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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
MicroRNAs 是一类短的非编码单链 RNAs，长
度范围在 16-29 nt，以 20-21 nt 居多［1］，最早发现
于线虫 C.elegans 中，广泛存在于动植物和一些病毒
中［2］。越来越多的证据显示 miRNA 在许多生物的
代谢过程中起重要作用，包括组织识别、发育时序
调控、对环境胁迫的应答等［3］。然而，miRNA 并不
收稿日期 ： 2014-04-22
基金项目 ：国家转基因重大专项 2014ZX08011-001，公益性行业（农业）科研专项经费项目（201403075），教育部热带作物新品种选育工
程中心联合资助项目
作者简介 ：杨松楠，男，硕士研究生，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：ysnysn@126.com
通讯作者 ：裴新梧，研究员，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：peixw@mail.caas.net.cn
袁潜华，研究员，研究方向 ：作物栽培、农业生物技术 ；E-mail ：qhyuan@163.com
普通野生稻 miR160f 的克隆和功能分析
杨松楠1  王姣2  陈宗祥2  田新杰1  张静文2  龙艳2  裴新梧2  袁潜华1
（1. 海南大学农学院，海口 570228 ；2. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： MicroRNAs 是一类在调节基因转录后表达中起重要作用的非编码 RNA。miR160 通过调节生长素响应因子（ARF）
参与根细胞的分裂和分化，从而影响根的发育。克隆了普通野生稻 miR160f 基因，并将其转入拟南芥中鉴定功能。结果表明，过
表达 miR160f 的拟南芥莲座叶的数量减少，抽薹时间缩短，开花的时间提前。qPCR 检测显示 miR160f 的靶基因 ARF10、ARF16 及
ARF17 在过表达拟南芥植株中的表达下调，而 ARF10 和 ARF16 蛋白的缺失或减少会导致根冠细胞分化受阻、分裂失控，并导致
根尖干细胞群的异位扩大，因此可以表明 miR160 不仅影响根的发育，还可能与水稻的开花时间相关。
关键词 ： miRNA 花期 普通野生稻 拟南芥 表达载体
Clone and Function Analysis MiR160f in Common Wild Rice（Oryza
rufipogon Griff.）
Yang Songnan1 Wang Jiao2 Chen Zongxiang2 Tian Xinjie1 Zhang Jingwen2 Long Yan2
Pei Xinwu2 Yuan Qianhua1
（1. College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228 ；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural
Sciences，Beijing 100081）
Abstract: MicroRNAs are a class of non-coding RNAs involved in post- transcriptional control of gene expression. Former study on
Arabidopsis thaliana reveals that miR160 involves in root cell division and differentiation by regulating auxin response factors（ARF）thus
influence the root development. This study cloned miR160f gene from common wild rice and transferred into Arabidopsis thaliana to identify
its function. The results showed that over-expression of miR160f decreased the number of rosette leaves, shortened bloting time, leading to
early flowering. RT-PCR showed the expressions of gene ARF10，ARF16 and ARF17 are down-regulation caused by miR160f in transgenic
Arabidopsis thaliana, while the deficiency of ARF10 and ARF16 protein can inhibit root cap cell differentiation, lose control of cell division and
lead to ectopic expansion of apical stem cell populations Therefore, the result demonstrates that miR160 not only influence on root development,
but also may influence flowering time of common wild rice.
Key words: MiRNA Flowering time Common wild rice Arabidopsis thaliana Expression vector
直接控制植物的生长和发育，其功能是通过对它所
作用的靶基因 mRNA 的切割或抑制蛋白翻译实现［4］。
miRNA 参与植物开花及花器官发育，与植物激素信
号传导、叶片发育、植物组织器官形态改变、营养
胁迫、抗逆境胁迫等多种因素相关［5］。
普通野生稻（O. rufipogon）被认为是亚洲栽培
2014年第11期 115杨松楠等：普通野生稻miR160f 的克隆和功能分析
稻（O. sativa）的祖先种，广泛分布于中国、东南
亚和南亚地区。其中，中国南方地区是普通野生稻
的发源地之一，具有丰富的遗传多样性和多种优良
特性，是栽培稻遗传改良的宝贵资源［6］。目前，对
栽培稻 miRNA 的克隆与功能验证已有许多报道，
但对普通野生稻 miRNA 的研究报道较少［7，8］。其
中 miR160 家族与植物生长素信号有关，植物生长
素诱导的转录通过植物生长素响应因子（ARF）促
成 侧 根 的 发 育， 因 此 miR160 家 族 对 侧 根 的 起 始
和种子的发育起调节作用，其家族包括众多成员，
如 miR160a，b，c，d，e，f，g，h，i，m，n，o。
Mallory 等［9］证实，中断 miR160 的转录，其靶基因
ARF10、ARF16、ARF17 mRNA 的表达水平均有增加，
从而改变生长素诱导因子 GH3-like 基因的表达，并
影响另一生长素效应因子 DR5 的正常功能，导致植
株的发育受到严重影响，如产生锯齿状叶片或卷缩
状叶片，花形态改变和可育性降低等。Kantar 等［10］
的研究结果表明，拟南芥 miR160 的靶基因是 ARF10、
16 和 17，其中 ARF10 和 16 共同参与了根冠细胞的
分化，并在根冠处特异表达［11］。在地上部分，miR-
160 通过对 3 个靶基因负调控，参与了生长素初始
应答基因的表达调控，促进了细胞的分裂和增大［12］。
在对水稻的研究中发现，转基因 miR160a 植株在
ABA 的处理下其幼苗根部生长受到抑制，而且从孕
穗期开始，转基因植株的分蘖角度增大，株型发生
改变［13］。在普通野生稻中，还没有相关 miR160 的
研究，本研究克隆普通野生稻中的 miR160f，构建
过表达载体转化拟南芥，并进行功能分析。
1 材料与方法
1.1 材料
普通野生稻材料取自广东省高州野生稻自然保
护区，移栽人工气候箱，取叶片速冻于液氮中，置
于 -80℃冰箱中保存备用。拟南芥选用哥伦比亚生态
型，种子表面灭菌后均匀散布在 MS 培养基上，4℃
春化 3 d，转移到 23℃培养箱培养 5-7 d 后移栽到
土里。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体构建与农杆菌转化 根据本
实验室前期构建的广东高州普通野生稻 sRNA 文
库 中 的 miR160f 茎 环 前 体 序 列［8］， 以 miR160f 茎
环 前 体 为 中 心 的 基 因 组 DNA 序 列 为 模 板， 设 计
带 酶 切 位 点 Bgl（GAAGATCTTC） 的 上 游 引 物 和
BstE Ⅱ（GGGTTACCC） 的 下 游 引 物（ 上 游 引 物 ：
GAAGATCTTCGGATTAACGCTGCCTGGCTCC， 下 游
引 物 ：GGGTTACCCGAGCAAACCCTGCATGACTC）。
以提取的普通野生稻叶片 DNA 为模板克隆得到 165
bp 的片段 pre-miR160f。通过测序验证后再克隆到表
达 载 体 pCAMBIA3301 上， 命 名 为 ：pmiR160f-bar。
利用花序浸染法转化拟南芥，浸染后的拟南芥收取
种子后，播种于含 50 μg/mL Bialaphos Sodium Salt 的
MS 选择培养基用于筛选转基因植株。对 T2 代植株
进行形态学观察。
1.2.2 转基因拟南芥分子检测 提取野生型及转基
因拟南芥基因组 DNA，设计 bar 基因的引物（上
游 引 物 ：TCAAATTCTCGGTGACGGGCA， 下 游 引
物 ：ATGAGCCCAGAACGACGCCC）， 检 测 表 达 载
体是否转入拟南芥中。为了进一步证实转基因植株
中 miR160f 成熟体是否表达，设计茎环 RT 反向引
物（CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCCGGCAATTCAGTT
GAGTGGCATTC）进行 RNA 反转录，再利用 miR160f
上 游 引 物（ACACTCCAGCTGGGTGCCTGGCTC） 和
下 游 引 物（AACTGGTGTCGTGGAG） 进 行 miR160f
成熟体的扩增。成熟体茎环 RT-PCR 步骤参照 Feng
等［14］，扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 转基因拟南芥植株的表型观察 经选择培养
基筛选存活的 T1 代阳性植株收取种子，与野生型种
子同时播种在营养土中于光照 16 h/黑暗 8 h、光照
强度为 180 μmol/ （m2·s）、温度为 22℃、相对湿度
为 70% 的条件下进行培养。转基因植株和野生型植
株各选取 32 株进行表型观察，并对首次抽薹时间、
首次抽薹时莲座叶的数目及首次开花时的植株高度
作统计分析。
1.2.4 miR160f 二级结构及靶基因预测 使用 The
mfold Web Server 在线软件预测普通野生稻 miR160f
的二级结构，psRNATarget（A Plant Small RNA Target
Analysis Server）在线软件预测普通野生稻 miR160f
在拟南芥数据库中的靶基因。普通野生稻 miR160f
成熟序列被提交到 psRNATarget 在线软件并采用默
认参数，miRNA 与其靶基因错配数等于或少于 3 个。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期116
1.2.5 靶基因表达分析 分别设计用于 qPCR 分析
的 miRNA 靶基因和内标基因 Actin 的特异性引物。
引物设计方法及 qPCR 方法参照 Nuria Hierro 等［15］。
在 ABI 7500 Real Time System 上，使用 SYBR® Select
Mix 进行靶基因的 qPCR 反应，检测相关 miRNA 靶
基因在转基因拟南芥和野生型拟南芥中的表达情况。
2 结果
2.1 普通野生稻miR160f前体克隆及载体构建
通过 PCR 从普通野生稻基因组 DNA 中扩增得
到 长 度 为 165 bp 的 普 通 野 生 稻 miR160f 前 体， 使
用 mfold 软件预测其二级结构（图 1），普通野生稻
miR160f 前体形成完美的二级结构。将所测序列与
在线软件预测的普通野生稻 miR160f 的二级结构序
列进行比对，相似性为 100%（图 2）。将普通野生
稻 miR160f 前体克隆到 pCAMBIA3301 上（图 3）。
2.2 miR160f转基因植株的分子检测
以转基因拟南芥 DNA 为模板，在转基因植株中
扩增出 589 bp 的 bar 基因（图 4-A），说明表达载体
成功转入拟南芥植株中。为了检测转基因植株中是
否有普通野生稻 miR160f 的表达，以转基因拟南芥
RNA 为模板，对成熟 miR160f 进行扩增，在转基因
植株中扩增出分子量大小为 70 bp 左右的条带（图
4-B），说明转基因植株中有普通野生稻 miR160f 的
表达。
图 1 普通野生稻 miR160f 前体二级结构
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
35S MiR160f35SBar
T-border T-border
BglĊ BstEĊ
图 3 pmiR160f-bar 载体图谱
图 2 普通野生稻与栽培稻 miR160f 序列比对
1
Query
Color key for alignment scores
30 60 90 120 150
<40 40-50 50-80 80-200 >=200
500
M1 1 2 M2 3 4
589
bp bp
100
70
bp bp
A B
A ：bar 基因检测 ；B ：miR160f 成熟体 RT-PCR 检测 ；M1 ：100 bp marker ；
M2 ：50 bp marker ；1，3 ：野生型植株阴性对照 ；2，4 ：转基因植株
图 4 miR160f 转基因植株的分子检测
2.3 miR160f转基因植株的表型观察
使 用 农 杆 菌 介 导 的 花 序 浸 染 法 将 构 建 好 的
pmiR160f-bar 植物表达载体转入拟南芥植株，待植
株成熟后收集种子，在选择培养基中筛选出转基因
幼苗，然后移栽到营养土中，在光照 16 h/ 黑暗 8 h、
光照强度为 180 μmol/ （m2·s）、温度为 22℃、相对
湿度为 70% 的光照培养箱中培养。成熟后收获种子，
野生型和转基因植株各种植 32 株，对其首次抽薹时
莲座叶数目、首次抽薹时间以及首次开花时植株高
度进行观测统计，并作 3 次生物学重复，结果（表 1）
表明，转 pmiR160f-bar 基因拟南芥莲座叶比野生型
平均少 2 片，抽薹时间平均提前 1 d。由于莲座叶数
目与植物开花存在数量上的关系，莲座叶数少会造
成植物营养期缩短花期提前，这表明 miR160f 可能
2014年第11期 117杨松楠等：普通野生稻miR160f 的克隆和功能分析
与植物开花时间相关。
表 1 miR160f 转基因植株的表型分析
表型 野生型 pmiR160f-bar P 值 差异显著性
莲座叶数（片） 12 10 0.0002 **
抽薹时间（d） 24 23 0.0006 **
植株高度（cm） 5.8 7.0 0.0003 **
*差异显著；**差异极显著
2.4 miR160f在拟南芥中的靶基因预测
将 miR160f 成熟体序列提交至 psRNATarget 在
线软件系统预测其靶基因，所预测的靶基因大多
为 生 长 素 响 应 因 子（ARF）， 如 ARF10、ARF16、
ARF17（表 2）。ARF 家族成员主要在植物生长发育
中起重要作用［16］，生长素的作用表现在 3 个层次 ：
（1）植株水平，如植物的向性运动、顶端优势、侧
根发生等 ；（2）细胞水平，如细胞伸长、细胞分裂
及细胞分化等 ；（3）分子水平，如对生长素快速响
应的基因的表达。
表 2 miR160f 在拟南芥中的靶基因预测
miRNA 靶基因 靶蛋白注释
miR160f
AT1G77850.1 生长素响应因子 17（ARF17）
AT2G28350.1 生长素响应因子 10（ARF10）
AT4G30080.1 生长素响应因子 16（ARF16）
2.5 miR160f靶基因表达分析
由于转基因株系中 miR160f 超表达，被 miR160f
负调控的靶基因表达下调。在拟南芥野生型及转
miR160f 基 因 拟 南 芥 中 检 测 其 靶 基 因 表 达， 结 果
（图 5）表明 ARF17 在转基因株系中表现出明显的
下调，ARF10、ARF16 在转基因株系中出现少许下
调。以往的研究表明，ARF16 蛋白调控植物根的发
育［10，17］，ARF 家 族 受 miR160 调 节，miR160 与 植
物根发育相关。在本项研究中发现了将普通野生稻
中的 miR160f 转入拟南芥后，出现莲座叶数减少，
抽薹时间缩短的性状变化，这说明 miR160f 可能也
与植物的开花时间相关。
3 讨论
目前已在拟南芥、栽培稻、玉米和大麦等多种
植物中发现了 miR160 基因的家族成员，这些家族
成员共有 12 个，包括 miR160a、b、c、d、e、f、g、h、i、m、
n 和 o，其中 miR160f 在栽培稻、小立碗藓、毛果杨、
高粱、豇豆和玉米中被发现［18］。miR160 成熟体在
不同物种中高度保守，这意味着 miR160 在植物生
长发育上发挥重要的功能。
本试验利用过表达的方法将普通野生稻花期相
关 miRNA 的前体基因转入拟南芥中，使其在拟南芥
中高效表达来研究其功能。试验中将带有 miRNA 前
体基因的表达载体通过农杆菌 LBA4404 介导转入拟
南芥基因组中，获得过表达的转基因植株，为进一
步研究 miRNA 的功能提供了试验系统。关于如何选
取 miRNA 前体基因茎环结构的长度，有的研究中
选取含茎环 1 kb 以上的片段进行转化［19］，也有研
究报道称仅选取茎环临近处即可［20］，本研究采用后
者。在进行引物设计时，为了防止原来的茎环结构
在 PCR 退火时阻碍引物与模板的结合，本研究在设
计引物时是从茎环结构两侧外约 10 bp 处开始，然
后通过 mfold 软件分析发现，扩增片段能够较好地
维持原来的茎环结构，即不会影响天然 miRNA 的产
生。当获得过表达 miRNA 植株后，通过对其预测的
靶基因进行 qPCR，来检测相应靶基因的表达量，从
而确定该 miRNA 到底是作用于哪一个靶基因及该靶
基因的具体功能。
许多研究报导了 miR160 调控植物的侧根起始
和种子发育［21］，本研究首次在普通野生稻中克隆
得到 miR160f 的前体，转化模式植物拟南芥，结果
表明转 miR160f 拟南芥植株表现出莲座叶数目减少、
首次抽薹时间缩短等性状变化，由于莲座叶数目与
植物开花存在数量上的关系，莲座叶减少会造成植
物营养期缩短、花期提前，这说明 miR160f 还可能
* 表示与对照 WT 处理相比在 P<0.05 水平差异显著，* * 表示与对照
WT 处理相比在 P<0.01 水平差异显著
图 5 miR160f 靶基因表达分析
ARF17
⴨ሩ㺘䗮䟿
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
*
*
*
*
ARF16 ARF10 WT
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期118
参与植物花期的调控。
同 时， 我 们 利 用 生 物 信 息 学 的 方 法 预 测 了
miR160f 在拟南芥中的靶基因，通过对野生型与转
miR160f 拟南芥中的靶基因 ARF 家族成员 ARF10、
ARF16 和 ARF17 进行表达分析，发现它们的表达均
下调，其中 ARF17 下调表达最为明显，而 ARF 家
族成员多与植物根的发育相关，因此证明了 miR160f
确实参与植物根的发育。
4 结论
本研究克隆了普通野生稻 miR160f 前体基因并
预测出二级结构，在拟南芥中表达 miR160f，结果表
明与野生型拟南芥相比，转 miR160f 拟南芥植株莲
座叶数目减少，抽薹时间缩短，普通野生稻 miR160f
在 拟 南 芥 中 存 在 3 个 靶 基 因 ：ARF10、ARF16 和
ARF17，通过对靶基因进行 qPCR 发现，ARF17 下
调表达最为显著。表明 miR160 不仅影响根的发育，
还可能与水稻的开花时间相关。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）