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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
烟草赤星病是烟草生产上威胁最大的病害之一，
由半知菌属的赤星病菌（Alternaria alternate）感染烟
草引起，主要发生在烟叶成熟后期，该病潜育期短、
流行速度快，在环境条件适宜的情况下，短时间内
即可造成大流行，给烟叶生产带来巨大损失［1］。
目前，烟草赤星病的综合防治研究中，主要对
烟草进行了诱导寄主抗病性、转基因抗病育种、化
学药剂等方面的研究。而国内主要采用的方法还是
化学防治，不仅会污染环境，降低烟草质量，还导
致病菌的抗药性不断增强使防效下降［2］。从天然资
源中寻找活性物质代替化学农药和使用天然抗菌化
收稿日期 ：2013-03-25
基金项目 ：泰山医学院面上基金项目
作者简介 ：廉立慧，女，硕士，讲师，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：18200038@qq.com
烟草赤星病菌拮抗性放线菌 Q14 的筛选及鉴定
廉立慧 高丽君 杨娜 王涛 张显忠
（泰山医学院，泰安 271000）
摘 要 ： 烟草赤星病对烟草生产威胁极大，旨在通过筛选拮抗菌为烟草赤星病菌的生物防治提供新的选择。采用平板分离
培养、对峙平板法、16S rDNA 系统发育分析等方法。结果显示，从茄子根围土壤中分离到 36 株放线菌，以烟草赤星病菌为目标菌，
采用对峙平板法测定，筛选到 6 株有拮抗活性菌株，占所分离总数的 16.67%。其中 Q14 对烟草赤星病菌的拮抗作用最强，抑菌带
宽为 14.5 mm，并且对黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌也有较强的拮抗作用。通过对菌株 Q14 的形态观察培养特征生理生化反应和
16S rDNA 测定（GenBank 登录号 KC675186），将其鉴定为多产色链霉菌。分离获得的一株多产色链霉菌拮对烟草赤星病有较好的
拮抗作用，目前国内尚属首次报道，对烟草赤星病生物防治又提供了新的选择。
关键词 ： 烟草赤星病菌 拮抗性放线菌 多产色链霉菌
Screening and Identification of Actinomyces Q14 Antagonistic Against
Alternaria Alternata
Lian Lihui Gao Lijun Yang Na Wang Tao Zhang Xianzhong
（Taishan Medical College，Taian 271000）
Abstract: It was to screen the new antagonistic actinomyces against Alternaria alternata. Totally 36 strains of actinomycetes were
obtained from eggplant roots. By dual culture on PDA plates, it was found that 6 strains（16.67% of total isolates）of actinomycetes showed
satisfactory antagonistic effects to Alternaria alternate. Among them, strain Q14 exhibited the strongest antibiosis capacity with an inhibitory
zone of 14.5 mm, and also showed good antagonistic effects to Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.
Strain Q14 was identified as Streptomyces polychromogenes according to its 16S rDNA sequence（GenBank acc. No. KC675186）analysis, and
the morphological, physiological and biochemical characteristics.
Key words: Alternaria alternate Antagonistic actinomycetes Streptomyces polychromogenes
合物保护作物已成为当前研究的重点［3］。本试验用
对峙平板法，从茄子的根围土壤中分离到的几株拮
抗性放线菌的抑菌作用，选择其中一株拮抗性最强
的放线菌，对该菌株的形态学、分子生物学等方面
进行分析，阐明其分类地位，旨在为烟草赤星病菌
的防治提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 供试放线菌 ：分离自茄科植物茄
子根围土壤。供试病原菌：烟草赤星病菌（Alternaria
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期128
alternate）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.
cucumerinum）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici）均由本实验室保存。
1.1.2 培养基及主要试剂 放线菌保存培养基 ：高
氏 1 号固体培养基 ；基础发酵培养基 ：高氏 1 号液
体培养基 ；杯碟法和琼脂块法所用培养基 ：PDA 培
养基（自然 pH）；形态学和培养特征观察所用培养
基参考文献［4］。
DNA 提 取 所 用 试 剂 ：洗 涤 液（50 mmol/L Tris
pH7.7，25 mmol/L EDTA，0.1% PVP）；裂解液（50
mmol/L Tris pH8，25 mmol/L EDTA，3% SDS，1.2%
PVP）；抽 提 液（10 mmol/L Tris pH8，1 mmol/L ED-
TA，0.3 mol/L NaAC，1.2% PVP）；Tris-平衡酚，氯仿 -
异戊醇（25∶24），异丙醇，70% 乙醇，TE。
电泳所用试剂 ：琼脂糖，Loading bufer，DL2000
DNA Marker，Goldview Ⅰ型核酸染料 ；PCR 所用试
剂：ddH2O，dNTP Mixture（2.5 mmol/L），TaKaRa Taq
（5 U/μL）；PCR Buffer（10×）试剂，具体配置方法
参阅文献［5］。
1.2 方法
1.2.1 土壤放线菌的分离［6］ 采集健康茄子根围土
壤，装入灭菌纸袋，带回实验室，进行分离。称取
5 g 土样，加入含 45 mL 无菌水的三角瓶中，混匀后，
28℃，180 r/min 摇床振荡 30 min，然后静置 5 min
自然沉淀，吸取上清菌悬液 1 mL 至含 9 mL 无菌水
试管中，依次作 10 倍系列稀释至适宜浓度（通常至
10-1-10-5），吸 0.1 mL 菌悬液至待分离的高氏一号培
养基平板表面，涂布均匀，28℃培养 1 周后，根据
放线菌的菌落形态，分别挑取单菌落，用平板划线
法进一步分离纯化。移单菌落于斜面上，28℃培养
后保存待用。
1.2.2 放线菌的拮抗作用检测 参照平板对峙法［7］，
将放线菌接种于高氏一号平板上于 28℃下培养 7 d，
用打孔器将菌苔打成直径 5 mm 的菌饼置于 PDA 平
板中间，3 d 后将同样大小病原真菌菌饼对峙接于放
线菌周边，28℃下培养，观察是否产生抑菌圈，定
期观察、测量抑菌圈的大小，凡抑菌圈直径≥ 10
mm 的归入有很强抑制作用的类群，6 mm ≤抑菌圈
直径 <10 mm 的则归入有较强抑制作用的类群。
1.2.3 拮抗菌株的鉴定 形态特征和培养特征观察
将待测放线菌于划线接种于高氏一号培养基上，采
用插片法［8］ 将灭菌的盖玻片斜插入培养基内，28℃
培养 10 d 后，取出盖玻片在显微镜下观察菌体的形
态特征。采用《链霉菌鉴定手册》［9］提供的方法，
将菌株分别接种在 PDA、高氏一号琼脂、察氏琼脂
等培养基上，28℃培养 8-15 d，观察基内菌丝、气
生菌丝的生长状况和可溶性色素的颜色。
生理生化特性测定 ：测定菌株牛奶凝固、淀粉
水解、明胶液化、纤维素分解及 H2S 的产生以及碳
源利用等生理生化特性［9］。
分子生物学鉴定 ：基因组 DNA 采用微波法［10］
进行提取。根据 Lane（1991）扩增的上游引物 5-G-
GTTACCTTGTTACGACTT-3 和下游引物 5-AGAGT-
TTGATCCTGGCTCAG-3，使用 PCR 仪扩增 16S DNA，
并测序。PCR 反应程序 ：94℃预变性 3 min ；94℃变
性 30 s，56℃退火 40 s，72℃延伸 90 s，共循环 30
次 ；然后 72℃保持 10 min。用凝胶回收纯化试剂盒
回收扩增到的目的片段，连接到 pMD18-T 载体上，
挑取转化子测序。 测序由上海生工完成。所得的
16S rDNA 序列与 GenBank 数据库中的已知序列进
行 BLAST 比对，获取与试验菌株相似的典型菌株的
16S rDNA 序列，选定几株典型链霉菌的 16S rDNA
序列，采用 MEGA3.1 软件构建系统发育树。
2 结果
2.1 放线菌分离与拮抗菌株筛选
通过梯度稀释法从茄子根围土样中筛选出 36 株
放线菌分离物。通过对这 36 株茄子根围放线菌与烟
草赤星病菌的平板对峙试验显示，共有 6 株有拮抗
性的放线菌，其中菌株 Q1 和菌株 Q3 对烟草赤星病
有较强抑制作用，菌株 Q14 对烟草赤星病有很强抑
制作用，抑菌直径达到 14.5 mm（图 1）。同时测定了
菌株 Q14 对黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的抑菌试
验，它们的抑菌直径分别达到 12.2 mm 和 11.8 mm。
2.2 菌株Q14的鉴定结果
2.2.1 形态特征和培养特征观察 在显微镜下（图
2）观察，气生菌丝较粗，有横隔，基内菌丝体纤
细，无横隔多分枝，孢子丝丛生。孢子椭圆形、柱
形，表面光滑。菌株 Q14 在不同培养基上培养结果
2013年第10期 129廉立慧等 ：烟草赤星病菌拮抗性放线菌 Q14 的筛选及鉴定
（表 1）显示，在高氏一号培养基上生长旺盛，菌落
紧密，突出、茸毛状，气生菌丝粉白至淡紫红色，
基内菌丝浅黄，产浅黄色色素。在马铃薯葡萄糖琼
脂基丝丰茂，气丝白色。
上，序列号为 KC675186。序列与 GenBank 中相关序
列 Blast 比对。比对结果显示，该放线菌与数据库中
链霉菌属大多数菌株序列亲缘性大于 98%，与多产
色链霉菌（S.polychromogenes）序列同源性达 100%。
采用 MEGA3.0 软件以链霉菌属中相近序列构建系统
发育树（图 3）。结合形态学特征，初步鉴定该菌属
于多产色链霉菌。
图 1 拮抗性放线菌 Q14 对烟草赤星病菌的抑制效果
图 2 光学显微镜下菌株 Q14 菌丝及孢子丝形态（1 000×）
表 1 菌株 Q14 在不同培养基上的培养特征
培养基 气生菌丝 基内菌丝 可溶性色素
高氏一号琼脂 粉白至淡紫红色 淡黄色 淡黄色
葡萄糖酵母膏琼脂 淡黄色 淡黄色 淡黄色
马铃薯葡萄糖琼脂 白色 灰色 无
马铃薯块 白色 灰色 无
察氏琼脂 浅灰色 浅灰色 无
2.2.2 生理生化特征 生理生化测定结果显示，菌
株 Q14 能使淀粉水解、产生硫化氢、牛奶凝固、明
胶液化、可以分解纤维素。对碳源的利用结果表明，
菌株 Q14 可以利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、
乳糖、淀粉和山梨糖。不利用鼠李糖、肌醇、D-甘
露醇。
2.2.3 分子生物学鉴定 菌株 Q14 的 16S rDNA 序
列测定结果共有 1 393 个碱基将结果提交 GenBank
Q14
Streptomyces polychromogenes EU570719
Streptomyces polychromogenes AB184292
Streptomyces lincolnensis EU841609
Streptomyces roseochromogenus GU350506
Streptomyces avermitilis DQ768097
Streptomyces kunmingensis EU841691
Streptomyces avermitilis AB184632
0.002
3 讨论
放线菌作为一类能够产生抗菌素，分布广、数
量多，易分离培养的微生物，其中许多种类是生防
微生物的重要来源。近年来，有关土壤中拮抗性放
线菌对植物病原菌的防治已有较多报道［11，12］。陈国
康等［13］就是从烟草根围土壤中分离筛选到 10 株对
烟草青枯病菌和黑胫病菌有非常强的拮抗作用的放
线菌。
本试验试通过从茄子根围土壤中分离放线菌，
来研究对烟草赤星病的拮抗作用。共筛选到了 5 株
对烟草赤星病有拮抗作用的放线菌，占总株数的
16.7%，其中一株对烟草赤星病菌拮抗作用最强的放
线菌经过鉴定为多产色链霉菌。而且此菌株对黄瓜
枯萎病菌、番茄枯萎病菌也有较强的抑制作用。目
前鲜有这方面的报道，国内只有一例关于多产色链
霉菌对烟草青枯病病原菌青枯罗尔氏菌具有拮抗作
用的报道［14］。
本试验在筛选过程中，方法比较传统，以后分
离筛选的试验中，将采用特殊的具有高度选择性的
分离条件，以增加发现新菌株的几率。而且对于拮抗
放线菌的生防效果还需通过下一步离体防效和田间
小区防治试验［15］。同时控病机理也待进一步的研究。
4 结论
从茄子根围土壤中一共分离筛选到了 5 株对
图 3 依据菌株 Q14 的 16S rDNA 序列系统发育树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期130
烟草赤星病有拮抗作用的放线菌，其中一株对烟草
赤星病菌拮抗作用最强的放线菌经过鉴定为多产色
链霉菌（GenBank 序列号为 KC675186），而且此菌
株对黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌也有较强的抑制
作用。
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（责任编辑 马鑫）