全 文 ：·综述与专论· 2012年第9期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2012-03-21
基金项目 : 上海市自然科学基金重点项目（10JC1406700）
作者简介 : 付寅坤 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 微生物海洋学 ; E-mail: yinkunfu@gmail.com
通讯作者 : 肖湘 , 男 , 博士 , 特聘教授 , 研究方向 : 深海微生物 ; E-mail: xoxiang@sjtu.edu.cn
热球菌目（Thermococcales）是一类有机异养的
超嗜热厌氧菌，可以利用氨基酸、蛋白胨、丙酮酸、
淀粉等有机物，并且可以还原硫单质。热球菌目
（Thermococcales）属于广古菌门，包含 3 个属，即火
球菌属（Pyrococcus）［1］、热球菌属（Thermococcus）［2］
以及古老球菌属（Palaeococcus）［3］。Thermococcales
一般分离自海洋高温含硫的环境，如深海热液口、
浅海热液口。海底热液口的环境一般温度较高，其
中溶有许多如 Fe（II），Mn（II）等过渡金属元素，
还有 H2，H2S 和 CO2 等还原性气体，这与早期生
命起源环境相似［4］。此环境分离的 Thermococcales
位于系统发育树的根部，与一类高温产甲烷古菌
Methanopyms kanlderi被认为是最早的微生物类型［5］。
作为深海热液系统中的重要类群，Thermococcales在
碳、硫等元素的循环中扮演着十分重要的角色。
Thermococcales生长温度在通常在 80℃以上，表
明它们的膜脂、核酸、蛋白质具有热稳定性，因此
许多科学家将研究的焦点集中在蛋白的热稳定性结
热球菌目（Thermococcales）遗传操作系统研究与
应用进展
付寅坤 肖湘
（上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240）
摘 要： 热球菌目（Thermococcales）是一类分离自浅海热泉或者深海热液口的超嗜热微生物，包括火球菌（Pyrococcus）、
热球菌（Thermococcus）、古老球菌（Palaeococcus）。研究其生命活动的分子机制，基因的功能等必须借助遗传操作系统。由于选择
标记的限制，Thermococcales遗传操作系统落后于其他菌株。近年来，在 Thermococcales发现了内源质粒并可以将其改造用作遗传
工具。如在 Thermococcus kodakarensis及 Pyrococcus furious等菌株内都建立了成熟的遗传系统，并用于基因敲除以及基因表达。将
就 Thermococcales内源质粒的发现和遗传操作系统的发展与应用加以阐述。
关键词： Thermococcales 遗传操作系统 营养缺陷标记 抗生素标记 穿梭载体
Development and Application of Genetic Manipulation Systems
in Thermococcales
Fu Yinkun Xiao Xiang
（School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240）
Abstract: The order Thermococcales represents a large group of hyperthermophile，which is isolated from shallow valley or deep sea
hydrothermal vent. It consists of three genera，Thermcococcus，Pyrococcus，Palaeococcus. To investigate the molecular mechanism and gene
function of this order，we need a set of genetic manipulation system. The genetic manipulation systems of Thermococcales develop far behind
because of the unavailablity of efficient selective markers. However，researchers have discovered plasmids and established genetic systems
in Thermococcales. For example，genetic manipulation systems in Thermococcus kodakarensis and Pyrococcus furious have been widly used in
knock-out and gene expression. We summarize the discovery of plamid, the development and application of genetic manipulation systems in
Thermococcales.
Key words: Thermococcale Genetic manipulation system Nutrient auxotrophic marker Antibiotic marker Shuttle vector
2012年第9期 29付寅坤等 ：热球菌目（Thermococcales）遗传操作系统研究与应用进展
构上。Thermococcales增强蛋白结构稳定性有很多策
略，其中之一是依靠酸和氨基酸的残基之间形成的
离子键网络。谷氨酸脱氢酶是 Thermococcales的代表
型模式蛋白，它的热稳定性正是由于存在这种离子
键网络结构［6］。另一个策略是蛋白质的核心部分疏
水性加强。Thermococcus kodarkarensis 的 O6-甲基鸟
嘌呤 - DNA 甲基转移酶核心位点处芳香族氨基酸比
E. coli相应位置处的多［7］。
Thermococcales的耐热性为生物技术的发展提供
了宝贵的资源。一系列的热稳定性多聚糖酶被广泛
分离和应用。如 α-淀粉酶［8］、支链淀粉酶［9］、环式
糊精葡聚糖转移酶［10］、4-α-葡聚糖转移酶［11］和分
支酶［12］等。另外，还包括可以切割 β-1，3 或 β-1，4
糖苷键的酶如 β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖
苷酶、几丁质酶和 β-氨基葡糖聚酶［13-17］。如果将它
们的基因克隆到可培养的工程微生物中，就可以得
到可耐受高温的酶类，这些高温酶可被用于食品加
工、造纸和化工等多个行业［18］。
随着生物信息学发展，近年来 Thermococcales基
因组分析也取得了较大进展，目前已完成了 Pyrcocc-
us furious［19］，Pyrcoccus abyssi GE5［20］，Pyrococcus
horikoshioo OT3［21］，Pyrococcus yayanossi CH1［22］，
Thermococcus kodarkarensis ［23］，Thermococcus gamma-
tolerans EJ3［24］，Thermococcus onnurineus NA1［25］，
Thermococcus sbiricus MM739［26］及 Thermococcus baro-
philus MP［27］全基因组分析。一方面，基因组学分
析可以提供代谢途径中新酶的线索 ；另一方面，基
因组学有助于揭示 DNA 复制和修复，转录与调节，
细胞对于外界环境的适应机制。
尽管在超嗜热古菌 Thermococcales的蛋白结构、
超嗜热酶和生物信息等方面取得了很大进展，但是
阐述代谢途径、发现新的酶及揭示生命环境的适应
性机制等必需借助遗传学分析。此外，近年来合成
生物学的发展推动了人类对基因、蛋白质、代谢途
径等进行设计、改造和合成，甚至设计出全新的生
物体［28］。Thermococcales遗传操作系统的建立能推
动对于古菌的人工设计、改造生物元件，并且对于
生命进化的研究拓展新的途径。
一个完整的遗传操作系统应该需要具备以下几
个因素 ：易于在实验室分离和纯培养、宿主的遗传
背景较为清楚（最好是全基因组测序）、合适的克隆
载体、筛选方式等。对于 Thermococcales这类极易生
长的超嗜热古菌来说，细菌的抗生素标记不再适用。
选择标记的限制导致其遗传系统的发展也较为滞后。
近年来，Thermococcales以营养缺陷或者耐受高温的
抗生素作为选择标记，建立了成熟的遗传操作系统。
本文将介绍近年来 Thermococcales遗传操作系统的发
展和应用。
1 遗传操作系统的发展
1.1 营养缺陷性标记宿主的遗传操作系统
对于超嗜热古菌 Thermococcales来说，营养缺
陷型筛选是遗传操作系统中常采用的策略。例如，
古菌的 pyrE 或 pyrF 基因分别编码乳清酸磷酸核糖
转移酶和乳清核苷单磷酸脱羧酶，这两个酶催化单
磷酸尿苷从头合成的最后两步。它们的突变会导致
菌株在没有尿嘧啶的培养基上不能生长。乳清核
苷单磷酸脱羧酶可以催化嘧啶类似物 5-氟乳清酸
（5-FOA）生成有毒物质 5-氟尿嘧啶脱氧核苷，从
而抑制细胞生长［29］。2003 年，Sato 等［30］利用 5-
氟乳清酸（5-FOA）和紫外线诱变的方法得到 pyrE
或 pyrF 基因突变的尿嘧啶缺陷型菌株 KU25。菌株
KU25 为宿主菌，通过基因敲除载体和宿主同源双杂
交，以 pyrF 作为标记基因成功敲除了 trpE。但是这
套系统也有不足之处，一方面诱变获得菌株 KU25
不够稳定 ；另一方面基因敲除载体 pUDT2 上的标记
基因 pyrF 可能和宿主染色体的等位基因发生同源重
组。2005 年，Sato［31］小组用同源杂交的方法获得尿
嘧啶缺陷型菌株 KU216（△ pyrF）、色氨酸缺陷型
突变体 KW128（△ trpE）、尿嘧啶色氨酸缺陷型突
变体 KUW1（△ pyrF△ trpE），从而建立了尿嘧啶
和色氨酸双选择标记系统。Thermococcs kodakarensis
的遗传操作系统虽然简单易操作且具有良好的稳定
性但是转化效率很低，这就限制了随机突变和基因
回补试验的操作。
2011 年 Lipscomb 等［32］ 在 Pyrococcus furious中
用辛伐他丁和 5-氟乳清酸的筛选方法获得了的尿嘧
啶缺陷型菌株 COM1（△ pyrF）。突变菌株 COM1 不
仅易于接受外源 DNA 还具有很高的转化效率。该
小组利用这套尿嘧啶标记遗传操作系统成功地敲除
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期30
Pyrococcus furious中细胞质氢化酶相关基因。
此外，还可以采用内源性的蛋白作为选择标
记。精氨酸脱羧酶可以催化精氨酸到胍基丁胺，是
多元胺合成的重要前提物质。只有在含有精氨酸培
养基中，精氨酸脱羧酶基因缺陷型菌株才可以生
长［33］。因此，在精氨酸脱羧酶基因缺陷型菌株的宿
主遗传操作系统中，可以精氨酸脱羧酶基因（pda）
作为选择标记。在删除精氨酸脱羧酶基因（pda）的
T. kodakarensis菌株中同样建立了遗传操作系统［34］。
1.2 抗生素选择标记的遗传操作系统
Thermococcales除了利用营养缺陷型作为选择
标记外，还可以利用耐高温的古菌抗生素。例如，
2007 年 Matsumi 等［35］在 T. kodakarensis KOD1 中建
立了抗生素辛伐他丁和 3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原
酶（HMGR）为标记基因的遗传操作系统。HMG-
CoA 是古菌的细胞膜磷脂生物合成中的关键酶，而
辛伐他丁是抑制该酶活性的竞争性抑制剂。试验证
明，4 μmol/L 的辛伐他汀可以抑制 T. kodakarensis
KOD1 的生长。在他们构建的载体中 HMGR 上游添
加了一段谷氨酸脱氢酶的启动子序列。这样，转化
细胞内 3-羟-3-甲基戊二酰辅酶还原酶的过量表达可
消除辛伐他汀对细胞生长的抑制作用。这套以抗生
素作为选择标记的系统可以在全营养培养基筛选转
化细胞，从而用于 T. kodakarensis的基因中断。2011
年，Kim 等［36］在 Thermococcus onnurineus NA1 中建
立辛伐他丁依赖的遗传操作系统。
1.3 穿梭载体
Themococcales菌株内源质粒较少，目前已分离
的有 ：Pyrococcus来源的 pGN27［37］，pGT5［38］，pR-
T1［39］，Pp12-1［40］和 Thermococcus来源的 pGN31［37］，
pTN1［41］。这些质粒大小在 3.5-5 kb，10-15 kb 不等，
且有很强的同源性，可能是基因转移所致［42］。
1996 年，Charbonnier 等［43］从 Pyrococcus abyssi
GE5 菌 株 中 分 离 质 粒 pGT5， 这 个 质 粒 大 小 为
3 444 bp，具有两个开放阅读框，可进行滚环复制。
其中 ORF1（75 kD）编码与大肠杆菌复制子蛋白
Rep 相似的蛋白，ORF2 功能未知。进一步研究表
明，该质粒与大肠杆菌质粒 pBR322，pTZ18 的 DNA
构像不同，呈正超螺旋。质粒 pGT5 被广泛用于穿
梭载体的构建（图 1）。最初构建的穿梭载体 pAG1，
是由 pGT5 和 E. coli来源的 pUC17 融合得到。该载
体可在 Pyrococcus furiosus和 S. acidocaldarius体内稳
定存在，且经 CaCl2 处理后可在多个宿主内转化［44］。
在 pAG1基础上融合了来自于 S. solfataricus的乙醇脱
氢酶基因（ADH），从而构建了 pAG21。由于 ADH
基因作为标记基因的引入，使得过量表达的细胞可
以耐受丁醇及苯甲醇［45］。但是这两种载体并不适用
Pyrococcus abyssi系统，于是将质粒 pGT5 插入到细
菌质粒 pLitmus38，并融合了来源于 S. acidocaldarius
的乳清酸磷酸核糖转移酶基因（pyrE）构建了 pYS2
（图 1）。同时在 UV 和 5-FOA 诱导下筛选出尿嘧啶
营养缺陷性菌株。当 pYS2 穿梭载体导入这样的突
变株后，乳清酸磷酸核糖转移酶基因得以回补，在
这样条件下筛选出可在 E. coli和 Pyrococcus abyssi中
低拷贝稳定存在的质粒［46］。
2007 年，Soler 等［41］从 Thermococcus nautilus中
分离了 pTN1 质粒，大小为 3.6 kb，也是进行滚环复
制，并且有两个开放阅读框编码 Rep74 和 p24 蛋白。
2008 年 Santangel 等［47］将质粒 pTN1 和 E. coli的质
粒 pCR2.1-TOPO 融合后，加入了 trpE选择标记和
Pgdh-hmgpf 强启动子构建了穿梭载体 pLC70。该载体
可以在宿主内高拷贝的稳定存在。
1.4 报告基因
Thermococcus kodakarensis具有两个编码 β-糖苷
酶基因（TK1761 和 TK1827）。TK1827 基因在细胞
内的活性很低且稳定，故 2008 年，Santangelo 等［48］
建立了 TK1761 的体内基因报告系统。TK1761 编
码的非必需 β-糖苷酶可以水解正硝基苯基 -β-D-
葡萄糖苷（ONPgluco）和正硝基苯基 -β-D-甘露糖
苷（ONPmanno），因此可以通过比色分析法检测
pTK1761 的活性和 TK1761 在不同调节信号下的表
达情况。这一系统揭示了古菌存在基因簇极性现象。
2009 年，Santangelo 等［49］利用此系统阐述古菌 RNA
聚合酶可以识别转录终止信号。2010 年，Santangelo
等［34］建立了 TK1761 和 TK1827 缺失菌株作为宿主
的 β-糖苷酶报告系统。
1.5 转化方法
良好的转化方法是构建遗传操作系统的前提。
2012年第9期 31付寅坤等 ：热球菌目（Thermococcales）遗传操作系统研究与应用进展
Thermococcs kodakarensis和 Pyrococcus furious都是采
用氯化钙 -热激法，但是转化效率很低。对于 1 000
bp 的同源片段，Thermococcs kodakarensis转化效率为
102/mg DNA。当同源杂交的区域长度越小，转化效
率越低［30］。Pyrococcus abyssi首次采用聚乙二醇介导
的转化方法，但是需要制备原生质体提高转化率［46］。
2 应用
一方面，Thermococcales遗传操作系统可用于
基因的表达。许多目标基因在其上游添加一段强启
动子后，可以在 Thermcoccales宿主内表达。例如，
以 Thermococcus kodakarensis作为宿主，在谷氨酸脱
氢酶启动子（Phmg） 或细胞表面糖蛋白启动子（Pcsg）
调控下已经成功表达了有活性的 3-羟-3-甲基戊二
酰辅酶还原酶、泛酸激酶、Sulfolobus solfataricus的
α-1，4-葡聚磷酸化酶基因。值得一提的是，后两者
基因在其他非嗜热性宿主内表达的蛋白是没有活性
的。2008 年，Santangel 等［47］将利用质粒 pTN1 改
造的穿梭载体，成功的在 Thermococcus kodakarensis
中同源表达带有血凝素表位标签的 RNA 聚合酶 L
亚基。2010 年，Waege 等［50］构建了以果糖 -1，6-
二磷酸作为启动子的穿梭表达载体 PYS4，成功在
Pyrococcus furious中表达了古菌 RNAP 的 D 亚基。
另一方面，Thermococcales基因敲除系统被广泛用于
基因功能及代谢途径的研究。2004 年，Atomi 等［51］
利用 Thermococcus kodakarensis基因敲除系统成功敲
除了解旋酶基因，证明了解旋酶是超嗜热微生物能
耐受高温的一个主要特征。2011 年，Kim 等［36］在
Thermococcus onnurineus NA1 中建立基因敲除系统，
用于研究甲酸盐代谢的相关基因。遗传系统可以用
于发现古菌代谢途径中新的酶，如古菌辅酶 A 合成
途径中存在两个新的酶即泛酸激酶和磷酸化泛酸合
成酶［52］。
3 展望
近年来，嗜热古菌 Thermococcales的遗传操作
系统研究取得了长足的发展，一方面克服了高温下
使用传统抗生素作为选择标记的困难 ；另一方面建
立的基因敲除系统被广泛用于体内外基因功能的研
究（表 1）。目前 Thermcoccales遗传操作系统中最为
完善的是 Thermococcus kodakarensis，被广泛应用于
基因敲除、代谢途径等研究。此外，Thermococcus
kodakarensis是超嗜热蛋白表达的良好宿主，许多在
嗜温生物中不能表达的蛋白可以在其内表达。这为
ADH . 乙醇脱氢酶基因 ；pyrF. 乳清核苷单磷酸脱羧酶基因
图 1 质粒 pGT5出发构建的穿梭载体
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期32
开发嗜热微生物的蛋白资源提供了良好的遗传工具。
Pyrococcus abyssi和 Pyrococcus furious中也建立了相
应的穿梭载体，并且后者的遗传操作系统也日趋成
熟。本实验室已分离出迄今世界上唯一一株严格嗜
压的超嗜热古菌 Pyrococcus yayanossi CH1［54］。这种
极端嗜热嗜压菌株的遗传操作系统构建是一个新的
挑战。
基因组学、转录组学、蛋白质组学等系统生物
学的研究进一步推进了嗜热古菌 Thermcoccales遗传
系统的发展。系统生物学的方法更有助于揭示超嗜
热古菌的 DNA 复制和修复、转录与调节、极端环境
适应机制。总之，Thermococcales作为超嗜热古菌的
模式生物，其遗传操纵系统的建立不仅为人们研究
超嗜热古菌的生理及遗传机制提供了良好的工具，
还为超嗜热微生物宝贵资源的开发提供了可能性。

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转化方法 氯化钙热激法 聚乙二醇介导 氯化钙热激法
代表穿梭载体 pLC70 pYS2 pAG1、pYS4
营养缺陷标记 乳清核苷单磷酸脱羧酶（pyrF） 、 精氨酸脱羧酶（pda） — 乳清核苷单磷酸脱羧酶（pyrF）
抗生素筛选标记 辛伐他汀 — 辛伐他汀
基因敲除标记 乳清核苷单磷酸脱羧酶（pyrF） — —
报告基因 β-糖苷酶 — —
注 ：-代表未发现
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（责任编辑 狄艳红）