nm。
反应结束后使用荧光定量 PCR 仪的分析
软件对实验结果进行分析。根据标准曲线计算
龙井 43 春茶新梢中不同部位的 β-葡萄糖苷
酶、β-樱草糖苷酶基因的拷贝数。
2 结果
2.1 RNA质量及含量
提取的 RNA 经过电泳分析没有降解现
象，A260/A280 均在 1.8~2.0 之间，并且没有
基因组 DNA 污染，电泳图如图 1，可以用于
进一步实验。分光光度计测定其含量并稀释为
2 µg/µl进行反转录获得 20 µl cDNA。
2.2 标准品质粒 DNA制备
标准品质粒中 β-葡萄糖苷酶的插入片段
长度为 460 bp，载体长度为 2964 bp。通过质
粒 DNA的浓度计算标准品的拷贝数，获得质
粒的拷贝数为 3.70×1011，然后以 3.70×109拷
贝 /µl 为最高浓度依次做 10 倍梯度稀释：
3.70×109、 3.70×108、 3.70×107、 3.70×106、
3.70×105、3.70×104拷贝/µl，作为制备标准曲
线的 DNA模板。
标准品质粒 β-樱草糖苷酶的插入片段为
870 bp，经过测序进行鉴定，所克隆基因为所
需基因，载体长度为 3105 bp。根据浓度计算
拷贝数后，按照 3.49×109、3.49×108、3.49×107、
3.49×106、3.49×105、3.49×104 拷贝/µl，作为
制备标准曲线的 DNA模板。
2.3 荧光定量 PCR结果
本实验通过设定不同梯度已知模板浓度
的质粒标准品为参照样品，制备了标准曲线。
由于起始模板的拷贝数的对数与 Ct 值成反
比，从图 2 中可以看出，模板拷贝数越高，
Ct值越低。实验可以检测的最低拷贝数为 104，
标准曲线在 104和 109之间显示了很强的线性
关系，R2分别为 0.999 和 0.997，斜率分别为
-3.333和-3.510。
2.4 特异性和重复性
图 3显示了所有检测样品的熔解曲线。随
着温度的升高与双链结合的 SGⅠ释放， 荧光
信号也随之下降。荧光强度发生变化的拐点
（熔点，Tm）处可以清楚的看到一个单一的
峰，大约是在 85℃，这个峰对应的是扩增产
物的熔解温度，表明扩增产物为目的产物，其
余的地方没有杂峰出现，表明实验中未出现污
染、引物二聚体和假阳性现象。
对于每个浓度样本的 3个重复，通过计算
Ct 值的差异来验证检测的准确性，重复样本
间 Ct值的标准偏差小于 0.2（数据未给出），
说明结果是准确的、可靠的。
2.5 基因表达量检测
通过两个基因的标准曲线以及每个未知
模板经定量 PCR 确定的 Ct 值对每个样本进
行定量分析，获得各个样本中两个基因的拷
贝数（Ct 值和拷贝数数值见表 1）。从表 1
28S
18S
5.8S
1 2 3 4 5
图 1 RNA电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of RNAs

注：泳道 1 为一芽一叶、2 为二叶、3 为三叶、
4 为四叶、5 为五叶）
Note: Lane 1 is one and a bud, 2 is 2nd leaf, 3 is
3rd leaf, 4 is 4th leaf and 5 is 5th leave
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可知，β-葡萄糖苷酶在第四叶中拷贝数最高，
达到 2.86E+08 拷贝/µl，其次分别为第三叶>
第五叶>第二叶>一芽一叶。而 β-樱草糖苷酶
在一芽一叶中拷贝数最高，为 4.31E+06 拷贝
/µl，其次分别为：第二叶>第三叶>第四叶>
第五叶。
3 讨论
荧光定量 PCR 技术是一种新出现的定量
技术，具有高通量、特异性强、解决 PCR 污
染和操作简单等优点[15]。它的灵敏性以及对扩
增过程进行实时监控的能力提高了基于 PCR


















表 1 两种酶在一芽五叶新梢不同部位的平均 Ct值和拷贝数(copy/µl)
Table 1 Average Ct values and copy numbers of β-glucosidase and β-primeverosidase genes
in different leaf of ‘five and a bud about’
基因、Ct 值和拷贝数
Genes, Ct values and copy numbers
一芽一叶
One and a bud
第二叶
The 2nd leaf
第三叶
The 3rd leaf
第四叶
The 4th leaf
第五叶
The 5th leaf
Ct 值 value 13.39 13.10 12.09 11.72 12.79 β-葡萄糖苷酶
Glucosidase 拷贝数 copy number 9.62E+07 1.20E+08 2.46E+08 2.86E+08 1.43E+08
Ct 值 value 19.47 19.57 19.79 20.72 22.54 β-樱草糖苷酶
Primeverosidase 拷贝数 copy number 4.31E+06 4.02E+06 3.99E+06 1.84E+06 5.17E+05

图 2 β-葡萄糖苷酶(A)和 β-樱草糖苷酶(B)基因的定量标准曲线
Fig. 2 Quantitative standard curves for β-glucosidase gene (A) and β-primeverosidase gene (B)
Y＝-3.333X+41.574 R2=0.999
B
4
6
810
1214
16
1820
2224
26
28
4 5 6 7 8 9 10
LOG Starting Quantity,copy number
th
re
sh
ol
d
cy
cl
e
standard
unknown
A
Y=-3.510X+41.405 R2=0.997
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
4 5 6 7 8 9 10
LOG Starting Quantity,copy number
Th
re
sh
ol
d
cy
cl
e
standard
unknown
1期 赵丽萍，等：茶树新梢不同叶片中 β-葡萄糖苷酶和 β-樱草糖……

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进行定量的有效性。该技术是对 PCR 反应过
程中的每一个循环根据 Ct 值进行定量分析，
因此只要在仪器检测的灵敏度范围内，就可以
进行精确的外源基因拷贝数定量。荧光定量
PCR 分为相对定量和绝对定量，而后者才是
真正意义的定量 PCR，其前提是必须有与检
测物相同目的序列的定量标准。因此，定量标
准的制备是构建绝对定量 PCR 检测体系最为
基础和重要的工作之一。因为质粒 DNA的稳
定性强，本实验采用含有目的基因片段的重组
质粒作为定量标准品。β-葡萄糖苷酶和 β-樱草
糖苷酶是茶叶研究者最关注的 2 个与香气相
关的酶，特别是 β-葡萄糖苷酶的研究报道很
多，不过大多以酶的提取和活性研究为主，未
见对基因表达进行测定的报道。我们应用荧光
定量 PCR技术检测龙井 43春季一芽五叶新梢
各叶片中两种酶基因的表达量，得到 β-葡萄糖
苷酶基因表达高低为：第四叶>第三叶>第五
叶>第二叶>一芽一叶，这个结果与骆耀平等[4]
对 β-葡萄糖苷酶活性变化进行研究的结果（酶
活性在各叶位间是：芽>第一叶>第二叶>第三
叶>茎梗）相反。而 β-樱草糖苷酶的基因表达
趋势与 Mizutani 等 [6]研究的酶活性的结果相
吻合，均为一芽一叶>第二叶>第三叶>第四
叶。可能的原因是，我们检测到的是基因水平
的表达差异，而从基因开始最后到表现出酶的
活性中间有很多过程，如基因的翻译，蛋白质
的修饰以及酶的活性表现等等，这些因素都有
可能造成不同部位顺序的改变。
从本次实验结果可以看出 β-葡萄糖苷酶
基因在新生的叶片中含量最低，随着叶龄的
增加，基因的表达会增加，到第四叶达到顶
峰后随之下降；同样 β-樱草糖苷酶基因在一
芽一叶中表达最高，然后随着叶龄的增加表
达逐渐降低，两个重要香气基因在新梢中的
表达类型是有明显差异。本实验所建立的采
用克隆获得的重组质粒 DNA 作为标准品的
绝对定量的方法，可以有效地用于茶树中基
因表达的定量分析。
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图 3 熔解曲线图（其中横坐标代表温度，纵坐标代表荧光强度随温度变化的负一次倒数）
Fig. 3 Graph of Tm of all the real-time PCR reactions
Temperature, celsius(℃)
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“东茶宝”茶多酚片研制成功
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