全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-11-24
基金项目 : 福建省海洋与渔业厅重点项目（2008-1-10）, 公益性行业（农业）科研专项（201203085）
作者简介 : 陈政强 , 男 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 水产养殖动物病害及免疫保护 ; E-mail: zqchen999@jmu.edu.cn
通讯作者 : 常建波 , 男 , 学士 , 研究员 , 研究方向 : 水产养殖技术 ; E-mail: changjianbo@jmu.edu.cn
半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌（Vibrio rotiferianus）的
分离与鉴定
陈政强1， 2， 3 姚志贤1 林茂1， 2， 3 常建波1， 2， 3
（1 集美大学水产学院，厦门 361021 ；2 福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室 ，厦门 361021 ；
3 集美大学水产生物技术研究所，厦门 361021）
摘 要： 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）病灶处分离出 4株优势菌，经人工感染证
实其中一株菌株 BV1为养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌。通过 Biolog系统、细菌常规形态特征和生理生化反应指标测定以及
16S rRNA和 gyrB序列分析对菌株 BV1进行了综合鉴定，结果表明该致病菌为轮虫弧菌（Vibrio rotiferianus），其半致死量 LD50为
6.7×103 CFU/mL。进一步的药敏试验表明其对链霉素、四环素等敏感，而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。
关键词： 半滑舌鳎 皮肤溃疡病 轮虫弧菌 16S rRNA基因 gyrB基因
Characterization of Pathogenic Bacteria Vibrio rotiferianus
Isolated from Cynoglossus semilaevis Günther
Chen Zhengqiang1, 2, 3 Yao Zhixian1 Lin Mao1, 2, 3 Chang Jianbo1, 2, 3
（1Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021；2Key Laboratory of Science and Technology for Aquaculture and Food Safety, Jimei
University, Xiamen 361021；3Institute of Aquaculture Biotechnology, Jimei University, Xiamen 361021）
Abstract: We isolated four strains dominant bacteria associated with serious skin ulcers from Cynoglossus semilaevis, and proved
bacterial strain BV1 was a pathogen by artificial infection. We studied the morphological, physiological and biochemical characteristics of
pathogenic bacteria and sequenced the 16S rRNA and gyrB gene. The results of physiological and biochemical tests and molecular identification
suggested that the pathogen was V. rotiferianus, and the LD50 was 6.7×103 CFU/mL. The results of drug resistance of the pathogen showed that
the strain was sensitive to streptomycin, tetracycline, but low sensitive or resistant to other test antimicrobial agents.
Key words: Cynoglossus semilaevis Skin ulcers Vibrio rotiferianus 16S rRNA gene gyrB gene
半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）属鲽
形目、舌鳎科和舌鳎属，是一种温暖性近海大型底
层鱼类，主要分布在我国黄海和渤海海域，具有活
动范围小，营养等级低、个体大、生长快等优点［1-3］。
目前，半滑舌鳎已成为我国沿海地区海水养殖鱼类
的优良品种之一，当前工厂化育苗水平已达到年产
数百万尾商品苗种的水平［2］。随着人工养殖规模的
不断扩大，近年来在半滑舌鳎的养殖过程中出现了
由鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum）［4-6］、副溶
血弧菌（V. parahaemolyticus）［5］、河口弧菌（V. aes-
tuarianu）［5］、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（Photobac-
terium damselae subsp. piscicida）［7］、迟缓爱德华氏菌
（Edwardsiella tarda ）［8］等引起的细菌性疾病，造成
了很大的经济损失，病害已构成制约其健康发展的
重大障碍［9］。
目前，16S rRNA 依然是细菌鉴定最常用的分
子工具，但是由于弧菌属细菌的相似性极高，16S
rRNA 已不能准确地确定菌株的分类地位。gyrB 即
促旋酶（gyrase）的 B 亚单位基因，属于与 DNA 复制、
限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因，存在于大
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期148
多数细菌中，而且不会发生频繁的水平转移，在不
同的蛋白及蛋白的不同位点，其氨基酸替代率也不
相同［10］，因此，该基因在细菌的系统发育学分析，
特别是在近缘种和菌株的区分及鉴定方面受到高度
关注，许多研究证实 gyrB 基因分析是一种快速、有
效的鉴别微生物的方法［11-13］。
从 2009 年 6 月开始，福建省漳州地区养殖的
半滑舌鳎患有严重的皮肤溃疡病。针对近年来半滑
舌鳎皮肤性溃疡病频发并且呈现蔓延、加重趋势的
具体情况。本研究就引起此次疾病的病原进行分离、
鉴定，对病原菌进行了致病性、形态特征、理化特
性、16S rRNA 和 gyrB 基因序列的系统发育学分析、
对抗菌类药物的敏感性等方面进行了研究，旨在揭
示诱发该疾病的主要病原及其生物学特性，为该病
的有效防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验鱼 试验用半滑舌鳎取自福建省漳州市
诏安海康海水养殖有限公司。选取皮肤溃疡病症状
显著的半滑舌鳎患病个体用于病原分离与检测 ；选
取体色正常、体表无损伤、活力良好，平均体重为
（124±5）g，平均体长为（32±2）cm 的半滑舌鳎健
康个体用于人工感染试验，试验前饲养在集美大学
水产学院海水养殖试验场，暂养 2 周。
1.1.2 药物和试剂 弧菌科细菌生化鉴定管（杭州
天和微生物试剂有限公司），药敏纸片（杭州天和
微生物试剂有限公司）、DNA 抽提试剂盒（OMEGA
BIO-TEK）、gel Extraction Kit（OMEGA BIO-TEK）、
pMD-18 T Vector（TaKaRa）。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离 取症状典型的患病半滑舌鳎鳃、
体表患病组织、腹水分别做成水浸片在显微镜下进
行寄生虫和真菌排查，再经 CsCl 密度梯度离心，磷
钨酸负染电镜观察是否有病毒感染。同时，在无菌
条件下从患病半滑舌鳎腹水、体表上分离细菌，划
线接种于 TCBS 平板和 2216E 平板上，于 28℃恒温
箱培养 24 h，挑取形态一致的优势菌落进行多次的
划线分离纯化获得 4 株纯培养菌株。
1.2.2 人工感染试验 将分离纯化的 4 株优势菌接
种于新鲜的 TSA 斜面，28℃培养 18 h，用无菌 PBS
调制成浓度分别为 1×108、1×107、1×106、1×105、
1×104 及 1×103 CFU/mL 的菌悬液，备用。
取半滑舌鳎健康个体 140 尾，按每 35 尾一组分
为 4 个试验组，分别进行上述 4 株优势菌的人工感
染试验。每一试验组设置 7 个单元，各 5 尾试验鱼。
其中 6 个单元的试验鱼用于背肌注射不同浓度的菌
悬液试验，注射剂量为 100 μL/ind.，另一个单元的
试验鱼注射等量的 PBS 作为试验对照。
试验鱼饲养在室内的水族箱内，试验水温为
（25±1） ℃，连续观察 14 d，期间每天正常饲养并换
水、吸除底污一次，记录半滑舌鳎的发病症状和死
亡情况，并按照 Reed 的方法计算 14 d 内半滑舌鳎
的半数致死量［14］。
从人工感染濒死的半滑舌鳎中，取患病症状与
自然患病濒死半滑舌鳎症状相似的试验鱼再次分离、
纯化细菌，并再次进行人工感染试验。
1.2.3 病原菌的鉴定
1.2.3.1　形态、菌落特征观察及理化特性研究　取
纯培养菌接种于 TCBS 和 2216E 平板上，观察其形
态和菌落特征，并进行革兰氏染色镜检 ；接种于
TSA 平板培养 10 h 后，无菌水洗下，滴一滴在铜网
上，负染，透射电镜下观察。利用 Biolog 系统鉴定
仪并结合常规的生理生化鉴定方法对病原菌进行理
化特性测定，参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》进行
分类［15］。
1.2.3.2　16S rRNA 和 gyrB 基因序列测定和系统发育
树分析　PCR 模板 DNA 的制备。取纯培养菌株接种
于 TSB 中 28℃培养 16 h，参照 OMEGA 公司细菌基
因组 DNA 抽提试剂盒所述方法提取 DNA 作为 PCR
模板。
16S rRNA 基因序列的 PCR 扩增和序列测定。
16S rRNA 基因 PCR 扩增的两个引物［16］分别为 P1 ：
5-AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG-3、P2：5-ATT-
CACCGTGGCATTCTGATCC-3。在 25 μL 反应体系中
含 有 ：ddH2O 16.75 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25
mmol/L MgCl2 2 μL，dNTP Mix 0.5 μL， 引 物 各 0.5
μL，5 U/μL 的 Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，模板 DNA 2
μL。PCR 反应条件为 ：95℃预变性 2 min、94℃变性
30 s、58℃复性 45 s、72℃延伸 1 min 30 s，30 个循
2012年第6期 149陈政强等 ：半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌（Vibrio rotiferianus）的分离与鉴定
环后 72℃温育 7 min。PCR 产物纯化后与 pMD18-T
Vector 连接，连接产物转化 E.coli JM109 后，涂布于
含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 平板，37℃过
夜培养，经 PCR 检测后挑取阳性克隆交由 Invitrogen
公司进行序列测定。
gyrB基因序列的PCR扩增与序列测定。 gyrB 基
因 PCR 扩增的两个引物分别为 P1：5-TCCGGCGGT-
CTGCACGGCGT-3、P2：5-TTGTCCGGGTTGTACTC-
GTC-3。在 25 μL 反应体系中含有：ddH2O 16.75 μL，
10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2 μL，dNTP
Mix 0.5 μL，引物各 0.5 μL，5 U/μL 的 Taq DNA 聚
合酶 0.25 μL，模板 DNA 2 μL。PCR 反应条件为 ：
95℃预变性 5 min、94℃变性 1 min、57℃复性 1
min、72℃延伸 2 min，30 个循环后 72℃温育 7 min。
PCR 产物纯化后与 pMD18-T Vector 连接，连接产物
转化 E.coli JM109 后，涂布于含有氨苄青霉素（100
μg/mL）的 LB 平板，37℃过夜培养，经 PCR 检测后
挑取阳性克隆交由 Invitrogen 公司进行序列测定。
16S rRNA 和 gyrB 基因序列分析与系统发育树
的构建。将分离菌的 16S rRNA 和 gyrB 基因序列通
过 NCBI 的 Blast 检索系统进行序列同源性分析，从
中分别选取与所获的序列同源性较高的菌株的 16S
rRNA 和 gyrB 基因序列，用 Mega 5.05 采用邻位相连
法（Neighbor-joining method）获得系统发育树，通
过自举分析（Bootstrap）进行置信度检测，自举数
集 1 000 次。
1.2.4 药敏试验 采用药敏纸片法，将药敏纸片置
于涂满菌液的培养皿中，24 h 后观察，记录各药敏
纸片的抑菌圈直径（mm），并按照药敏纸片抑菌范
围解释标准判断试验结果。
2 结果
2.1 病鱼检查结果
患病半滑舌鳎主要表现为体表溃烂、尾部出血，
有些肠脱出肛外，解剖发现腹腔内积有大量的腹水，
肝脏发白。通过水浸片显微镜下观察未发现有寄生
虫和真菌，电镜观察未发现病毒。
2.2 病原菌的分离及其形态特征
从患病半滑舌鳎的病灶分离到优势菌 4 株，该
菌株在 TCBS 和 2216E 培养基上的形态和培养特征
分别为 ：BV1 在 TCBS 上菌落圆形光滑、边缘整齐、
较隆起、黄色，培养 24 h 菌落直径多在 2 mm 左右。
在 2216E 上菌落圆形光滑、边缘整齐、较隆起、乳
白色。革兰氏染色结果表明，该菌为革兰氏阴性菌。
透射电镜下，该菌呈曲杆状，两端钝圆，菌体大小
为（0.9-1.7）μm×（2.3-3.6）μm，具有两根极生鞭
毛，见图 1。
图 1 菌株BV1的透射电镜观测图
2.3 人工感染试验
以分离到的菌株感染半滑舌鳎，其中 3 株未出
现死亡，而菌株 BV1 在感染 2 d 后半滑舌鳎就开始
出现死亡，高浓度感染组（1×108 CFU/mL）试验
半滑舌鳎的死亡发生在注射后的第 2 天，死亡率为
60%，且在试验的第 3 天全部死亡 ；1×107 CFU/mL、
1×106 CFU/mL、1×105 CFU/mL 感染组试验半滑舌
鳎均在试验的第 4 天开始死亡，死亡率分别为 80%、
80%、60%，低浓度感染组（1×104 CFU/mL）试验
半滑舌鳎在试验的第 5 天开始死亡。在试验的 14 d
内对照组无死亡（表 1）。人工感染后试验鱼摄食量
减少，活力减弱，皮肤出现溃疡、出血，腹腔内积
有大量的腹水，而对照组不表现任何症状。由公式
计算出 BV1 对半滑舌鳎的 LD50 为 6.7×103 CFU/mL。
取人工感染后发病濒死半滑舌鳎病变组织重新
分离病原，可分离到大量菌落形态高度一致的细菌，
其菌落形态、大小以及生理生化特征均与 BV1 菌株
相同。取再次分离的菌株进行人工感染得到了仍能
出现与自然发病情况下相同的症状。这些结果表明
BV1 菌即为半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期150
表 1 菌株 BV1对半滑舌鳎的感染试验结果
组别 菌液浓度（CFU/mL）
试验鱼
数量（尾）
试验鱼死亡
数量（尾）
死亡率
（%）
试验组
（BV1）
1.5×108 5 5 100
1.5×107 5 4 80
1.5×106 5 4 80
1.5×105 5 4 80
1.5×104 5 3 60
1.5×103 5 0 0
对照组 PBS 5 0 0
2.4 生理生化特征
经 Biolog 自动鉴定系统结果显示，BV1 菌株得
不到鉴定结果，但与哈维氏弧菌有 34.2% 的相似性，
结合常规生理生化鉴定指标与《伯杰氏细菌鉴定手
册》中弧菌属细菌的特征比较，发现菌株 BV1 与轮
虫弧菌的特征相似性较高，其生理生化试验结果见
表 2。
2.5 16S rRNA 和gyrB基因序列分析及系统发育树
构建
对 BV1 菌株进行了 16S rRNA 和 gyrB 基因序列
的测定，其长度分别为 1 137 bp、1 130 bp，其 PCR
扩增的电泳结果如图 2、图 3。将序列提交到 Gen-
Bank，获得的登录号分别是 JN391272、JN168882。
菌株 BV1 的 16S rRNA 基因序列通过 Blast 检索，发
现其与弧菌属同源性较高，相似性为 98%-99%。从
中选取与 BV1 相似性高的细菌 16S rRNA 序列进行
系统发育学分析，结果（图 4）表明菌株 BV1 与轮
虫弧菌聚合，不过置信度较低，仅有 10%。将 gyrB
基因部分序列进行 Blast 分析，发现该菌株与轮虫弧
菌最为接近（相似性 99%）。系统发育树（图 5）显
示，该菌株与轮虫弧菌聚为一支，且置信度较高为
99%。结合菌株 BV1 的生理生化特征和 16S rRNA、
gyrB 基因序列分析结果，有较充分的依据确认该菌
为轮虫弧菌。
2.6 药敏试验
在所试的 17 种抗生素中，BV1 菌株对链霉素、
四环素、强力霉素、氟哌酸、磺胺异恶唑、复方新诺明、
萘啶酸和左氟沙星敏感，而对其他抗生素低敏或具
有一定的抗性，具体见表 3。
3 讨论
国外已有从褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）
分离出轮虫弧菌的报道［17］，但还未曾见到从半滑舌
鳎病灶中分离出轮虫弧菌的报道。本研究通过对患
有皮肤性溃疡病的半滑舌鳎进行解剖、细菌分离鉴
定以及回归感染试验，证明了菌株 BV1 是半滑舌鳎
皮肤性溃疡病的病原。经过生理生化和 16S rRNA 和
gyrB 基因的鉴定和系统发育树分析，表明引起半滑
舌鳎皮肤性溃疡病的病原为轮虫弧菌。
本试验采用传统的生理生化、自动微生物鉴定
仪和分子生物学方法对分离细菌进行鉴定比较。试
验中发现全自动细菌鉴定仪和 16S rRNA 基因测序
分析都存在不容忽视的缺陷。全自动鉴定仪对于
研究相对较少的水产微生物较难得到准确的鉴定
结果。当前，作为细菌等微生物的分子生物学技
术鉴定手段之一，16S rRNA 基因测序分析方法被
广泛用于鱼类细菌性疾病诊断［18-20］。但是，轮虫
弧菌与坎氏弧菌（V. campbellii）、哈维氏弧菌（V.
harveyi）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）和副溶血弧菌
（V. parahaemolyticus）、需钠弧菌（V. natriegens）等
的 16S rRNA 基因序列的相似性极高［21-23］，达到了
99%［19］。因此，16S rRNA 基因序列用于上述亲缘关
系较近的菌种间的差异性分析显然分辨率非常不足。
通过 16S rRNA 基因序列构建进化树，发现该分离菌
虽与轮虫弧菌聚为一支，但是置信度并不高，因此
必须另作分析。而编码 DNA 解旋酶 B 亚单位的基因
（gyrB 基因）序列具有保守性和变异性，其基因进化
率较快，碱基替换频率较高［10］。该基因在细菌的系
统发育学分析，特别是在近缘种和菌株的区分及鉴
定方面受到高度关注。许多研究证实 gyrB 基因分析
是一种快速、有效的鉴别微生物的方法［11-13］。本试
验以 gyrB 基因构建的系统树，每个分支的置信度都
在 70% 以上，且都高于 16S rRNA 基因，表明 gyrB
基因比 16S rRNA 基因在海洋弧菌的分类鉴定方面更
具优越性。近年来随着分子生物学方法的不断发展，
许多学者利用 AFLP 和 REP-PCR 等技术快速准确地
鉴定包括弧菌属在内的细菌，运用 REP-PCR 技术还
可以区分同种细菌的不同菌株［24-29］。因此，在鉴定
弧菌属细菌时应该综合利用多种分子生物学技术手
2012年第6期 151陈政强等 ：半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌（Vibrio rotiferianus）的分离与鉴定
项 目 结 果 项 目 结 果
糊精 + 明胶 N
D- 麦芽糖 + 甘氨酰 -L- 脯氨酸 +
D- 海藻糖 + L- 丙氨酸 +
D- 纤维二糖 + L- 精氨酸 +
龙胆 + L- 天氨酸 +
蔗糖 + L- 谷氨酸 +
D- 松二糖 B L- 组氨酸 +
水苏糖 + L- 焦古氨酸 -
PH6 + L- 丝氨酸 +
PH5 - 林可霉素 -
D- 棉子糖 - 盐酸胍 MN
α-D- 乳糖 - 硫酸四癸钠 +
D- 蜜二糖 - 果胶 +
β- 甲基 - D - 葡萄糖苷 N D- 半乳糖醛酸 -
D- 水杨苷 + L- 半乳糖酸内酯 -
N- 乙酰 -D- 氨基葡糖糖 + D- 葡萄糖酸 D- 葡萄糖酸 +
N- 乙酰 -β-D- 氨基甘露醇 + D- 葡萄糖醛酸 +
N- 乙酰 -D- 半乳糖胺 + 葡糖醛酰胺 +
N- 乙酰神经氨酸 B 粘酸 -
1% 氯化钠 + 奎尼酸 -
4% 氯化钠 + D- 糖酸 -
8% 氯化钠 + 万古霉素 +
α-D- 葡萄糖 + 四氮唑紫 -
D- 甘露糖 + 四氮唑蓝 +
D- 果糖 + 对羟基苯甲酸 -
D- 半乳糖 + 甲基丙酮酸 +
3- 甲基葡萄糖 + D- 乳酸甲酯 B
D- 岩藻糖 + L- 乳酸 +
L- 岩藻糖 B 柠檬酸 +
L- 鼠李糖 - α- 酮戊二酸 B
肌苷 + D- 苹果酸 MN
1% 乳酸钠 1% + L- 苹果酸 +
夫西地酸 + 溴丁二酸 +
D- 丝氨酸 + 萘啶酸 -
山梨醇 N 氯化锂 +
D- 甘露醇 + 甲酸盐 -
D- 阿拉伯糖醇 + 吐温 40 MN
肌醇 N g- 氨基丁酸 N
甘油 + α- 羟基丁酸 +
D- 葡萄糖 -6- 磷酸 + β- 羟基 - D，L 酪酸 N
D- 果糖 -6- 磷酸 + α- 酮丁酸 +
D- 天冬氨酸 N 乙酰乙酸 MN
D- 丝氨酸 + 丙酸 N
醋竹桃霉素 MN 醋酸 MN
利福霉素 SV + 甲酸 N
米诺环素 - 氨曲南 -
氧化酶 + 丁酸钠 -
触酶 + 溴酸钠 -
糖发酵（O/F） F V-P -
表 2 菌株 BV1生理生化试验结果
+. 阳性 ; -. 阴性 ; B. 临界 ; F. 发酵 ; MN. 假阴性 ; N. 鉴定值低于 A1 孔
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期152
段达到快速准确鉴定致病菌的目的。
4 结论
从患有皮肤溃疡病的半滑舌鳎中分离到一株
致病菌 BV1，通过 Biolog 系统、细菌常规形态特
征和生理生化反应指标测定以及 16S rRNA 和 gyrB
基因序列分析，证实菌株 BV1 为轮虫弧菌（Vibrio
rotiferianus），其半致死量 LD50 为 6.7×103 CFU/mL。
药敏试验表明该致病菌对链霉素、四环素等敏感，
而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的
抗性。
参 考 文 献
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图 4 16S rDNA序列所构建的系统发育树 图 5 gyrB序列所构建的系统发育树
图 2 16S rRNA基因 PCR扩增电泳结果 图 3 gyrB基因 PCR扩增电泳结果
表 3 BV1药敏试验结果
药品 药物含量（μg/disc） 抑菌圈直径（mm） 敏感性 药品 药物含量（μg/disc） 抑菌圈直径（mm） 敏感性
青霉素 10 - R 氧氟沙星 5 19 M
卡那霉素 30 16 I 新生霉素 30 18 M
链霉素 10 21 M 复方新诺明 15 28 I
四环素 30 20 M 利福平 5 19 M
强力霉素 30 19 M 萘啶酸 30 24 M
甲氧苄啶 5 19 M 氟啶酸 10 19 M
阿奇霉素 15 17 I 左氟沙星 5 24.5 M
氟哌酸 10 20.5 M 吡哌酸 30 14 R
磺胺异恶唑 30 22 I
R. 耐药 ；I. 中度敏感 ；M. 敏感
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（责任编辑 李楠）