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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):171-177
收稿日期 ：2014-09-23
基金项目 ：国家“863”计划（2013AA020302），国家自然科学基金面上项目（31370113）
作者简介 ：张晓立，女，硕士研究生，研究方向 ：轻工技术与工程 ；E-mail ：xiaolizhang0607@sina.com ；郑小梅为本文并列第一作者，
E-mail ：zheng_xm@tib.cas.cn
通讯作者 ：孙际宾，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：微生物代谢工程与系统生物技术 ；E-mail ：sun_jb@tib.cas.cn
黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化
张晓立1，3  郑小梅2，3  满云4  罗虎4  于建东2，3   
郑平2，3  刘浩1  孙际宾2，3
（1. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457 ；2. 中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308 ；3. 中国科学院天津工业生物技术
研究所，天津 300308 ；4. 中粮生物化学（安徽）股份有限公司，蚌埠 233010）
摘 要 ： 黑曲霉是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株。尽管现代遗传操作技术在黑曲霉的实验室菌株、蛋白质生产菌株等
的应用中获得了成功，但是柠檬酸工业菌株遗传转化异常困难，成为柠檬酸工业持续升级的重要限制因素。以柠檬酸工业生产实
际应用的黑曲霉菌株为研究对象，对其原生质体的制备与再生以及 PEG 介导的转化等条件进行了细致优化。结果表明，柠檬酸高
产工业菌株原生质体的制备需选取丰富培养基中培养 48 h 的年轻菌丝体，在 1.5% 裂解酶 -0.5% 蜗牛酶 -0.2% 溶菌酶的复合酶解体
系下裂解 2.5 h，原生质体的制备浓度可达 106 个 /mL 以上，原生质体再生效率可达 90% 以上。原生质体的浓度是原生质体 -PEG
介导转化方法的关键，当原生质体浓度达到 106 个 /mL 以上时，高产柠檬酸菌株的转化效率大幅提高。成功建立了由原生质体 -PEG
所介导的高产柠檬酸黑曲霉菌株的遗传转化体系。
关键词 ： 黑曲霉 ；柠檬酸 ；遗传操作系统 ；原生质体 ；DNA 转化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.025
Preparation of Protoplast for Efficient DNA Transformation of Citric
Acid Hyper-producing Aspergillus niger Industrial Strain
Zhang Xiaoli 1，3 Zheng Xiaomei2，3 Man Yun4 Luo Hu4 Yu Jiandong2，3
Zheng Ping2，3 Liu Hao 1 Sun Jibin2，3
（1. School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457 ；2. Key Laboratory of Systems Microbial
Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308 ；3. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，
Tianjin 300308）；4. COFCO Biochemical（Anhui）Co.，Ltd.，Bengbu 233010）
Abstract: Aspergillus niger is the major industrial strain for citric acid production. In spite of many successes of modern molecular
biology approaches in engineering laboratory or protein-producing strains of A. niger, there is few positive report on its application for citric acid
industrial strains mainly due to the hard-to-transform nature of these strains. In this study, the protoplast-PEG mediated genetic transformation
system for citric acid industrial strain was extensively studied, suggesting an optimized protocol for protoplast preparation, regeneration and
DNA transformation. The concentration of protoplasts reached up to 106 /mL by lysing younger mycelia for 2.5 h after 48 h incubation of a proper
amount of conidia spores in enrichment medium. The optimal lysing enzyme mixtures comprised of 1.5% lysing enzyme, 0.5% snail enzyme
and 0.2% lysozyme. Concentration of protoplast influenced the protoplast-PEG mediated transformation efficiency, which reached the maximal
when the concentration of protoplast was higher than 106/mL. The genetic transformation system established in this study should pave the way to
molecular biology study of the citric acid hyper-producing strains, for further understanding its acid-tolerant physiology and for rational design of
the industrial strain for further improvement of the citric acid production process as well as creation of new organic acid-producing cell factories.
Key words: Aspergillus niger ；citric acid ； genetic manipulation system ；protoplast ；DNA transformation
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3172
柠檬酸是生物体代谢活动中重要的中间产物［1］，
也是在食品、医药、化工等领域应用最为广泛的有
机酸之一［2，3］。全球每年生产和消耗柠檬酸 1.5×106
t 以上，黑曲霉是柠檬酸生产的主力菌种。但高产
柠檬酸黑曲霉菌株由于经历了长期的诱变筛选过程，
细胞结构和遗传可能发生了未知的变化，遗传转化
困难。至今为止，黑曲霉高产柠檬酸工业菌株的分
子遗传操作尚无文献报道。为提升柠檬酸工业生产
的竞争力，急需建立黑曲霉工业菌株的遗传转化和
操作体系。
黑曲霉常用的遗传转化方法与其他丝状真菌一
样，包括孢子电转化法［8］、农杆菌介导转化法［9］、
原生质体介导的转化法等。Meyer 等［10］对这些转化
方法的利弊进行了系统的分析，认为孢子电转化法
操作简单，但转化效率低。农杆菌介导转化虽具有
转化受体形式多样、转化效率较高、转化子稳定、
可转移大片段、单拷贝比例高等优点，但其操作复杂，
周期长，转化过程受多种因素影响［9］。 Michielse 等［11］
也明确指出农杆菌介导转化方法在黑曲霉中的转化
效率较低。原生质体介导的转化方法包括原生质体
电转化法与原生质体 -PEG 介导的转化法。姚婷婷
等［12］在产酶的黑曲霉菌株中原生质体 -PEG 介导
的转化效率更高。原生质体 -PEG 介导的转化方法
也在不同野生型菌株或淀粉酶等黑曲霉生产菌株中
得到成功实践，如野生菌株 A. niger NCIM565［13］与
A. niger N402［14］、 淀 粉 酶 生 产 菌 株 A. niger CICIM
F0410［12］与 A. niger T21［15］等。由此可见，原生质
体 -PEG 介导的转化法对黑曲霉菌株而言是较为有
效的遗传操作方法。
本研究以高产柠檬酸的工业生产实际使用的黑
曲霉菌株为研究对象，通过优化培养基、培养方式、
菌龄、酶解体系与酶解时间等研究其原生质体制
备与再生的最佳条件，建立柠檬酸高产菌株原生质
体 -PEG 介导的遗传转化体系，旨在为高产柠檬酸
黑曲霉原生质体转化及黑曲霉工业菌株改造奠定基
础。同时本研究对其他遗传操作困难的丝状真菌的
分子改造具有一定借鉴意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒 柠檬酸工业生产使用的黑曲霉
菌株 ：由中粮生物化学（安徽）股份有限公司提供，
经过基因组测序分析鉴定，为由野生黑曲霉菌株
Aspergillus niger D 多轮诱变的 A. niger Co827 的衍生
菌株。
用于遗传转化的质粒 pGm ：来源于文献［16］，
携带有 amdS 的筛选标记，由本实验室保存。
1.1.2 工具酶和试剂 工具酶 ：α-淀粉酶（30 U/μL）
购自诺维信（中国）生物技术有限公司 ；来源于木
霉的细胞裂解酶购自 Sigma ；溶菌酶购自北京鼎国昌
盛生物技术有限责任公司 ；蜗牛酶购自北京经科宏
达生物技术有限公司。试剂 ：培养基配制及原生质
体制备所需试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
（1） 产 孢 培 养 基 ：黑 曲 霉 专 用 固 体 培 养 基
90 g/L ；
（2）合成培养基 Czapek-Dox（CD）：参照文献
［14］配置 ；
（3）丰富培养基（CMA）：葡萄糖 20 g/L，麦芽
糖浸提物 20 g/L，蛋白胨 1 g/L ；
（4）柠檬酸发酵培养基（FC）：玉米粉 200 g/L，
α-淀粉酶（30 U/μL）300 μL/L，CaCl2 1 g/L ；
（5）筛选培养基 ：上层培养基 MMSA ：乙酰胺
0.59 g/L，CsCl 3.4 g/L，KCl 0.52 g/L，KH2PO4 1.52
g/L，山梨醇 1.2 mol/L，微量元素 1 mL/L，葡萄糖 10
g/L，MgSO4 0.5g/L，1% 低熔点琼脂糖 ；下层培养基
MMS ：成分与 MMSA 相同，1% 琼脂糖。
微 量 元 素 ：FeSO4·7H2O 1 g/L，ZnSO4·7H2O
8.8 g/L，CuSO4·5H2O 0.4 g/L，MnSO4·H2O 0.1 g/L，
Na2B4O7·10H2O 0.1 g/L，（NH4）6 Mo7O24·4H2O
0.05 g/L。
（6） 原 生 质 体 再 生 培 养 基 ：上 层 培 养 基
MMSA+NaNO3：NaNO3 0.6 g/L，CsCl 3.4 g/L，KCl 0.52
g/L，KH2PO4 1.52 g/L，山梨醇 1.2 mol/L，微量元素 1
mL/L（如筛选培养基 MMS 所列，不再赘述），葡萄
糖 10 g/L，MgSO4 0.5g/L，1% 低熔点琼脂糖。
下层培养基 MMS+NaNO3 ：成分与 MMSA+NaNO3
相同，1% 琼脂糖。
1.2 方法
1.2.1 原生质体制备 柠檬酸工业生产菌株在产孢
培养基上 34℃培养 6 d 收集孢子并用含 0.05%（V/V）
2015,31(3) 173张晓立等：黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化
Tween-80 的生理盐水［0.9%（W/V）NaCl］制备孢
子悬液（107 个 /mL）。取适量的孢子悬液接种到 200
mL 丰 富 培 养 基 CMA 或 合 成 培 养 基 Czapek-Dox 或
柠檬酸发酵培养基 FC 中，孢子接种的终浓度为 105
个 /mL，在旋转式摇床 34℃，250 r/min 的条件下摇
瓶液体振荡培养不同时间。培养方式还采用液体静
止培养，或在液体摇瓶振荡培养基中加入适量 0.5
mm 的玻璃珠。
采用八层纱布过滤收集菌丝球，然后用 200
mL 无菌蒸馏水清洗菌丝球，再用 50 mL 溶液 I（5
mmol/L K2HPO4、5 mmol/L KH2PO4、0.8 mol/L MgSO4，
pH5.5）除去残留的培养基，并使菌丝球处于溶液 I
的状态下。将 1 g 菌丝球 加入到 20 mL 采用不同细
胞裂解酶配比的细胞壁裂解液（以溶液 I 为基底缓
冲液）中，在旋转式摇床 30℃，200 r/min 的条件下
分别对细胞壁进行不同时间的裂解处理。用 3 层无
菌高级擦镜纸过滤菌丝球裂解液收集原生质体，加
入 20 mL 的溶液 II（10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L
CaCl2、1.2 mol/L 山 梨 醇，pH7.5） 轻 轻 混 匀 后，
3 000×g 离心 5 min，弃上清液，再用 30 mL 溶液 II
洗涤原生质体沉淀 2 次。最后将原生质体沉淀重悬
于 500 μL 溶液 II 中，即为黑曲霉的原生质体悬液，
可用于原生质体的再生与转化。
1.2.2 原生质体再生 原生质体再生采用双层平板
法，首先在显微镜下用血球计数板对原生质体悬液
进行计数，取 100 μL 原生质体悬液用溶液 II 进行
适当稀释。以 MMS+NaNO3 作底层培养基，以含 1%
低熔点琼脂糖的 MMSA+NaNO3 与 0.1 mL 原生质体
稀释液混合作上层培养基，置 30℃ 培养 3-4 d，对
形成的菌落进行计数（A）。为消除由未除尽的菌丝
片段再生出的菌落所造成的误差，同时采用双层平
板法将原生质体置于未添加渗透压稳定剂 MgSO4 的
MMS+NaNO3 培养基，其再生菌落数作为对照（B）。
显微镜下观察的原生质体数计为（C）。再生率用下
式计算 ：原生质体再生率 =［（A-B）/C］×100%。
1.2.3 原生质体转化 取 100 μL 原生质体悬液，加
入 10 μg 的高纯度质粒（质粒浓度应在 1 μg/μL 以
上），再加入 25 μL 现用现配的溶液 III（50%（W/V）
PEG-4000、1 mmol/L CaCl2、10 mmol/L Tris-HCl，
pH7.5），轻轻颠倒混匀，冰浴 20 min，取出后缓缓
加入 1 mL 溶液 III，2 mL 溶液 II，轻轻颠倒混匀，
将其与 42℃孵育后以乙酰胺为唯一氮源的 MMSA 上
层筛选培养基（1% 低熔点琼脂糖）混匀后，平铺于
下层 MMS 筛选培养基上，30℃培养 5-7 d。
2 结果
2.1 原生质体制备与再生
2.1.1 培养基对原生质体形成与再生的影响 在接
种量与培养条件相同的条件下，将柠檬酸工业生产
菌株在 CMA 培养基、FC 培养基与 CD 培养基上培
养，采用相同方法制备原生质体，考察培养基种类
对原生质体形成和再生的影响。结果发现，CD 培
养基中菌丝球生长缓慢，培养 48 h 后菌丝长度仅有
10-20 μm 左右，总菌体生物量较低，难以进行原生
质体的制备 ；在 CMA 培养基及 FC 培养基中，菌丝
球生长迅速，菌丝细而长，培养 48 h 后菌丝长度可
达 80-120 μm 左右，总菌体生物量较大 ；CMA 培养
基中菌丝球较密实，FC 培养基中菌丝球较疏松（图
1）。使用 FC 培养基的情况下获得的原生质体数量
达 5.5×106 个 /mL，再生率为 74.5% ；使用 CMA 培
养基形成的原生质体数量为 2.5×106 个 /mL，其再
生率高达 92%。结果表明，使用不同的培养基对菌
丝球形态、原生质体的形成数量与再生率具有显著
影响。综合考虑，CMA 培养基为原生质体制备与再
生的最佳培养基。
2.1.2 菌丝体培养方式对原生质体形成的影响 菌
丝体培养方式影响黑曲霉菌球形态，分别考察了液
体静止培养、液体摇瓶培养、液体摇瓶加玻璃珠培
养对原生质体形成的影响。结果发现，液体静止培
养时菌体漂浮在液体表面，菌体呈球状聚集，菌体
量较少 ；液体摇瓶加玻璃珠培养菌丝体呈球状，菌
丝断裂，玻璃珠不仅没有把较大的菌丝球分解，反
而对菌体有一定的损伤，制备的原生质体数目与再
生率较低，分别为 0.28×106 个 /mL、82.1% ；液体
摇瓶培养菌丝体呈球状，菌体量较大，菌丝细长，
菌球相对疏松，原生质的数目为 1.95×106 个 /mL，
再生率较高为 92.3%。因此，液体摇瓶培养是原生
质体制备的最佳菌体培养方式。
2.1.3 菌龄对原生质体形成与再生的影响 为考察
不同菌龄的菌丝球对原生质体制备与再生的影响，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3174
本试验选取菌龄为 36 h、48 h、60 h、72 h 的菌丝
球进行原生质体的制备。如图 2-A 所示，不同生长
时期的菌丝球对原生质体数量影响较大。菌龄为 48
h 的菌丝球酶解 2.5 h 获得的原生质体数最高，达到
6.5×106 个 /mL，而培养时间更短或更长的菌丝球获
得的原生质体数量都有几倍的降低，表明适度培养
时间的幼嫩菌丝的细胞壁更易被酶解释放出原生质
体。同样原生质体的再生率在菌龄 48 h 时达到最高
（图 2-B），为 98% ；随着菌龄的增长，原生质体再
生率没有明显变化，均超过 90%。
20 μm 20 μm 20 μm
A B C
A ：A. niger 在 CD 培养基中培养 48 h 的菌体形态 ；B ：A. niger 在 CMA 培养基中培养 48 h 的菌体形态 ；
C ：A. niger 在 FC 培养基中培养 48 h 的菌体形态
图 1 柠檬酸工业生产黑曲霉菌株在不同培养基中菌丝球形态
޽⭏⦷%
36
80
82
84
86
88
90
92
94
96
98
100
48 60 72
B7
6
5
4
3
2৏⭏䍘փࡦ༷⎃ᓖ106 њ·mL-1  1
0
36 48 60 72ᰦ䰤h ᰦ䰤hA
2.1.4 酶解体系与浓度对原生质体形成的影响 为
研究柠檬酸工业生产黑曲霉菌株的最佳酶解体系，
采用不同的酶解体系对 CMA 培养基液体摇瓶培养
48 h 的菌丝球进行原生质体的制备。结果（表 1）表
明，用不同配比的酶解液来酶解菌丝球均可获得原
生质体，但是效果不同。当裂解酶、蜗牛酶与溶菌
酶以不同的方式组合时，其裂解效果均比裂解酶单
酶裂解效果好。其中裂解酶的浓度是关键，1.5%
（W/V）高浓度的裂解酶比 1%（W/V）浓度的裂解
酶裂解效果好。总体来看，1.5% 裂解酶、0.5% 蜗
牛酶与 0.2% 溶菌酶的酶解体系原生质体的制备效果
图 2 培养时间 - 菌龄对原生质体制备（A）与再生（B）的影响
最好，达 3.2×106 个 /mL。
表 1 不同酶解体系对原生质体制备的影响
处理
裂解酶
（%，W/V）
蜗牛酶
（%，W/V）
溶菌酶
（%，W/V）
原生质体数目
（106 个 /mL）
1 1 0 0 0.02
2 1 0.5 0 1.8
3 1 0.5 0.2 1.9
4 1.5 0 0 0.4
5 1.5 0.5 0.2 3.2
2.1.5 酶 作 用 时 间 对 原 生 质 体 形 成 与 再 生 的 影
响 为研究柠檬酸工业生产黑曲霉菌株的最佳酶解
2015,31(3) 175张晓立等：黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化
时间，采用 1.5% 裂解酶、0.5% 蜗牛酶、0.2% 溶菌
酶的酶解体系对 CMA 培养基液体摇瓶培养 48 h 的
菌丝球进行原生质体的制备与再生检测。结果（图 3）
表明，随着酶解时间的延长，原生质体数逐渐增加，
2.5 h 达到最高为 1.84×106 个 /mL。同时 2.5 h 时原
生质体的再生率也达到最高为 96.7%。酶解时间超
过 2.5 h 后，原生质体的制备效率与再生率出现明显
的下降。因此，高产柠檬酸生产菌株的原生质体制
备与再生的最佳酶解时间为 2.5 h，并且酶解后应尽
快除去酶解液，以防止过度裂解，降低原生质体的
制备与再生效率。
增加，当原生质体数目达 106 个 /mL 时，转化率为 3-4
个转化子 /μg DNA。
3 讨论
近年来随着传统诱变技术对高产柠檬酸黑曲霉
工业菌株的生产性能提升效果越来越有限，建立有
效的遗传操作系统，通过分子改造提升菌株生产性
能引起了人们的重视。本研究从培养基、菌丝培养
方式、菌龄、酶解体系与酶解时间等不同方面对高
产柠檬酸黑曲霉菌株的原生质体 -PEG 介导的遗传
转化方法进行了系统探索，建立了高产柠檬酸黑曲
霉原生质体遗传转化体系。
菌球形态是影响高产柠檬酸黑曲霉菌株原生质
体制备的一个重要因素。前期研究发现具有不同菌
体形态的产柠檬酸的不同黑曲霉菌株，其原生质体
制备的效果差异较大。例如，黑曲霉野生型菌株菌
球疏松，菌丝细长，形成的原生质体数量多 ；相反
柠檬酸高产菌株菌球密实，菌丝短粗，形成的原生
质体数量较少，不易于原生质体的制备，这可能是
由于菌丝体与酶解体系接触表面积小造成的。
因此提出在保证一定菌体量的前提下，影响菌
丝形态的因素，如培养基与培养方式，都会显著影
响原生质体的形成与再生。本研究发现，CMA 与
FC 培养基尽管都能够使菌体大量快速生长以保证原
生质体制备所需的菌体量，但是培养的菌体形态存
在较大不同。在 FC 培养基中菌丝细长，菌球疏松，
获得的原生质体数多，可达到 5.5×106 个 /mL ；而
在 CMA 培养基中菌球较密实，形成的原生质体数量
较少为 2.5×106 个 /mL，该结果从原生质体制备的
结果来看，菌丝细长，菌球疏松比较利于原生质体
的制备，与朱萍等［17］报道一致。而合成培养基 CD
因为营养成分不足导致菌丝量较少，显然不满足原
生质体制备需要。
液体静置培养方式尽管因为供氧相对不足导致
黑曲霉菌球相对松散，但由于生长过于缓慢，达不
到原生质体制备所需的生长量，因而不适合 ；在液
体摇瓶中加玻璃珠有助于菌体分散，然而我们发现
玻璃珠将细长菌丝打断，反而降低了原生质体制备
与再生效率。在本试验体系中液体摇瓶培养的效果
更好。
޽⭏⦷%B
A 2.0
1.8
1.6
1.2
1.4
1.0
0.8
0.6
0.4
৏⭏䍘փࡦ༷⎃ᓖ106 њ·mL-1 
1 1.5 2 2.5 3.53 4ᰦ䰤h
1 1.5 2 2.5 3.53 4ᰦ䰤h6065707580859095100
图 3 酶解时间对原生质体制备（A）与再生效率（B）
的影响
2.1.6 原生质体转化 采用 PEG-4000-CaCl2 介导的
化学转化法将带有 amdS 筛选标记的质粒 pGm 转化
至柠檬酸工业生产黑曲霉菌株的原生质体中。结果
表明，随着原生质体数量的增加，转化率也相应的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3176
本研究认为影响原生质体形成与再生的另一个
主要因素是细胞壁结构与组成成分。其中一个表现
是菌龄对原生质体的制备与再生影响显著。我们发
现处于对数生长期的培养 48 h 菌体的原生质体制备
和再生效果最好，培养 36 h 的菌体在原生质体形成
和再生方面都是最差的，而超过 60 h 的菌体尽管形
成原生质体的数量低，但对再生效率影响小。这可
能是由于不同生长阶段的菌丝的细胞壁结构与组成
成分不同［12］，对裂解酶系的敏感性不同，形成的原
生质体数目及原生质体再生能力也就不同。过于幼
嫩的菌丝虽然细胞壁容易被酶解，但是相对细胞膜
也容易破裂，因而得到原生质体的产量低 ；即使能
形成原生质体，但也可能由于细胞膜不够完整或者
细胞活力不强，导致细胞再生难度大。而菌龄过长
的菌体细胞壁会沉积不宜被酶降解的物质，不利于
原生质体的形成与释放［18］，原生质体的形成数量减
少，但其细胞结构可能相对完整且细胞活力强，因
而对原生质体再生影响小。
有研究表明黑曲霉原生质体得率与酶解体系组
成及配比关系密切。 Hamlyn 等［19］就曾报道使用微
生物产生的酶复合体或者商品酶的混合液制备原生
质体比单独使用一种酶的效果好。本试验采用的混
合酶系形成的原生质体数量是文献报道［12］的 2 倍。
各种酶的浓度配比和酶解时间需要根据特定菌株的
细胞特性进行优化，原则是既有利于原生质体的释
放，又不要过度酶解降低原生质体的稳定性。原生
质体的浓度和再生率对转化率的影响较大［20，21］。周
礼红等［21］发现较高的转化效率需要合适的原生质
体浓度，本研究中高产柠檬酸黑曲霉菌株原生质体
的浓度只有达到 106 个 /mL 以上，转化效率才显著
提高，低于此浓度则难以获得转化子。由此可见，
由于高产柠檬酸黑曲霉菌株经过复杂诱变，细胞壁
组成与结构复杂，制备高浓度可再生的原生质体是
能够成功完成 DNA 转化的关键。
4 结论
首次成功建立了以原生质体 -PEG 法介导的柠
檬酸生产菌株黑曲霉的遗传转化体系。以丰富培养
基（CMA）液体摇瓶培养 48 h 的菌丝体，采用 1.5%
裂解酶 -0.5% 蜗牛酶 -0.2% 溶菌酶的复合酶解体系
酶解 2.5 h 后，可获得高质量原生质体并可成功进行
DNA 转化，为柠檬酸工业黑曲霉菌株的分子改造奠
定坚实基础。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）