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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):135-139
SLA-1 属于猪白细胞抗原（swine leukocyte anti-
gen，SLA），亦称为猪主要组织相容性复合体（major
histocompatibility complex，MHC）I 类 分 子 重 链 的
功能基因，是重要的免疫应答基因群，分为 SLA-I、
SLA-II 和 SLA-III 三类分子［1，2］。SLA-I 类分子分为
重链和轻链，重链分子含有 3 个功能基因，分别称
收稿日期 ：2014-07-30
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31172304），大连大学本科生创新项目（2013249）
作者简介 ：翟晓鑫，男，研究方向 ：动物分子免疫学 ；E-mail ：1689616387@qq.com
通讯作者 ：高凤山，男，博士，副教授，研究方向 ：基因工程和动物分子免疫学 ；E-mail ：gfsh0626@126.com
大肠杆菌表达托佩克猪 SLA-1 胞外区的研究
翟晓鑫  张秀娟  杨杰  高凤山
（大连大学生命科学与技术学院，大连 116622）
摘 要 ： 为构建托佩克猪 SLA-1 重链基因原核重组表达载体并研究其在 pET-21a（+）中的表达，设计引物，PCR 扩增托
佩克猪 SLA-1 基因胞外区（命名为 SLA-1-TPKe），并克隆至 pMD19-T Simple Vector，经酶切鉴定后将 SLA-1-TPKe 基因与表达系
统 pET-21a（+）连接，转化到 BL21（Rosseta）菌进行诱导表达，SDS-PAGE 检测目的蛋白。提取 SLA-1-TPKe 包涵体，并经 SDS-
PAGE 检测。PCR 结果显示，SLA-1-TPKe 大小为 851 bp，成功克隆到 pMD19-T Simple Vector，酶切鉴定大小为 831 bp，连接到
pET-21a（+）并转化到 BL21（Rosseta）菌，经诱导表达和 SDS-PAGE 检测目的蛋白的大小为 31 kD。目的蛋白以包涵体形式存在，
纯化后蛋白纯度达到 90% 以上。
关键词 ： 托佩克猪 ；SLA-1 ；重链基因 ；表达 ；包涵体
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.019
Expression of the Extracellular Domain of SLA-1 Derived from Topigs
Pig in Escheichia coli
Zhai Xiaoxin Zhang Xiujuan Yang Jie Gao Fengshan
（College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622）
Abstract: In order to construct the recombinant prokaryotic expressed vector of the heavy chain of SLA-1 derived from Topigs pig and
to study its expression in pET-21a（+）, a pair of primers was designed to amplify the extracellular domain of SLA-1-TPK gene（named SLA-
1-TPKe）followed by sub-cloning the gene into pMD19-T Simple Vector. After identification by cleavage with Nde I and Xho I, the SLA-1-TPKe
was ligated to pET-21a（+）and transformed into BL21（Rosseta）to be induced to express followed by analysis of the expressing products by
SDS-PAGE. Finally, the inclusion bodies of the SLA-I-TPKe was isolated and detected by SDS-PAGE. The PCR result was shown that the length
of the SLA-1-TPKe was about 851 bp which was consistent with the calculated value. Then, the SLA-1-TPKe was successfully cloned into the
pMD19-T Simple Vector and identified by cleavage with Nde I and Xho I and the inserted fragment was about 831 bp. In succession, the gene
was successfully inserted into pET-21a（+）followed by transforming into Escherichia coli BL21（Rosseta）. After induction and expression,
the SLA-1-TPKe was successfully expressed with the interest of protein about 31 kD. The protein was expressed mainly as inclusion body protein
with the purity of 90%.
Key words: Topigs pig ；SLA-1 ；the heavy chain gene ；expression ；inclusion protein
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3136
为 SLA-1、SLA-2 和 SLA-3。轻链分子只有一个等位
基因 β2m。重链与轻链非共价结合构成 SLA-I 类分
子，在体内结合和递呈抗原表位［3-6］。在 3 个 SLA-I
类分子功能基因中，SLA-1 基因多态性最强，目前
已经可查到的 SLA-1 等位基因序列达到 140 多个，
高 于 SLA-2 和 SLA-3， 推 测 SLA-1 在 SLA-I 类 分 子
中利用率可能高于其他两个功能基因［7］。而事实证
明，动物 MHC I 类分子的重链、多肽及轻链的结合
不仅在体内可以进行，在体外也可以完成［8］。本试
验所用托佩克猪是世界第二大种猪公司荷兰国际种
猪公司在 20 世纪 60 年代培育的品系，该品系猪生
长快、抗病力强、遗传性能稳定，是目前欧美“当
家”猪种［9］。目前，该品系猪已经在国内大量饲养，
其相关的基因表达研究等正在国内外展开［10，11］。
本课题组已经克隆了多个国内外品系猪的 SLA-1 等
位基因，包括托佩克猪。托佩克猪是我国目前引进
的主要饲养品系，研究该品系猪 SLA-1 的结构和
功能对于今后制定针对性的疾病防治策略及种间遗
传育种具有指导意义。本研究拟在前期研究的基
础上，选取托佩克猪的 SLA-1 等位基因，构建其
pET-21a（+）的原核表达载体，并获得表达蛋白，
旨在为今后对托佩克猪 SLA-1 的晶体结构解析、多
肽结合等研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
重组质粒 SLA-1-TPK/pMD19-T simple 为大连大
学分子免疫实验室构建并保存，表达载体 pET-21a
（+）及菌株 Escherichia coli BL21（Rosseta）来自于
中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 ；Escherichia coli Top10
菌株为大连大学分子免疫学实验室保存。克隆载
体 pMD19-T Simple Vector 购自大连宝生物公司。
限制性内切酶 Xho Ⅰ和 Nde Ⅰ、PCR 扩增酶 Ex
Taq、连接酶 T4 DNA Ligase、低分子量蛋白 Marker、
DL2000 DNA Marker 均 购 买 自 大 连 宝 生 物 公 司 ；
SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒、SanPrep 柱式质粒
DNA 小量抽提试剂盒、IPTG、胰化蛋白胨、甘氨酸
酵母提取物、NaCl、琼脂粉、过硫酸铵、二甲基甲
叉双丙烯酰胺、TEMED、三羟甲基氨基甲烷等购自
上海生工。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计 托佩克猪 SLA-1 基因胞外区表
达 引 物 设 计 pTPK21F-SLA-1-T ：5-GGGAATTCCAT
ATGGGCCCGCATTCTCTGAGCCATTTC-3 ；pHB21R-
SLA-1-276 ：5-AGTCTCGAGTTAAGGGTCCCATCTCA
GGGTGAGG-3。
1.2.2 SLA-1-TPKe 基因的亚克隆 以重组质粒 SLA-
1-TPK/pMD19-T simple 为 模 板， 以 pTPK21F-SLA-1-
T/pHB21R-SLA-1-276 为引物对，扩增基因链 SLA-
1-TPKe，PCR 扩增条件为 ：94℃ 3 min ；94℃ 45 s，
68℃ 30 s，72℃ 45 s，33 个循环 ；72℃延伸 10 min。
PCR 结束后将产物进行核酸电泳，电泳完毕后使用
凝胶成像系统检测 PCR 产物，最后使用 SanPrep 柱
式 DNA 胶回收试剂盒回收 PCR 产物［12］。
SLA-1-TPKe 回 收 产 物 连 接 pMD19-T Simple 并
转化大肠杆菌 Top10，37℃过夜培养，通过 SanPrep
柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒抽提质粒，酶切筛选
阳性克隆菌种，送至生工生物公司进行测序。
1.2.3 表达载体的构建 将筛选的阳性克隆菌抽提
质粒，然后用 Nde Ⅰ、Xho Ⅰ对其进行双酶切，酶
切后通过凝胶纯化回收 SLA-1-TPKe 基因，然后与表
达载体 pET-21a（+）连接，转化至感受态细胞 BL21
（Rosseta），涂布到含氨苄霉素的平板中，37℃过夜
培养，挑选菌落至新鲜 LB 培养基，过夜培养后抽
提质粒，然后用 Nde Ⅰ、Xho Ⅰ对其进行双酶切筛
选阳性质粒，并命名为 pET-21a（+）/SLA-1-TPKe（图
1），送生物公司测序。
1.2.4 SDS-PAGE 检 测 SLA-1-TPKe 蛋 白 表 达 将
阳 性 重 组 菌 种 100 μL 接 种 5 mL LB 液 体 培 养 基，
37℃，170 r/min 震荡培养至 OD600 达 0.4-0.6 之间，
加入 IPTG 至终浓度达到 1 mmol/L，37℃，170 r/min，
诱导 5 h 后，取菌液 1 mL，12 000 r/min，2 min，去
上清，菌体经 TE 溶解并经 5×SDS 样品 buffer 处理，
SDS-PAGE 测蛋白表达［13］。
1.2.5 SLA-1-TPKe 包涵体的提取 表达后的 SLA-
1-TPKe 重组菌按 1% 比例接种后扩大培养，相同方
法诱导表达，6 000 r/min 离心收集菌体，洗涤后采
用超声波冰浴破碎，6 000 r/min 离心后，进行 SDS-
PAGE 电泳，并保存包涵体。
2015,31(3) 137翟晓鑫等 ：大肠杆菌表达托佩克猪 SLA-1 胞外区的研究
2 结果
2.1 SLA-1-TPKe基因的扩增
经 PCR 和琼脂糖电泳检测到一条约 850 bp 的条
带（图 2），与理论设计值 851 bp 相符。
感受态细胞 BL21（Rosseta），再经双酶切鉴定发现
插入片段大小为 830 bp 左右（图 4），与理论值 831
bp 相符。
Xho I Nde I rbs
Dra III
Terminator
Xho I
Nde I
T7 promoter
f1 origin
Ap
pET-21a/SLA-1-TPKe
5443 bp/831 bp
Ori
lac I
G A G C T C A AT- S L A - 1 - T P K e - G TATA C ATATA G A G G A A
Nde I 和 Xho I 为插入片段两端的酶切位点，插入片段长度为 831 bp，载体
大小为 5 443 bp
图 1 SLA-1-TPKe 表达载体的构建
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
M ：DNA 分子量标准 DL2000 ；1 ：PCR 扩增 SLA-1-TPK
图 2 SLA-1-TPKe 的 PCR 扩增结果
2.2 SLA-1-TPKe基因亚克隆到pMD19-T Simple
Vector
经连接转化后，挑取单菌落培养，提取质粒，
用 Nde I、Xho I 进行双酶切，电泳显示插入片段约
为 850 bp 左右的条带（图 3），与理论设计值 831 bp
大小相符。
2.3 SLA-1-TPK基因亚克隆到pET-21a（+）
将与 pMD19-T Simple 载体连接的重组质粒双酶
切，回收目的片段后与 pET-21a（+）连接，转化至
2000
bp
M 1 2
1000
750
500
250
100
M ：DNA 分子量标准 DL2000 ；1 ：重组质粒 ；2 ：重组质粒双酶切鉴定
图 3 pMD19-T Simple Vector/ SLA-1-TPKe 重组质粒双酶
切鉴定
2000
bp
M 1 2
1000
750
500
250
100
M ：DNA 分子量标准 DL2000 ；1 ：抽提质粒产物 ；2 ：重组质粒双酶切鉴定
图 4 重组质粒 pET-21a（+）/SLA-1-TPKe 双酶切鉴定
2.4 序列分析pET-21a（+）/SLA-1-TPK
经 序 列 测 定 分 析，pET-21a（+）/SLA-1-TPKe
编码的氨基酸序列与原序列 100% 同源（图 5）。
2.5 SDS-PAGE分析pET-21a（+）/SLA-1-TPK中的
表达
将鉴定阳性的重组表达菌再经 IPTG 诱导，SDS-
PAGE 检测目的基因的表达，结果（图 6）显示重组
菌表达出一条约 30 kD 的蛋白，与目的蛋白理论值
31 kD 相符。
2.6 SLA-1-TPKe包涵体提取
SDS-PAGE 检测包涵体蛋白，发现包涵体蛋白
的大小约 30 kD，与目的蛋白大小一致，而且在包
涵体提取过程中，去除了大部分杂蛋白，目的蛋白
得到了纯化（图 7）。
3 讨论
托佩克猪是来自于荷兰 20 世纪 60 年代培育的
优质高产品系，目前该品系猪已经在我国广泛饲养。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3138
然而，对于该品系猪的基因资源了解的不多，尤其
是涉及到与免疫应答有关的基因，如 SLA-I 类分子，
对这些基因的研究将有利于针对该品系猪制定科学
的免疫治疗手段和策略。SLA-I 类分子包括 3 个功
能基因，SLA-1、SLA-2 和 SLA-3。其中 SLA-1 基因
的多态性比较丰富，目前对其研究报道较多。然而，
目前国内还没有展开对托佩克猪 SLA-1 的报道研究。
SLA-1 基因表达的重链可以与抗原肽及轻链
β2m 组成复合体，然后经过高尔基体加工后被递呈
到细胞表面与 CD8+ T 细胞的 TCR 结合，刺激 CD8+
T 细胞活化，分泌细胞因子，从而杀死被感染的靶
细胞［14］。而事实证明，动物 MHC I 类分子的重链、
多肽及轻链的结合不仅可以在体内进行，在体外也
可以完成［15］。在体外研究 MHC I 类分子表达时，为
了提高表达效果，一般要去掉信号肽及胞内区，而
集中选择胞外区，因为只有胞外区涉及到多肽结合
等功能。
本研究以托佩克猪的 SLA-1 基因胞外区为研究
对象，构建了原核重组表达载体并获得表达蛋白，
旨在为今后研究 SLA-1 分子与抗原肽以及轻链 β2m
的结合提供参考。本研究结果显示，原核重组表达
载体构建成功，插入片段大小与理论设计值 831 bp
相符。在插入片段的两端，设计了 Nde I 和 Xho I 酶
10 20 30 40 50 60 70 80 90
100 110 120 130 140 150 160 170 180
190 200 210 220 230 240 250 260 270
280 290 300 310 320 330 340 350 360
370 380 390 400 410 420 430 440 450
460 470 480 490 500 510 520 530 540
550 560 570 580 590 600 610 620 630
640 650 660 670 680 690 700 710 720
730 740
820 830
750 760 770 780 790 800 810
SLA-1-TPKe 全长 831 bp，其中 3 端终止密码子 TAA 为人工加入
图 5 亚克隆 SLA-1-TPKe 及序列分析
14.3
20.1
29.0
44.3
66.4
97.2
kD
M 1 2 3 4 5 6 7 ⴞⲴ㳻ⲭ
M：蛋白分子量（低）；1：pET-21a（+）/SLA-1-TPKe 在 BL21 中未经诱导表达；
2-7 ：pET-21a（+）/SLA-1-TPK 在 BL21 中经 IPTG 诱导表达
图 6 SDS-PAGE 分析 pET-21a（+）/SLA-1-TPKe 中的
表达
14.3
20.1
29.0
44.3
66.4
97.2
kD
M 1
M ：蛋白分子量（低）；1 ：pET-21a（+）/SLA-1-TPKe 包涵体
图 7 SDS-PAGE 检测 pET-21a（+）/SLA-1-TPKe
包涵体
2015,31(3) 139翟晓鑫等 ：大肠杆菌表达托佩克猪 SLA-1 胞外区的研究
切位点，因为这两个位点在 pET-21a（+）载体位
于多克隆位点两端，而且 Nde I 本身包含起始密码
子 ATG，因此表达出的目的蛋白不带有其他标签，
非常适合于做蛋白的结构研究，也有利于其功能
研究［16］。初步的诱导表达显示，目的基因 SLA-1-
TPKe 成功表达，大小约为 30 kD，与理论设计值 31
kD 相符。由于目前没有市售的 SLA-1 单抗，而表达
蛋白不带有任何标签，因此蛋白不能用 Western blot
鉴定。但课题组通过酶切鉴定及测序初步证明表达
的蛋白为 SLA-1-TPK。包涵体提取，证明该重组蛋
白主要以包涵体的形式存在，而且包涵体蛋白含量
和纯度均较高，适合进行下一步结构和功能的研究。
4 结论
本 研 究 成 功 克 隆 及 表 达 了 托 佩 克 猪 SLA-1-
TPKe，并得到其包涵体蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）