全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
托佩克猪 SLA-2 基因克隆及功能区
生物信息学分析
白婧1 许崇波1 张强2 高凤山1，2
(1大连大学生物工程学院 生物化学和分子生物学实验室，大连 116622;
2中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原微生物国家重点实验室，兰州 730046)
摘 要: 为研究托佩克猪 SLA-2 基因功能，设计引物，克隆了该品系猪 SLA-2 基因(SLA-2-TPK)cDNA全长序列，并通过
分子生物学软件分析其基因特征。结果显示，SLA-2-TPK cDNA全长为 1 119 bp，其中 3 － 1 097 为编码区，共编码 364 个氨基
酸，分别在第 125、188、227 和 283 位置出现半胱氨酸残基，含有两对链内二硫键。氨基酸同源性分析显示，SLA-2-TPK与其他
SLA-2、SLA-3 和 SLA-1 序列的同源率分别为 86. 0% － 98. 9%、85. 0% － 89. 4%和 84. 2% － 91. 7%。系统进化树显示，SLA-2-
TPK与韩国品系猪 DQ883211 遗传距离较近;各功能区分析，SLA-2-TPK 与人 HLA-A2 和小鼠 H-2K 分子结构相似，且保留了
人 HLA-A2 基因的部分功能位点。结果表明，SLA-2-TPK是典型的 SLA-2 等位基因，在进化程度上接近于部分韩国品系猪。
关键词: 托佩克猪 SLA-2 基因 克隆 功能区 生物信息学
Cloning of the SLA-2 Gene from TOPIGS Pig and Analysis Its
Functional Domain by Bioinformatics
Bai Jing1 Xu Chongbo1 Zhang Qiang2 Gao Fengshan1，2
(1Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Dalian University Bioengineering College，Dalian 116622;
2The State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Veterinary Research Institute，
Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046)
Abstract: In order to study the function of SLA-2 gene for TOPIGS pig，a pair of primers were designed to amplify the whole cD-
NA of SLA-2 from TPPIGS pig and then the genetic characterization of the interest gene was analyzed by computer. After cloning，se-
quencing and analyzing by computer，SLA-2-TPK was 1 119 bp and the 3 － 1 097 site was the ORF domain which coded for 364 amino
acids with two sets of disulfide bond in intro-chain constituted by four cysteines situated in 125，188，227 and 283 sites. The amino acid i-
dentical ratios between SLA-2-TPK and other SLA-2，SLA-3 and SLA-1 alleles were 86. 0% － 98. 9%，85. 0% － 89. 4% and 84. 2% －
91. 7%，respectively. The phylogenetic tree of the SLA-2-TPK demonstrated that it was close to some breeds of swine in Korean，such
as DQ883211. Besides，the SLA-2-TPK was similar to the HLA-A2 and H-2K in functional domains and it preserved some functional
sites of HLA-A2. The results indicated that SLA-2-TPK was a typical SLA-2 allele that might be closely relative to some breeds of
swine in Korean.
Key words: TOPIGS pig SLA-2 gene Cloning Functional domain Bioinformatics
收稿日期:2011-03-01
基金项目:国家自然科学基金项目(30972169) ，家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金项目(SKLVEB2009KFKT007)
作者简介:白婧，女，硕士研究生，研究方向:动物分子免疫学;E-mail:baijing114@ 126. com
通讯作者:高凤山，男，博士，副教授，研究方向:基因工程与动物分子免疫学;E-mail:gfsh0626@ 126. com
托佩克种猪是 20 世纪 60 年代由世界第二大种
猪公司荷兰托佩克国际种猪公司培育的达兰猪。这
种猪生长快、抗病力强、遗传性能稳定，是目前欧美
“当家”猪种，80 年代，该品系猪引入中国，并且由于
其优良的特性迅速在国内市场上占领了一席之地。
然而，到目前为止，关于该品系猪的分子遗传背景未
见报道。
猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)I
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
类分子是代表基因分子遗传特征的重要功能基因，
分别称为 SLA-1(PD1)、SLA-2(PD14)和 SLA-3
(PD7) ，也分别称为 SLA-C、SLA-B 和 SLA-A［1］。其
中，SLA-2 在信号肽的起始部位比 SLA-1 和 SLA-3
多 3 个氨基酸残基［2，3］。SLA-2 基因可以代表猪的
分子进化标志，目前多个品系猪的 SLA-2 等位基因
已经克隆并提交到在 DDBJ /EMBL /GenBank。目前
国内外还未报道该品系猪 SLA-2 的基因序列及特
征。为了阐明该品系猪 SLA-2 基因特征，本研究采
用 RT-PCR方法克隆了托佩克猪 SLA-2 基因，并分
析了其在整个脊椎动物谱系中的系统进化树，解析
了其分子特征，为进一步研究其遗传特征提供依据。
1. 1 材料与方法
1. 1 猪品种、载体及菌株
猪来源于山东某托佩克猪场。pMD18-T Vec-
tor，E. coli JM109，总核酸提取试剂盒 TRIZOL，反转
录试剂盒 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-) ，
DNA回收试剂盒 Agarose Gel DNA Purification Kit
Ver. 2. 0，EcoRⅠ及 Hind Ⅲ限制性内切酶均为
TaKaRa公司产品。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计 扩增猪 SLA-2 基因所用的引物:
参照 DDBJ /EMBL /GenBank基因库中猪 SLA-2 基因
序列(AF464049) ，采用 Oligo6. 0 软件设计引物。引
物 S1:5-AGATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAG-3，S2:
5-CAGTCCCCACAAGGCAGCTGTCTC-3。
1. 2. 2 RT-PCR 扩增猪 SLA-2 基因 称取约 100
mg猪脾脏组织，剪碎放入 1. 5 mL 的 Eppendorf 管
中，加入 300 μL的 TRIZOL，用研棒研磨直至形成匀
浆，再补加 TRIZOL 700 μL。然后按照试剂盒说明
进行总 mRNA的提取。最后分离的沉淀加入 20 μL
0. 1% DEPC 水溶解，在 60℃下孵育 5 min，－ 80℃
保存。
取 2 μL猪脾脏总 mRNA，分别加入 2 μL的 Oli-
go(dT ) (15T) (100 mol /L)、2 μL AMV buffer、4 μL
dNTP(2. 5 mol /L)、1 μL AMV(10 U) ，最后用 0. 1%
DEPC水补充至 20 μL，42℃作用 1 h进行反转录。
反转录后，取反转录第一链 cDNA 2 μL(约 0. 5
μg) ，加入 50 μL PCR 体系中，PCR 扩增程序:94℃
预变性 5 min;94℃ 1 min，65℃ 45 s，72℃ 1 min，30
个循环;72℃延伸 10 min，取出，－ 20℃保存［4］。
1. 2. 3 基因克隆 PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电
泳，用 DNA 回收试剂盒将扩增片段纯化后连接到
pMD18-T载体，4℃过夜，然后转化到感受态细胞 E.
coli JM109，涂布于含有 Amp、IPTG、X-gal的 LB平板
上，37℃培养过夜，蓝白斑筛选及酶切鉴定阳性
克隆。
1. 2. 4 基因序列测定与分析 将鉴定的阳性克隆
送上海生工(Sangon Inc. )测序，序列通过 SAKURA
系统登录入 DDBJ /GenBank。核苷酸及氨基酸的序
列比对采用 CLUSTALW法外加手动调整;氨基酸序
列的推导、比对采用 GENETYX version 9. 0(Software
Development Co. ，Ltd，Tokyo，Japan)及 DNAMAN
Version5. 2. 2(Lynnon BioSoft Co. ，Ltd) ，分子进化树
采用 DNAMAN 和 Mega2 软件(Mega software Co. ，
Ltd)的 Neighbor-joining法绘制。SLA-2 不同功能区
氨基酸的置换率分析参照 Tai 的方法进行［5］。SLA-
2-TPK基因各功能区功能位点的推测分析参照
Yang等［6］报道的方法进行。
2 结果
2. 1 SLA-2 基因的克隆
经过 RT-PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳，在 α 成
像仪下显示约 1 100 bp 的条带，产物命名为 SLA-2-
TPK(图 1)。SLA-2-TPK基因的序列经克隆、鉴定后
测序，序列通过 GENETYX 9. 0 分析，长度为 1 119
bp，3 － 1 097 为 ORF区，共编码 364 个氨基酸，分别
在第 125、188、227 和 283 位置出现半胱氨酸残基。
序列登录入 DDBJ /EMBL /GenBank(AB607801)。
2. 2 SLA-2-TPK基因与 SLA-I类分子序列比较
将 SLA-2-TPK 基因的序列与 DDBJ /EMBL /
GenBank上所有 SLA-2(SLA-B)基因的序列进行比
较，发现 SLA-2-TPK有特征性的氨基酸变异有 3 处，
分别是信号肽区 12(P /L) ，α2 区 185(R /Q /E)和
189(M/V)。SLA-2-TPK 的序列与 DDBJ /EMBL /
GenBank上 SLA-3(SLA-A)和 SLA-1(SLA-C)基因
序列进行比较，发现 SLA-2-TPK 比 SLA-3 和 SLA-1
等位基因群在起始密码子处多 3 个氨基酸。同源性
关系分析揭示，SLA-2-TPK 与其他 SLA-2、SLA-3 及
SLA-1 等位基因群的氨基酸同源率分别为 86. 0% －
98. 9%、85. 0% －89. 4%和 84. 2% －91. 7%。
431
2011 年第 8 期 白婧等:托佩克猪 SLA-2 基因克隆及功能区生物信息学分析
1． SLA-2-TPK基因 RT-PCR扩增结果;2． pMD18-T /SLA-2-TPK经 EcoR I ＆ Hind III 双酶切鉴定;M. DL2000 DNA ladder
图 1 PCR 扩增 SLA-2-TPK基因(A)及双酶切鉴定(B)
2. 3 SLA-2 等位基因系统进化树
根据猪 SLA-2各等位基因、部分 SLA-3 和 SLA-1
的代表性等位基因，以及代表主要脊椎动物分类的动
物全长 MHCⅠ类分子氨基酸序列(鹅 MHC I 为含完
整成熟肽的部分序列) ，用 DNAMAN和Mega2软件绘
制 SLA-2-TPK基因的分子进化树。结果(图 3)显示，
SLA-2-TPK(AB607801)与韩国系列品系猪的遗传距
离较近，如与韩国的 DQ883211 的遗传距离仅有
0. 011。与其他动物 MHCⅠ类基因相比，SLA-2-TPK
基因在系统进化关系上与牛最接近，其次为马、猴、黑
猩猩、人、兔、鼠、禽类(鸡、鹅)、两栖类(蛙)和鱼类
(斑马鱼、虹鳟鱼)。另据 KaKs_Calculator1. 2 软件分
析，SLA-2 等位基因各功能区非同义突变率 Ka 达
0. 97，同义突变率 Ks 达 1. 01，Ka /Ks 为 1. 04，说明
SLA-2功能区基因的置换受选择性压力作用。
2. 4 SLA-2-TPK基因各功能区主要功能位点推测
分析
SLA-2-TPK基因与 DDBJ /EMBL /GenBank 上有
代表性的鼠、人相应 MHC I 类等位基因进行比较，
分析各功能区的主要氨基酸的变化(图 4)。在信号
肽区，SLA-2-TPK 基因编码氨基酸与 H-2K1、HLA-
B15 及 HLA-A2 的氨基酸差异很大，其差异氨基酸
分别达到了 12、9 和 11。α1 和 α2 区是抗原多肽结
合的主要区域，比较发现，SLA-2-TPK 保留了人
HLA-A2 与抗原多肽结合的 8 个关键性氨基酸中的
7 个，即 Y7、Y59、Y84、T143、K146、Y159 和 Y171，而
在 147 位由 Arg(R)变为 Trp(W)［7］。在 α1 和 α2
区 HLA-A2 与 β2m 结合的 19 个氨基酸中，SLA-2-
TPK保留了其中的 13 个;在 3 个关系到 HLA-A2 与
CD8 分子结合的关键性氨基酸，即 Gln115(Q)、Asp122
(D)和 Glu128(E)［8］，SLA-2-TPK 在相应位置保持了
一致。α3 区，199 － 205、211 和 221 位是 MHC I 类
分子与 CD8 分子结合的必需氨基酸［9，10］，SLA-2-
TPK发生了两个必需氨基酸的变异，在 199 位(V /
A)和 211 位(K /A) ;相对于 H2-K1、SLA-2-TPK的变
异位点为 211(K /A) ;相对于 HLA-B15，变异位点为
199(V /A)和 211(K /A)。在 α3 区 HLA-A2 与 β2m
结合的氨基酸中，SLA-2-TPK 几乎保留了其中所有
的氨基酸残基。在细胞质区和穿膜区，SLA-2-TPK
与 HLA-A2、H2-K1 和 HLA-B15 的氨基酸变异程度
要远远大于其他区域。
3 讨论
SLA-2 为猪 SLA-I 的一个基因座，它与 SLA-3
和 SLA-1 共同构成 SLA-I 类分子的 3 个功能基因
座，其中，SLA-2 在基因特征上与 SLA-3 和 SLA-1 相
比有明显的特征，即在信号肽起始密码子处比后两
者多 3个氨基酸［3］;目前，国内外已经克隆了几十个
品系猪的 SLA-2等位基因，并已提交到 DDBJ /EMBL /
GenBank，然而对于我国从荷兰引进的优良品系猪的
SLA-2等位基因仍未见报道，对其分子遗传背景更不
清楚。本研究以托佩克猪为研究对象，从脾脏克隆了
其 SLA-2等位基因，即 SLA-2-TPK。序列测定证实，
531
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
SLA-2 分为 6 个区:信号肽区:1 － 24 aa;α1 区:25 － 114 aa;α2 区:115 － 206 aa;α3 区:207 － 298 aa;;跨膜区:299 － 335 aa;胞质区:
336 － 364 aa;－代表相同氨基酸;* 代表 SLA-2 下一个功能区的位置
图 2 SLA-1-TPK与 DDBJ /EMBL/GenBank上其它 SLA-2 的多重序列比较
631
2011 年第 8 期 白婧等:托佩克猪 SLA-2 基因克隆及功能区生物信息学分析
猪 SLA-2，SLA-1，SLA-3 各等位基因的命名为基因名称加“-”族系 /-单倍型“-”基因登录号表示;其他动物的命名用动物的名称加
“-”加基因登录号表示
图 3 SLA-2-TPK系统进化树
731
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
左侧为 4 个比较的氨基酸序列:SLA-2-TPK(AB607801)、H-2K1(P04223)、HLA-B15(CAC33086)、HLA-A2(K02883) ，序列上面和下
面数字分别显示 SLA-2-TPK及其他各序列氨基酸从 α1 区开始计算，序列右边的数字表示各序列从信号肽开始计算，* 为缺失，
-为相同的氨基酸，#与抗原多肽结合的 8 个关键性氨基酸残基，p为人(HLA-A2)与抗原多肽结合的相关氨基酸残基，b为 HLA-A2
与 β2m结合的氨基酸残基，=为 β片层，# 为 α螺旋，HLA-A2 下面的数字 1，2，3，8 表示人 HLA-A2 的链间结构(1 与 α1 接触，2 与
α2 接触，3 与 α3 接触，8 与 CD8 接触)
图 4 猪 SLA-2-TPK(AB607801)等位基因各功能区与鼠 H-2K及人 HLA-A2、HLA-B15 的比较
该克隆基因全长为 1 119 bp，其中 3 － 1 097 为编码
区，编码 364 个氨基酸;SLA-2-TPK推导的氨基酸序
列在 125、188、227 和 283 处有 4 个半胱氨酸残基，
推测其含有两对链内二硫键。经氨基酸序列比较，
SLA-2-TPK与 SLA-2、SLA-3 和 SLA-1 等位基因群的
氨基酸同源率分别为 86. 0% － 98. 9%、85. 0% －
89. 4%和 84. 2% － 91. 7%，而且该基因在信号肽起
始密码子处比 SLA-3 和 SLA-1 多 3 个氨基酸，说明
SLA-2-TPK属于典型的 SLA-2 基因。
经过与 45 类 SLA-2 等位基因、两类有代表性的
SLA-3、1 类有代表性的 SLA-1 及其他脊椎动物包括
哺乳动物(牛、兔、马等)、灵长类动物(猴、黑猩猩)、
人、两栖动物(蛙)及鱼类 MHC I等位基因氨基酸比
较，绘制系统进化树，发现 SLA-2-TPK 在遗传关系
831
2011 年第 8 期 白婧等:托佩克猪 SLA-2 基因克隆及功能区生物信息学分析
上与韩国部分品系猪的遗传关系较近。与其他动物
MHCⅠ基因相比，SLA-2-TPK 在系统进化关系上与
牛最接近，其次为马、猴、黑猩猩、人、兔、鼠、禽类
(鸡、鹅)、两栖类(蛙)、鱼类(斑马鱼、虹鳟鱼)。结
果说 明，托 佩 克 猪 在 遗 传 关 系 上 与 韩 国 的
DQ883211、DQ992497 等可能来源于共同的祖先品
系。这样在今后的遗传育种中可以避免近亲繁育。
另据 KaKs_Calculator1. 2 软件分析，SLA-2 等位基因
各功能区非同义突变率 Ka 达 0. 97，同义突变率 Ks
达 1. 01，Ka /Ks 为 1. 04，说明 SLA-2 功能区基因的
置换受选择性压力作用，同时也说明 SLA-2-TPK 基
因从一定程度上可以反映该品系猪的分子进化
特征。
目前，关于猪的 SLA-I 类分子的晶体结构还未
报道，其详细的蛋白分子二级结构及三级结构(3D)
数据缺乏。本试验参照人的 HLA-A2 分子解析的晶
体结构数据，将 SLA-2-TPK 基因与人的 HLA-A2、
HLA-B15 和小鼠 H-2K1 进行比较，推测其可能的功
能位点。比较发现，在 α1 和 α2 区，SLA-2-TPK保留
了 HLA-A2 与抗原多肽结合的 8 个保守氨基酸残基
中的 7 个，而在胞外区的 147 位出现了氨基酸位点
的变异，即由 Arg变为了 Trp。保留共同的抗原结合
位点提示猪和人之间在递呈抗原肽过程中可能存在
交叉。而变异位点的存在又提示 SLA-2-TPK 在递
呈人源多肽时，其识别位点存在差异。在 α1 和 α2
区 HLA-A2 与 β2m 结合的 19 个氨基酸中，SLA-2-
TPK保留了其中的 13 个;在 3 个关系到 HLA-A2 与
CD8 分子结合的关键性氨基酸，即 Gln115(Q)、Asp122
(D)和 Glu128(E)［8］，SLA-2-TPK 在相应位置保持了
一致，该结果也在一定程度上证明 Chardon 等［3］报
道人的 CD8 +细胞可以直接识别猪的 SLA-1 类分子
的结论是正确的。另外，根据 SLA-2-TPK 基因还具
有 HLA-A2 识别 CD8 分子的关键位点，并且和鼠的
相应位点高度同源，推测托佩克猪与人及鼠的 TCR
可以进行一定的交叉识别［8］。
参 考 文 献
［1］Gao FS，Fang QM，Li YG，et al． Reconstruction of a swine SLA-I pro-
tein complex and determination of binding nonameric peptides de-
rived from the foot-and-mouth disease virus． Vet Immunol Immuno-
pathol，2006，113(3-4) :328-38．
［2］ Chardon P，Renard C，Gaillard CR，et al． The porcine major histo-
compatibility complex and related paralogous regions:a review． Genet
Sel Evol，2000，32(2) :109-28．
［3］Chardon P，Renard C，Vaiman M． The major histocompatibility com-
plex in swine． Immunol Rev，1999，167(1) :179-92．
［4］高凤山，姜平，李新生，等．我国巴马小型猪 SLA-2 基因克隆及分
子特征．微生物学通报，2007，34(4) :686-90．
［5］Wu TT，Kabat EA． An analysis of the sequences of the variable re-
gions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their im-
plications for antibody complementarity． J Exp Med，1970，132(2) :
211-50．
［6］ Yang TY，Hao HF，Jia ZH，et al． Characterisation of grass carp
(Ctenopharyngodon idellus)MHC class I domain lineages． Fish
Shellfish Immunol，2006，21(5) :583-91．
［7］Matsumura M，Fremont DH，Peterson PA，et al． Emerging principles
for the recognition of peptide antigens by MHC class I molecules．
Science，1992，257(5072) :927-34．
［8］Meyer-Olson D，Brady KW，Bartman MT，et al． Fluctuations of func-
tionally distinct CD8+ T-cell clonotypes demonstrate flexibility of the
HIV-specific TCR repertoire． Blood，2006，107(6) :2373-83．
［9］Salter RD，Benjamin RJ，Wesley PK，et al． A binding site for the T-
cell co-receptor CD8 on the alpha 3 domain of HLA-A2． Nature，
1990，345(6270) :41-6．
［10］Sun J，Leahy DJ，Kavathas PB． Interaction between CD8 and major
histocompatibility complex(MHC)class I mediated by multiple con-
tact surfaces that include the alpha 2 and alpha 3 domains of MHC
class I． J Exp Med，1995，182(5) :1275-80．
(责任编辑 马鑫)
931