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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 1期
白喉毒素突变体 CRM197在大肠杆菌中
表达纯化及性质研究
赵雪娜 董相陈 侯登勇 孙丽霞 王晶翼 王庆民
(齐鲁制药有限公司药物研究院,济南 250100)


摘
要:
CRM 197是一种白喉毒素突变体,作为载体蛋白广泛用于疫苗开发。将合成的 CRM 197基因片段克隆到表达
载体 pET25b中,转化大肠杆菌 BL21( DE3), 经 IPTG诱导, CRM197获得高效表达, 达到菌体总蛋白的 20%。目的蛋白主要以
包涵体形式存在, 变性、复性后经 DEAE阴离子交换、S
100分子筛纯化获得纯度高于 95%的 CRM197样品,用该蛋白样品免
疫新西兰大白兔, 免疫兔血清中检测到特异性抗体应答。急性毒性试验中,每只豚鼠皮下注射 200
g CRM 197纯化样品,未
出现明显毒性反应症状,与之相比较, 注射后 48 h内, 20 ng白喉毒素阳性对照组动物全部死亡。结果表明,利用本试验的表
达策略, CRM 197得到高效表达,并且具有良好的免疫原性和安全性, 为其进一步生产及应用奠定基础。
关键词:
CRM 197 白喉毒素 包涵体 免疫原性 急性毒性
Expression, Purification and Characterization of
CRM197 inEscherichia coli
Zhao Xuena Dong X iangchen H ou Dengyong Sun L ix ia W ang J ingy i W angQ ingm in
(T he R esearch and D evelopm ent D epartm ent, Q ilu Pharmaceutical Co. , Ltd. , J inan 250100)


Abstrac:t
CRM 197 ( cross reacting m ate rial 197), as d iphtheria tox in mutant, is be ing used as vaccine carrier mo re and m ore
comm on ly. In this resea rch, the gene o f CRM197 w as syn thesized and then expressed in E scherich ia co li BL21( DE3) dr iven by T7 pro

m oter. The recomb inant prote in was over expressed m a in ly as inc lusion body and accounted fo r a round 20% o f the tota l cell pro te ins.
A fter dena turation and renaturation, CRM 197 w as pur ified by DEAE an ion
exchange co lum n and S
100 m olecu lar siev e. The pur ified
prote in w as used to imm un ize New Zealand wh ite rabb its, and spec ific antibody response aga inst CRM197 w as obse rved. In acu te tox ic ity
experim ent 200
g pur ified CRM 197 w as subcutaneously in jected into guinea p igs. The recom binant CRM 197 w as still safe to test an i

m als even the in jected dose w as 10000 tim es of diphthe ria tox in. These resu lts demonstrated that CRM 197 had been expressed success

fu lly in E. coli at h igh leve,l and a lso possessed exce llen t imm unogen icity and h igh safety. G iven these cha racte ristics, the CRM 197 ex

pressed in E. co li is suitable fo r fu rther research.
Key words:
CRM 197 D iphtheria tox in
Inclus ion body Immunogenic ity A cute tox ic ity
收稿日期: 2009
09
21
作者简介:赵雪娜,硕士,研究方向:主要从事生物制药研究; E
m ai:l xn. z0535@ tom. com
通讯作者:王庆民,工程师,研究方向:主要从事生物制药研究; E
m ai:l w qm 95@ 163. com
白喉毒素 ( diphtheria tox in, DTx)是白喉杆菌 (Cor

ynebacterium diphtheriae)被
噬菌体溶源化后,由
噬
菌体 tox基因编码合成的外毒素 [ 1]。CRM197( cross re

acting material 197)是白喉毒素的一种突变体, 它的
第 52位氨基酸由 G ly突变为 G lu, 致使白喉毒素酶
活性位点发生改变, 从而不能对细胞产生毒性作
用 [ 2]。丧失酶活性及毒性的同时 CRM197仍保留
白喉毒素的免疫原性 [ 3 ] ,是一种理想的免疫蛋白载
体。目前,它作为载体被广泛用于疫苗开发,具有广
阔的应用前景。
迄今为止工业制备 CRM197所用的宿主主要是
白喉杆菌 [ 4, 5] ,白喉杆菌发酵条件苛刻,并且培养基
成分复杂、价格昂贵 [ 6] , 不利于大规模工业生产。因
此,需要开发一种廉价、高效的 CRM197表达体系。
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 1期
大肠杆菌 (E scherichia coli)是目前应用最为广泛的重
组蛋白表达系统,具有遗传背景简单、操作技术成熟、
繁殖迅速、蛋白得率高、安全性好等优点。目前,已经
用于多种药用蛋白质的表达。 2008年,王春娥等 [ 7]
在大肠杆菌中成功表达了带 H is标签的 CRM197。
本研究采用大肠杆菌表达系统表达 CRM197天
然序列蛋白,将更具工业应用价值,研究中还对获得
的重组蛋白进行免疫原性和急性毒性检测, 以建立
一种廉价、高效、安全的 CRM197表达体系。
1 材料与方法
1
1
质粒与菌株
大肠杆菌 DH5
为本室保存, 表达质粒 pET25b
和表达菌株 BL21( DE3)购自 N ovagen公司。
1
2
酶及主要试剂
Nde I、H in d III、T 4DNA L igase购自 Promega公
司;辣根过氧化物酶标记山羊抗白喉毒素多克隆抗
体购自 Abcam 公司; 辣根过氧化物酶标记羊抗兔
IgG购自北京华美生物工程公司; 弗氏佐剂为 BBI
公司产品;白喉毒素为北京天坛生物制品有限公司
惠赠。
1
3
试验动物
新西兰大白兔和豚鼠购自山东鲁抗医药集团有
限公司。
1
4
CRM197基因合成
根据 GenBank中白喉毒素基因序列 (登录号:
CQ967258)合成基因,其中 5
端并加入 Nde
酶切
位点、第 155位核苷酸由 g变为 a、3
端将终止密码
子改为 taa并在其后加入H in d
酶切位点, 由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成。
1
5
CRM197表达载体构建
Nde I/H ind
双酶切合成的 CRM197基因片
段,与经过同样酶处理的 pET25b载体连接, 构建表
达载体 pET25b
CRM197,并转化大肠杆菌 DH5
,筛
选阳性克隆,进行酶切和测序鉴定。
1
6
CRM197的表达
将 pET25b
CRM197转入大肠杆菌表达宿主
BL21( DE3)中, 挑取转化子过夜培养,然后按 1
100
( v
v )的比例转接于含氨苄青霉素和氯霉素的 LB
培养基中, 37
、220 r /m in振荡培养至 OD600为 0
6,
加入终浓度为 1 mmo l/L的 IPTG诱导表达 5 h, SDS

PAGE检测表达情况, 并用超声波裂解细胞分析目
的蛋白的表达形式。
1
7
CRM197纯化及鉴定
收集诱导表达的菌体, 用 TE缓冲液重悬, 超声
破碎收集沉淀,缓冲液反复洗涤后得到包涵体。将
包涵体先在 37
变性 45 m in(变性液: 8 mol /L尿素、
50mmol /L Tris
HC l、1 mmo l/L EDTA、15 mmo l/L


ME, pH8
7) ,再用 TE缓冲液 ( 20 mmol /L Tr is
HC l、
1mmol /L EDTA, pH8
7)进行 10倍体积稀释复性,
然后将其上样于 TE缓冲液 ( pH8
7)平衡好的 DE

AE阴离子柱中, 0
4 mo l/L NaC l洗脱, 洗脱产物在
50mmol /L PB缓冲液 ( pH 7
6)中透析过夜,透析后
样品用 S
100分子筛柱纯化, PB缓冲液洗脱, 收集
目标产物。纯化的蛋白质经 SDS
PAGE后, 电转移
至硝酸纤维素膜上,进行W estern blotting分析,所用
抗体为辣根过氧化物酶标记山羊抗白喉毒素多克隆
抗体, 显色试剂为邻苯二胺, 并对纯化蛋白进行 N
端和 C端测序 (北京大学生命科学院 )。
1
8
CRM197免疫原性检测
1
8
1
新西兰大白兔免疫试验 将纯化的 CRM197
溶于生理盐水,并与等量弗氏佐剂混合,得到终浓度
为 1mg /mL CRM 197样品。选取 8只健康成年新西
兰大白兔,体重 2- 2
5 kg, 随机分为两组: a组 4只
兔子注射 CRM197样品; b组 4只兔子注射等体积
生理盐水作为阴性对照。采用后腿肌肉注射, 每隔
3周免疫 1次, 共免疫 3次。第一次注射采用弗氏
完全佐剂处理样品, 免疫剂量 1 mg; 后两次采用弗
氏不完全佐剂处理样品,免疫剂量 0
5 mg。免疫完
成后耳缘静脉采血,制备抗血清。
1
8
2
ELISA检测抗血清效价 用纯化的 CRM197
包被聚苯乙烯 96孔板,封闭后加入如下倍数稀释的
抗血清: 1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、
64 000、128 000, 以注射生理盐水的兔血清作为阴
性对照。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔
IgG,然后加邻苯二胺显色,测定 OD491值, 以 P /N(待
检样品 OD491 /阴性样品 OD 491 )
2
5判为阳性。
1
9
豚鼠急性毒性试验
选取 300- 400 g的豚鼠 16只, 随机分为两组,
每组 8只, 一组每只皮下注射 20 ng白喉毒素作为
阳性对照组;另一组每只皮下注射 200
g CRM 197。
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2010年第 1期

赵雪娜等 :白喉毒素突变体 CRM 197在大肠杆菌中表达纯化及性质研究
注射体积皆为 1mL。注射完毕后,观察豚鼠存活情
况、精神状况、注射局部反应及体重变化。
2 结果与分析
2
1
CRM197表达载体构建
按方法中所述构建 CRM197表达载体 pET25b

CRM197,并转化大肠杆菌 DH5
, Nde I/H ind III酶切
鉴定结果显示该重组质粒酶切后产生一条约1 600 bp
的条带 (图 1箭头所示 ) ,与 CRM197基因片段大小
一致, 测序结果表明此片段与设计的 CRM197基因
序列完全相同,并且阅读框正确。
1. DNA分子量标准 (DL15000) ; 2: pET25b
CRM197 /Nd e I+H ind

图 1
重组表达载体 pET25b
CRM 197酶切分析
2
2
CRM197的表达
将 pET25b
CRM197转入大肠杆菌 BL21( DE3),
经 IPTG诱导后收集菌体, SDS
PAGE检测结果显
示,加入 IPTG诱导后, 转入重组质粒的菌株总蛋白
提取物中出现一条分子量约为 58 kD的蛋白条带
(图 2, 泳道 3) , 与 CRM197蛋白大小相符, 表明重
组表达载体经 IPTG诱导 CRM197得到表达。利用
ImageM asterVDS软件 ( Pharmacia B io tech)分析证明
其表达量约占细菌总蛋白的 20%。裂解试验表明
CRM197蛋白主要以包涵体形式存在于细胞质中
(图 2,泳道 4和泳道 5)。
2
3
CRM197纯化及鉴定
电泳检测结果表明纯化产物中目的蛋白的纯度
高于 95% (图 3,泳道 2)。W estern b lo tt ing检测结果
显示,在分子量为 58 kD处产生一条特异性条带 (图
3,泳道 3)。经过测序,纯化蛋白 N端 15个氨基酸序列
和 C端 3个氨基酸序列与 CRM197氨基酸序列一致。
2
4
CRM197免疫原性检测
用纯化的 CRM197免疫新西兰大白兔, 制备抗
血清。运用 ELISA方法检测抗血清效价。经过 3
次免疫之后 a组兔血清中检测到 CRM197诱导产生
的特异抗体,滴度最高达到 1
64 000。
2
5
豚鼠急性毒性试验
分别对豚鼠皮下注射白喉毒素和 CRM197。注
射后 48 h内白喉毒素阳性对照组动物全部死亡; 而
CRM197试验组动物精神正常、吃食良好、注射局部
无反应,跟踪观察 30 d,体重持续上升 (图 4)。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 1期
图 4 皮下注射 CRM 197后豚鼠体重变化图
3 讨论
白喉毒素经过甲醛脱毒处理制成白喉类毒素
( diphtheria toxoid, DTd)用作疫苗载体蛋白, 但白喉
类毒素的获得必须经过大体积毒性物质处理, 而且
它可能恢复白喉毒素毒性 [ 8, 9]。因此, 研究者尝试
用无毒的 CRM197作为载体制备疫苗, 现已成功研
制了小儿流感疫苗和小儿肺炎疫苗 [ 9, 10]。然而
CRM197产量比白喉毒素低的多, 对制备疫苗产生
严重制约。为解决这一问题,本研究在大肠杆菌中
表达 CRM197,结果成功获得表达, 且表达量达到蛋
白总含量的 20%左右,经过变性、复性、阴离子柱和
分子筛纯化后, 获得纯度高于 95% 的 CRM197蛋
白。利用本研究的表达体系进行大规模工业生产,
将消除 CRM197产量不足对使用的影响, 促进以它
为载体的疫苗研究和生产。
本研究对 CRM197的免疫原性和急性毒性进行
检测。免疫原性试验中 CRM197免疫的新西兰大白
兔血清中检测到 CRM 197特异抗体,滴度最高达到
1
64 000;急性毒性试验中 CRM197注射剂量为白
喉毒素对照组注射剂量 10 000倍的情况下, 试验组
豚鼠未出现明显毒性反应症状。免疫原性试验和急
性毒性试验结果表明试验中制备的 CRM197在动物
体内具有良好的免疫原性和安全性, 可以作为蛋白
载体用于开发疫苗。最近美国 Aph ton公司开发出
一种抗癌疫苗, 它由胃泌素肽 ( G17)与白喉类毒素
交联而成 [ 11]。将 G17与本试验获得的 CRM197交
联制备疫苗,体外药效试验表明其抑瘤效果明显,目
前正在进行进一步的研究。
本研究利用大肠杆菌表达系统表达 CRM197蛋
白, 使其获得了高效表达并且具有良好的免疫原性
和安全性,为其进一步生产及应用奠定了基础。
参 考 文 献
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