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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
白喉杆菌（Corynebacterium diphtheriae）是引起
小儿白喉的病原菌，属于棒状杆菌属（Corynebacte-
rium），其生长周期短，繁殖速度快［1］。其致病物质
主要是白喉毒素，白喉毒素以分泌型表达方式存
在于胞质外，本试验所采用菌株为白喉杆菌 ATCC®
27010TM［2］，不产生白喉毒素，且胞质外的分泌杂蛋
白含量极小，对纯化十分有利，因此可将其应用于
疫苗发酵生产中作为白喉毒素突变体（CRM197）的
收稿日期 ： 2013-08-23
作者简介 ：朱涛，男，博士，教授，研究方向 ：疫苗研发 ；E-mail ：554810422@qq.com
白喉毒素突变体 CRM197 在白喉杆菌中的表达纯化
朱涛  邓立功  段磊  常云松  邵忠琦  毛慧华  宇学峰
（天津科技大学，天津 300457）
摘 要 ： CRM197 是一种白喉毒素突变体，第 52 位的甘氨酸突变为谷氨酸，作为载体蛋白广泛用于疫苗开发。将阐述一种
新的生产 CRM197 方法。将合成的 CRM197 基因片段克隆到表达载体 pCKM4.1 中，表达质粒 pCKM5.1 电转化至大肠杆菌 E. coli
S17-1 中，通过结合转移转化至白喉杆菌（ATCC® 27010TM 的白喉杆菌）中，载体上的导肽序列可以使得 CRM197 作为可溶性蛋白
分泌到胞外表达，CRM197 蛋白可占到菌体总蛋白的 70%。增强对铁的调控，进一步优化培养基及发酵条件以提高产量。经过 Q 膜、
硫酸铵沉淀、阴离子交换纯化步骤获得纯度达到 95% 的 CRM197 样品，提高了蛋白得率，节约了纯化时间和成本。
关键词 ： CRM197 白喉杆菌 接合转移 可溶蛋白 铁调控 阴离子柱
Expression and Purification of the Diphtheria Toxin Variant CRM197
in Corynebacterium diphtheriae
Zhu Tao Deng Ligong Duan Lei Chang Yunsong Shao Zhongqi Mao Huihua Yu Xuefeng
（Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）
Abstract:  The CRM197 protein is a variant of the diphtheria toxin（DTx, 58 kD）characterised by a single mutation（i.e. a glycine-
glutamic acid substitution in position 52）that reduces its toxicity. The protein nonetheless retains the same inflammatory and immunostimulant
properties as thediphtheria toxin, and it is widely used as a safe carrier in conjugatedvaccines. A new and alternative procedure for the
production of full-length CRM197 in Corynebacterium diphtheriae was proposed. The gene of CRM197 was synthesized and then expressed in
Corynebacterium diphtheriae. Expression vector pCKM5.1 was first electrotransformed into Escherichia coli-s-17, reisolated, and subsequently
transferred into the C. diphtheriae recipient strain by conjugation. The procedure involved the use of a modified non-deferrated growth medium
that allowed for fast growth of bacteria and enhanced toxin production as a result of concomitant iron depletion. The CRM197 products are
secreted into the culture medium as soluble body, accounting for around 70% of the total cellular protein, then recovered by filtering or
precipitation, and subsequently purified using anion-exchange chromatographic method. The purity of the final preparation reached 95% and its
biological properties is maintained. Consequently, the procedure could be suitable for a large-scale industrial production.
Key words:  CRM197 Corynebacterium diphtheriae conjugation Soluble body Depletion of iron Anion-exchange chromatograph
生产工程菌株［3，4］。
白 喉 毒 素（Diphtheria toxin，DT） 是 由 感 染 β
噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的分子量为
58342 Da 的外毒素，它通过灭活真核细胞的肽链延
伸因子Ⅱ（EP2），阻断细胞蛋白合成，导致细胞死
亡［5］。CRM197（Cross-reacting forms of toxin 197）是
一种白喉毒素突变体，具有其全长序列，由于白喉
毒素 52 位 Gly 突变为 Glu，丧失了毒素的毒性及酶
2014年第3期 183朱涛等 ：白喉毒素突变体 CRM197 在白喉杆菌中的表达纯化
活性，仍具有较强免疫能力，在载体蛋白方面前景
广阔［6-8］。
目前大多用于 CRM197 发酵生产的表达体系有
大肠杆菌，植物细胞等，其缺点是杂蛋白含量较高，
多为胞内或包涵体内表达，对于后期的纯化工艺需
要很高的时间和人力，物力成本［9］；而分泌型的表
达系统的建立多需要引导肽的引入，但往往其要求
与抗原蛋白融合表达，则需要在后期工艺中对引导
肽进行切除处理，增加了工艺的复杂度和操作的难
度。至今未有报道利用白喉杆菌携带可复制质粒用
于抗原表达的研究和应用。本研究采用白喉杆菌表
达系统表达 CRM197 天然序列蛋白，将更具工业应
用价值，以建立一种简单、高效、安全的 CRM197
表达体系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与菌株 穿梭整合载体 pCKM4.1（具有
在白喉杆菌中稳定复制的复制起点 DNA 序列，因
而可以使得表达载体在白喉杆菌中稳定复制，同时
具有能表达导肽蛋白序列的 DNA 序列可以使得表
达的 CRM197 重组蛋白进行分泌表达并分泌到胞
外）本实验室保存。具有编码 CRM197 基因的白喉
杆菌（ATCC® 39255TM）、表达菌株白喉杆菌（ATCC®
27010TM）购自 ATCC。T 载体 pEASY-T1 simple 和大
肠杆菌 DH5α 购自北京全式金生物技术有限公司。
1.1.2 酶及主要试剂 酶及主要试剂 Xho I、Nhe I、
Bgl II、Sal I、T4 DNA Ligase 购 自 NEB 公 司。450
nm 硝酸纤维素微孔滤膜 上海兴亚净化材料厂。
1.2 方法
1.2.1 CRM197 基因 PCR 扩增 以白喉杆菌（ATCC®
39255TM）基因组 DNA 为模板，用分别带有酶切位
点为 Sal I 和 Xho I 设计引物序列（下划线部分为插
入的酶切位点）：
Sense（Sal I）：5-GTCGACTCTAGATGGCCCCC
TTTGGTTGAGATG-3
Antisense（Xho I）：5-CTCGAGCATTCCGGAAC-
CGTTCGGCTTAC-3，
PCR 反应程序如下 ：（1）95℃，3 min ；（2）
98℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，30 循环 ；（3）
72℃，2 min。反应结束后，PCR 产物经琼脂糖凝胶
电泳回收纯化。
1.2.2 CRM197 表达载体构建 经纯化回收的 PCR
产物通过 T/A 克隆连接于 T 载体 pEASY-T1 simple
上，转化大肠杆菌 DH5α 中，挑取阳性克隆提取质粒，
通过 Xho I 和 Sal I 双酶切将目的基因 CRM197 切下
插入到 pCKM4.1 中的 Sal I 位点上，得到重组质粒
pCKM4.1- CRM197，并命名为 pCKM5.1，转化大肠
杆菌 DH5α，挑取阳性克隆并提取质粒，进行酶切
和基因测序鉴定。
1.2.3 CRM197 的表达
1.2.3.1 接合转移 将带有 CRM197 的目的质粒 pC-
KM5.1 转化进入 E. coli S17-1。得到的转化子用作接
合转移供体菌菌株，接种于 5 mL LB 培养基（含有
30 μg/mL 卡那霉素）中，37℃培养至 OD600= 0.4-0.6；
同时作为受体菌的白喉杆菌（ATCC® 27010TM）菌
株，接种于 5 mL BHI 培养基中，37℃培养至 OD600=
1.2-1.5。用等体积新鲜的 LB 洗涤供体菌体 2 次（洗
掉抗生素），用 0.5 mL 的新鲜 LB 培养基悬浮大肠杆
菌细胞备用。取 1 mL 白喉杆菌，60℃水浴热激处理
45 s。将处理好的大肠杆菌和热处理后的白喉杆菌
混和，6 000 r/min 离心 3 min。弃去上清，用残留
的液体重新悬浮细菌沉淀，并将菌液涂布于直径为
2.5 cm 的 450 nm 硝酸纤维素膜（121℃ 30 min 灭菌
处理）上，将膜至于 BHI 平板（不含抗生素），37℃
培养 16-20 h ；将膜上菌用 0.5 mL 新鲜的 BHI 培养
基悬浮后涂布于 BHI 平板（含有 50 μg/mL 萘啶酮酸
和 30 μg/mL 卡那霉素）。将平板继续置于 37℃培养
2 d，观察接合转移子。
1.2.3.2 重 组 质 粒 pCKM5.1 在 白 喉 杆 菌（ATCC®
27010TM）中表达
（1）摇瓶发酵 ：将重组质粒 pCKM5.1 转入到表
达宿主白喉杆菌（ATCC® 27010TM）中，挑取转化子
接种于含 30 μg/mL 氨苄青霉素的 BHI 液体培养基 10
mL 中，37℃培养过夜，取出部分培养液保存于甘油
管（25% 甘油），-80℃保存。再转接于新鲜的 BHI
液体培养基 50 mL 中，37℃，250 r/min 培养至 A600
值为 6.0-8.0 时改变发酵温度为 30℃，并加入铁离
子使培养基中游离铁离子至终浓度为 0.1 g/L，发酵
至 OD600 =12-15 停止培养收集菌液，取样进行 SDS-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期184
PAGE 检测表达情况。多次重复上述试验，筛选表
达高的菌种保存并用于试验。该菌株接种振荡培养
至 OD600=6.0-8.0 时作为种子液，接入发酵培养基进
行发酵。
（2）50 L 发 酵 罐 发 酵 ：将 CRM197 白 喉 杆 菌
（ATCC® 27010TM） 工 程 菌 接 种 于 接 种 于 200 mL 白
喉 杆 菌 培 养 基（ATCC medium ：1417 Low Iron YC
medium）（含有 25 μg/mL 的卡那霉素）中，37℃，
250 r/min 摇床上培养待测定 OD600=4.0 左右后，转
接于 2 L 的发酵罐中，37℃条件控制下发酵培养至
OD600= 15 左右后，再次转入 50 L 发酵罐中，控制
pH7.4，37℃条件下发酵至 14 h，OD600 =15-20 时，
改变发酵温度为 30℃，并补加铁离子使培养基中游
离铁离子浓度为 0.1 g/L，发酵至 OD600 =20-40 停止
培养收集菌液，经高速离心后，收集上清（2 L 和
50 L 发酵罐中的发酵液均为白喉杆菌培养基。离心
收集上清，在 100 mL 离心上清中加入 45 g 硫酸铵，
4℃沉淀，离心收集沉淀，用 10 mL Tris-HCL pH8.0
缓冲液重悬后进行 SDS-PAGE 电泳分析。
1.2.4 CRM197 的 纯 化 及 鉴 定 将 30 L 离 心 上 清
经过 0.22 μm 无菌过滤后，通过 30 kD 超滤浓缩至
2 L，取样保留以备电泳检测，记为 A1。浓缩后使
用 10 L 的 10 mmol/L PB 缓冲液进行超滤，超滤至电
导为 9 mS/cm，最终超滤后体积为 2 L，将超滤液过
滤 Q 膜，取样保留以备电泳检测，记为 A2。过滤液
加入 850 g 硫酸铵后搅拌均匀，11 000 g 离心保留上
清，向上清中再继续添加 450 g 硫酸铵，搅拌均匀
后 11 000 g 离心弃上清获得沉淀。加入 1.5 L 的 10
mmol/L PB 缓冲液使沉淀复溶。复溶后溶液使用 10
L 的 10 mmol/L PB 缓冲液进行超滤，超滤至电导小
于 4 mS/cm，取样保留以备电泳检测，记为 A3。将
超滤液通过 0.22 μm 无菌过滤，取样保留以备电泳
检测，记为 A4。将过滤液过 DEAE 层析柱，先通过
0.1 mol/L NaCl 溶液洗脱去掉杂质，再利用 0.5 mol/L
NaCl 溶液洗脱得到目的蛋白 CRM197，取样保留以
备电泳检测，记为 A5 ；将得到洗脱峰中的目的蛋白
置换超滤至 5% 蔗糖溶液中，取样保留以备电泳检
测，记为 A6 ；将超滤液通过 0.22 μm 过滤，取样保
留以备电泳检测，记为 A7 ；最后过 50K 超滤去除降
解带记为 A8。将以上各步所留样品 SDS-PAGE 电泳
分析。同时使用 CRM197 的特异性抗体来验证蛋白
的准确性。取 20 mL 菌液上清经 45%（质量体积比）
硫酸铵沉淀，用 200 μL 10 mmol/LPB 缓冲液使沉淀
复溶，对复溶样品进行 SDS-PAGE 分析，然后电转
到硝酸纤维素膜上进行 Western blot 分析（一抗为兔
源的 CRM197 的多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物
酶标记的羊抗兔抗体，显色液为二氨基联苯胺），经
过 Western blot 分析，验证目标蛋白的准确性。
2 结果
2.1 CRM197 基因PCR扩增与表达载体构建
转 化 大 肠 杆 菌 DH5α， 挑 取 阳 性 克 隆 并 提 取
质粒，分别利用 Nhe I，Bgl II 和 Sal I 进行酶切鉴
定，其酶切鉴定图谱如图 1 所示。图 1 中泳道 1 为
Marker 1 k plus，泳道 2 为经 Nhe I 酶切重组质粒后
产生一条约 400 bp 的条带，泳道 3 为 Bgl II 和 Sal
I 双酶切重组质粒后产生一条约 600 bp 的条带。对
于酶切鉴定正确的重组质粒进行针对性测序，结果
表明插入的目的基因（CRM197 重组蛋白编码基因）
的核苷酸序列经分析与原序列 99% 吻合，其编码的
氨基酸序列 100% 吻合。
500
bp
1 2 3
1 ：DNA 分子量标准（1K plus）；2 ：pCKM5.1/NheI ；
3 ：pCKM5.1/Bgl II+Sal I
图 1 重组表达载体 pCKM5.1 酶切分析
2.2 CRM197的表达
挑选单菌落转化子做摇瓶试验摇瓶，取相同体
积的菌液上清 20 mL 经 45%（质量体积比）硫酸铵
沉淀，均用 200 μL 10 mmol/L PB 缓冲液使沉淀复
溶，分别取 20 μL 复溶物进行 SDS-PAGE 电泳。选
择最高表达菌株 5 用于试验。发酵收集菌体上清，
SDS-PAGE 检测结果（图 2）显示，转入重组质粒
的菌株总蛋白中出现一条分子量约为 58 kD 的蛋白
条带，与经氨基酸序列计算后的分子量相符。利
2014年第3期 185朱涛等 ：白喉毒素突变体 CRM197 在白喉杆菌中的表达纯化
用 Molecular imager Gel DocXR with Image lab Software
软件（Bio-Rad）分析证明其表达量约占细菌总蛋
白的 70%。说明携带有重组表达质粒的白喉杆菌
（ATCC®27010TM）菌株可以高效分泌表达 CRM197 蛋
白，可用于发酵生产或相应的疫苗制备工艺。用发
酵 罐 pCKM5.1/CRM197 白 喉 杆 菌（ATCC®27010TM）
工程菌株，绘制工程菌的生长曲线（图 3），在对数
生长期后期加入铁离子，约为培养 5 h。加入 2 h 后，
CRM-197 工程菌株的生长明显增加，加铁 4 h 后，
菌体浓度一直呈增长趋势。
94
kD
1 2 3 4 5
CRM19760
1 ：12-94 kD Marker ；2-5 ：不同转化子表达
图 2 不同转化子的 SDS-PAGE 图谱
2.3 CRM197的纯化及鉴定
将以上各步所留样品 SDS-PAGE 电泳分析检测，
结果利用 Molecular imager Gel DocXR with Image lab
Software 软件（Bio-Rad）分析表明纯化后 CRM197
蛋白的纯度高于 95%。CRM197 的理论分子量大小
应为 58 kD 左右，使用 CRM197 的特异性抗体来验
证蛋白的准确性，经过 Western blot 分析，在 58 kD
处同样出现一条特异性条带（图 4），此条带即为
24
21
18
15
12
O
D
60
0n
m
9
6
3
0
0 2 4 6 8 10 12ਁ䞥ᰦ䰤h14 16 18 20 22 24
图 3 白喉杆菌（ATCC® 27010TM）CRM197 工程菌的生长
曲线
CRM197
94
kD
60
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9
1-8 ：纯化过程各步样品 A1-A8 ；9 ：12-94 kD marker
图 4 纯化产品 SDS-PAGE 图谱
CRM197，就此验证了目标蛋白的准确性。
3 讨论
白喉毒素无毒变异体 CRM197，与白喉毒素相
比，不会对细胞产生毒性作用，但在抗原性和免疫
原性上仍与天然的白喉毒素保持一致，有良好的免
疫原性，且由白喉毒素获得白喉类毒素必须经过大
体积毒性物质脱毒处理，而且它可能发生毒性逆
转，恢复白喉毒素毒性［10］。目前还有用大肠杆菌系
统表达 CRM197 菌株［11］，表达 CRM197 均为包涵
体，表达量仅占到蛋白总含量的 20% 左右，而且纯
化还须经过变性、复性，对其制备产生严重制约，
不利于大规模工业生产。本试验利用基因工程技术
构建表达质粒在白喉杆菌（ATCC® 27010TM）中表
达 CRM197，同时表达载体上的能表达导肽蛋白的
DNA 序列可以使得表达的 CRM197 进行分泌表达并
分泌到胞外，经过 Q 膜、硫酸铵沉淀、阴离子交换
纯化步骤获得纯度达到 95% 的 CRM197，使得表达
的 CRM197 重组蛋白的纯化工艺进一步简化，既提
高了蛋白得率，又节约了生产时间和成本。CRM197
作为载体蛋白，现已成功研制了脑膜炎球菌结合疫
苗和小儿肺炎疫苗［10，12］，利用本实验室研究的表
达体系可进行大规模工业生产，提高 CRM197 产量，
使它为载体蛋白更加广泛的应用于疫苗研究和生产。
4 结论
本研究阐述了一种新的 CRM197 的生产方法，
在体外构建了表达 CRM197 质粒，并将其成功转
入白喉杆菌，利用白喉杆菌的高效表达系统表达
CRM197 蛋白 , 使其获得了高效表达，为其进一步生
产及应用奠定了基础。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期186
参 考 文 献
［1］ 朱万孚 , 庄辉 . 医学微生物学［M］. 北京 ：北京大学医学出版
社 , 2007 ：280-284.
［2］ Holmes RK, Barksdale L. Genetic analysis of tox+ and tox- bacterio-
phages of Corynebacterium diphtheriae［J］. Journal of virology,
1969, 3（6）：586-598.
［3］ Metcal, Benjamin J. Novel plasmid for production of CRM protein
and diphtheria toxin［P］. EP ：0616034, 1994-02-07.
［4］ Rappuoli R, Michel JL, Murphy JR. Integration of corynebacteriop-
hages beta tox+, omega tox+, and gamma tox-into two attachment
sites on the Corynebacterium diphtheriae chromosome［J］.
Bacterio, 1983, 153（3）： 1202-1210.
［5］ Choe S, Bennett M, Fujii G, et al. The crystal structure of
diphtheria toxin［J］. Nature, 1992, 357（6375）：216-222.
［6］ Cohn AC, MacNeil JR, Harrison LH, et al. Changes in Neisseria
meningitidis disease epidemiology in the United States［J］.
Clinical Infectious Diseases, 2010, 50（2）：184-191.
［7］ Wilde MI. The 26th International pediatric association congress of
pediatrics, Johannesburg, South Africa, 4-9 August 2010［J］.
Pediatric Drugs, 2011, 13（2）：125-127.
［8］ Giannin R, Rappuoli G. The aminoacid sequence of two non-toxic
mutants of diphtheria toxin ： CRM45 and CRM197［J］. Nucleic
Acids Research, 2009, 12（10）：4063-4069.
［9］ Rappuoli R, Monteriggioni Q. Process for producing proteins
correlated with the diphtheric toxin［P］. US ：4925792, 1984-01-
31.
［10］ Black S, Shinefield H, Fireman B, et al. Efficacy, safety and
immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in
children［J］. Pediatr InfectDis, 2000, 19（3）：187-195.
［11］ Stefan A, Conti M, Rubboli D, et al. Overexpression and
purification of the recombinant diphtheria toxin variant CRM197 in
Escherichia coli［J］. Journal of Biotechnology, 2011, 156（4）：
245-252.
［12］ Barrios C, Lussow AR, Embden JV, et al. Mycobacterial heat-
shock proteins as carrier molecules. II ： The use of the 70-
kDa mycobacterial heat-shock protein as carrier for conjugated
vaccinescan circumvent the need for adjuvants and Bacillus
Calmette Guérin priming）［J］. European journal of immunology,
1992， 22（6）：1365-1372.
（责任编辑 李楠）