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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
杨 树（Populus L.） 生 长 快， 适 应 性 强， 用 途
广，是我国人工速生用材基地建设的主要造林树种，
影响杨树丰产林发展最大的障碍为病虫危害，其中
虫害尤甚。杨树的害虫主要分为食叶害虫和蛀干
害虫，食叶害虫以鳞翅目（Lepidoptera）的杨尺蠖
（Apocheima cinerarius）和舞毒蛾（Lymantria dispar）、
杨扇舟蛾（Clostera anachoreta）为主，蛀干害虫以
鞘 翅 目（Coleoptera） 的 光 肩 星 天 牛（Anoplophora
glabripennis）、桑天牛（Apriona germari）、云斑天牛
（Batocera horsfieldi）为主［1，2］。防治这些害虫的传
统方法如化学药物防治和人工捕捉等具有一定局限
性，因此从 20 世纪 80 年代开始，我国开展了抗虫
收稿日期 ： 2014-03-07
基金项目 ：国家林业转基因生物安全性监测项目（JJ-2012-07）
作者简介 ：陈虞超，男，硕士，助理研究员，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：chenyuchao820321@163.com
通讯作者 ：宋玉霞，女，硕士，研究员，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：songyx666@163.com
抗虫转基因银河杨的生长特性和抗虫性
陈虞超  张丽  巩檑  甘晓燕  石磊  宋玉霞
（宁夏农业生物技术重点实验室，银川 750002）
摘 要 ： 以非转基因银河杨（Populus alba×Populus hopeiensis）为对照，对抗虫转基因银河杨抗虫基因 Cry3A 的稳定性，转
基因银河杨的物候期、生长状况和抗虫性进行研究。结果发现，Cry3A 基因整合稳定，在根、茎、叶中 RNA 和蛋白水平均有表达，
不同组织中 Bt 蛋白水平差异显著，茎中 Bt 蛋白水平最高。抗虫转基因银河杨的物候期、生长状况未发生显著变化，但表现出显
著的抗虫性。
关键词 ： 抗虫转基因银河杨 Cry3A 基因 物候期 生长状况 抗虫性
Growth Characteristic and Insect-Resistance of Transgenic
Populus alba Populus hopeiensis
Chen Yuchao Zhang Li Gong Lei Gan Xiaoyan Shi Lei Song Yuxia
（Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Ningxia，Yinchuan 750002）
Abstract: The stability of insect-resistance gene Cry3A, phenophase, growth status and insect-resistance of transgenic poplar hybrid
（Populus alba×Populus hopeiensis）was investigated, non- transgenic Populus alba×Populus hopeiensis as control. The results showed that the
Cry3A gene in transgenic Populus alba×Populus hopeiensis integrated stably. The Cry3A gene could be expressed at RNA level and protein level
in root, shoot and leaf. The Bt protein level was significantly different in different tissues, and was highest in shoot. The phenophase and growth
status of transgenic Populus alba×Populus hopeiensis changed indistinctively. But it showed distinct insect-resistance.
Key words: Insect-resistance transgenic Populus alba×Populus hopeiensis Cry3A gene Phenophase Growth status Insect-
resistance
转基因杨树培育的研究。众多研究者通过转基因技
术将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称
Bt）等外源抗虫基因，导入不同杨树品种中，成功
培育出一系列性状优良的抗虫转基因杨树，其中部
分已进入环境释放或商品化阶段［3-8］。Cry3A 为 Bt
蛋白编码基因之一，对鞘翅目昆虫具有专一的毒杀
作用，在抗虫转基因杨树的培育中应用较多［9-11］。
目前有关抗虫转基因杨树培育和利用的研究较多，
针对抗虫转基因杨树生长特性和抗虫性变化的跟踪
研究较少。鉴于此，本研究以普通银河杨为对照，
对已育成的转 Cry3A 抗虫基因银河杨抗虫基因的稳
定性，物候期、生长状况和抗虫性变化进行较系统
2014年第11期 139陈虞超等：抗虫转基因银河杨的生长特性和抗虫性
的对比研究，旨在为抗虫基因银河杨下一步推广应
用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
转 Cry3A 抗 虫 基 因 银 河 杨［ 银 白 杨（Populus
alba L.）× 河北杨（Populus hopeiensis Hu et chow）］
以 CaMV35S 为 Cry3A 基因的启动子，由宁夏农业生
物技术重点实验室培育，并于 2004 年种植于宁夏回
族自治区银川市宁夏农林科学院芦花台园林场（东
经 106 08、北纬 38 38）。测试昆虫为人工饲养的
鞘翅目（Coleoptera）天牛科（Cerambycidae）的光
肩星天牛（Anoplophora glabripennis）。DNA 提取试剂
盒购自 TIANGEN 公司（货号 ：DP305-02），RNA 提
取试剂盒购自全式金公司（货号 ：ET121-01），RT-
PCR 试 剂 盒 GoScriptTM Reverse Transeription System
购自 Promega 公司，Bt-Cry3A 的 ELISA 测定试剂盒
购自于 Agdia 公司（货号 ：PSA05900），其他试剂为
国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 抗 虫 转 基 因 银 河 杨 Cry3A 基 因 的 PCR 与
RT-PCR 检 测 提 取 抗 虫 转 基 因 银 河 杨 DNA， 利
用 PCR 方法检测 Cry3A 基因的稳定性，引物序列
为 ：5-ATGACTGCTGATAACAACACGGA-3 和 5-
TTAATTCACTGGAATGAACTCA-3， 扩 增 片 段 大 小
为 1 794 bp。PCR 体 系 为 10×buffer 2.5 μL，dNTP
2.0 μL， 引 物 各 1.0 μL，Taq 1.0 μL，DNA 1.5 μL，
ddH2O 17 μL，总体积 25 μL。扩增程序为 ：94℃预
变性 5 min ；94℃变性 40 s，53℃复性 40 s，72℃延
伸 1 min，循环 35 次 ；72℃保温 10 min。7 月中旬，
采集转基因银河杨根、茎、叶，采用试剂盒法提
取抗虫转基因银河杨的总 RNA，以杨树的 ubiquitin
基 因（Gene ID ：7464783） 为 内 标， 利 用 RT-PCR
检测抗虫基因 Cry3A 的反转录情况 ；Cry3A 的 RT-
PCR 引物同 PCR 引物一致，内标基因 ubiquitin 的
引物序列为 ：5-TGAGGCTTAGGGGAGGAACT-3 和
5-TGTAGTCGCGAGCTGTCTTG-3，扩增片段大小为
195 bp ；扩增程序参照试剂盒说明书。
1.2.2 抗虫转基因银河杨 Bt 蛋白的检测 于 7 月中
旬，采集抗虫转基因银河杨根、茎、叶组织，然后
测定根、茎、叶中 Bt 蛋白的含量，具体过程参照
试剂盒说明书进行，用 Bio-Rad xMarkTM 酶标仪测定
结果。
1.2.3 抗虫转基因银河杨生长特性调查 采用随机
抽样法，选取抗虫转基因银河杨（简称 TG）和普通
银河杨（简称 CK）调查样株各 30 株，从 2012-2013
年，连续 2 年对所有样株的生长物候期（包括芽萌
动期、芽开放期、花序孕期、展叶始期、开花期、
展叶盛期、封顶期、叶始黄期、叶黄盛期、落叶初
期、落叶盛期）和形态特性（包括株高、胸径、地径、
分支数、郁闭度）进行观测。
1.2.4 抗虫转基因银河杨室内抗虫性鉴定 于 7 月
中旬，分别采集抗虫转基因银河杨、普通银河杨植
株的幼嫩枝叶，以容量为 1 L 的带透气盖塑料培养
瓶为饲养容器，饲喂光肩星天牛成虫，每瓶 3 头，
每个处理组 10 瓶，每 2 d 换一次新鲜枝叶，重复 3 次，
统计两个试验组光肩星天牛成虫 15 d 内总死亡率和
死亡指数。
总死亡率（%）=（饲养末期死亡总数 / 初期饲
养总数）×100%
死亡指数 =（∑天数 × 当天死亡数）/（总死
亡数 × 试验总天数）
2 结果
2.1 抗虫转基因银河杨Cry3A基因的PCR检测
通过 PCR 方法检测 Cry3A 基因在抗虫转基因
银河杨植株中的稳定性，结果如图 1 所示，抗虫转
基因银河杨植株的 PCR 扩增产物中，均存在一条
1 800 bp 左右大小的条带，经测序比对与目的基因
Cry3A 同源性为 100%。结果表明，Cry3A 基因在抗
虫转基因银河杨植株中稳定存在，未发生基因丢失
的现象。
Cry3A
2000
1000
bp
CK CK TG TG TG TG M
CK ：普通银河杨 ；TG ：抗虫转基因银河杨 ；M ：DNA-mark2000
图 1 抗虫转基因银河杨 Cry3A 基因的 PCR 扩增产物电泳图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期140
2.2 抗虫转基因银河杨Cry3A基因的RT-PCR检测
通 过 RT-PCR 方 法 检 测 Cry3A 基 因 在 不 同 组
织中的 RNA 表达情况，结果如图 2 所示，在抗虫
转基因银河杨植株根、茎、叶的 RT-PCR 扩增产物
中，均存在一条 1 800 bp 左右大小的条带，经测序
比对与目的 Cry3A 基因同源性为 100%。结果表明，
Cry3A 基因在根、茎、叶中均能表达。
Bt 蛋白表达情况，结果如图 3 所示，抗虫转基因银
河杨植株根、茎、叶中 Bt 蛋白水平分别为 16、28
和 6 ng/g。结果表明，Cry3A 基因在根、茎、叶中均
能进行 Bt 蛋白表达，茎中水平最高 ；不同组织中 Bt
蛋白水平存在显著差异。
2000
bp
Cry3A
1 2 3 4 5 6 MM
ubiquitin
1000
M ：DNA-mark2000 ；1、3、5 ：抗 虫 转 基 因 银 河 杨 根、 茎、 叶
Cry3A 基因的 RT-PCR ；2、4、6 ：抗虫转基因银河杨根、茎、叶
ubiquitin 基因的 RT-PCR
图 2 抗虫转基因银河杨 Cry3A 基因 RT-PCR 扩增产物电
泳图
2.3 抗虫转基因银河杨Bt蛋白检测
通过 ELISA 法检测 Cry3A 基因在不同组织中的
0 ṩ 㤾 ਦ510 b a c2030Bt㳻ⲭ≤ᒣng·g-1 152535
不同小写字母表示差异显著（P<0.05）
图 3 抗虫转基因银河杨不同组织中 Bt 蛋白水平
表 1 转基因银河杨与普通银河杨物候期对比表
株系
物候期（月/日）
芽萌动期 芽开放期 花序孕期 展叶始期 开花期 展叶盛期 封顶期 叶始黄期 叶黄盛期 落叶初期 落叶盛期 生长天数
TG 3/8 3/13 3/19 3/30 4/5 4/10 8/26 9/17 9/29 10/7 10/17 173
CK 3/8 3/13 3/19 3/30 4/5 4/10 8/26 9/17 9/29 10/7 10/17 173
表 2 转基因银河杨与普通银河杨生长状况对比表
株系
调查项目
胸径年均生长量（cm） 地径年均生长量（cm） 株高年均生长量（m） 分支数（个） 郁闭度（%）
TG 1.25 1.37 1.21 38 90
CK 1.24 1.36 1.23 37 90
2.4 抗虫转基因银河杨生物学特性分析
通过对抗虫转基因银河杨、普通银河杨的物候
期进行对比调查，结果发现二者的物候期无显著差
异（表 1）。通过对抗虫转基因银河杨、普通银河杨
的生长状况进行对比调查，结果发现二者在胸径年
均生长量、地径年均生长量、株高年均生长量、分
支数、郁闭度方面均无显著差异（表 2）。
2.5 转基因银河杨抗虫性分析
以普通银河杨为对照，通过实验室人工饲喂的
方法，对比分析抗虫转基因银河杨的抗虫性，结果
如表 3 所示，饲喂抗虫转基因银河杨和普通银河杨
的光肩星天牛，总死亡率分别为 86.7%、33.3%，死
亡指数分别为 0.62、0.24。表明抗虫转基因银河杨
对光肩星天牛具有显著的抗性。
表 3 转基因银河杨与普通银河杨抗虫性的对比分析
株系
调查项目
总死亡率（%） 死亡指数
TG 86.7 a 0.72 a
CK 33.3 b 0.24 b
同列数据上标的不同小写字母表示差异显著（P ＜ 0.05）
2014年第11期 141陈虞超等：抗虫转基因银河杨的生长特性和抗虫性
3 讨论
外源基因在转基因植株中丢失、沉默是植物基
因工程应用中存在的主要问题。Meyer 等［12］发现，
转基因移栽至大田后，由于光照、温度等因素的影
响，外源基因的失活程度更显著，失活的转基因植
物数量也更多。但胡建军等［13］通过田间调查发现，
7 年生的转基因黑杨依然具有良好的抗虫性，外源
抗虫基因表达正常。本研究对 9 年生的抗虫转基因
银河杨部分植株进行 PCR 检测，发现 Cry3A 基因在
转基因杨树植株中稳定存在，未发生基因丢失的现
象。抗虫转基因银河杨以 CaMV35S 作为 Cry3A 基因
的启动子，而 CaMV35S 属异源组成型启动子，在受
体植株的不同组织器官中均可表达［14，15］。本研究发
现，Cry3A 基因在转基因银河杨植株的根、茎、叶
均可表达，这可能是 CaMV35S 启动子的特性所决定
的。不同组织间的表达量差异显著，这与姜志磊等［16］
对抗虫转基因玉米的研究结论相似，推测这一现象
可能与 Bt 蛋白的分泌方式、运输途径和方向等相关。
外源抗虫基因导入受体植株基因组，使受体植
株表现出较好的抗虫性，但可能也会影响植株的新
陈代谢，导致其生长特性等表型发生变化。吕淑平
等［17］研究表明，外源 Bt 基因在增强转基因棉花抗
性的同时，还影响了转基因棉花的株高等生长特性。
但本研究发现，与普通银河杨相比，抗虫转基因银
河杨在物候期、生长状况等生长特性方面不存在显
著变化，这与刘海涛等［18］对抗虫转基因欧洲黑杨、
杨敏生等［19］对转双抗虫基因 741 杨的研究结果一
致。本研究还发现，与普通银河杨相比，抗虫转基
因银河杨对光肩星天牛具有显著的抗性，这与张冰
玉等［11］对转 Cry3A 基因银腺杨的相关研究结论一致。
4 结论
抗 虫 转 基 因 银 河 杨（Populus alba×Populus
hopeiensis）的物候期、生长状况未发生显著变化，
但抗虫性显著 ；其抗虫基因 Cry3A 整合稳定，在根、
茎、叶中 RNA 和蛋白水平均有表达，不同组织中 Bt
蛋白水平差异显著，茎中 Bt 蛋白水平最高。
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（责任编辑 李楠）