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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
微生物次级代谢产物是发现与研制新药的丰富
资源之一，多年来已从中发现了为数众多的生物活
性物质。抗生素大部分由放线菌，特别是链霉菌产
生。但随着研究的不断深入，大量的链霉菌等常见
放线菌被重复发现，新的活性物质被发现的几率越
来越少。自 20 世纪 60 年代后期从小单孢菌中发现
庆大霉素以来，人们把关注的焦点逐渐转移到稀有
放线菌的次级代谢产物。近些年来，随着微生物资
源学的不断发展，微生物菌种分离、培养、鉴定等
技术的不断进步，人们从多种自然环境中挖掘到更
多的稀有放线菌株，并从中发现了更多具有新颖结
构和作用机制的代谢产物［1］。因此，对稀有放线菌
收稿日期 ：2012-06-04
基金项目 ：科技部自然科技资源平台项目（2006DKA21203），河北省教育厅资助项目（2009466）
作者简介 ：袁丽杰，女，博士，教授，研究方向 ：微生物与生化药学 ；E-mail ：yuanlijie@sohu.com
一株具有 IMPDH 抑制活性的稀有放线菌的
筛选和鉴定
袁丽杰1，2  刘爱华1  张玉琴2  余利岩2  王茜1  张月琴2 
（1 河北联合大学基础医学院，唐山 063000 ；2 中国医学科学院医药生物技术研究所，北京 100050）
摘 要 ： 从重庆南川药用植物乌头根际土中分离到一株具有次黄嘌呤核苷磷酸脱氢酶（IMPDH）抑制活性的根际稀有放线
菌株。通过菌株形态特征、培养特征观察、生理生化特征测定、细胞化学组分分析及 16S rRNA 基因序列同源性分析等多相分类特
征研究，确定 I06-03147 属于动孢囊菌属（Kineosporia）的菌株。
关键词 ： 根际 稀有放线菌 筛选 鉴定 动孢囊菌属
Screening and Identification of a Rare Actinomycetes Exhibiting
IMPDH Inhibitive Activity
Yuan Lijie1，2 Liu Aihua1 Zhang Yuqin 2 Yu Liyan2 Wang Qian1 Zhang Yueqin2
（1 Hebei United University Medical College，Tangshan 063000 ；2 Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College，Beijing 100050）
Abstract:  One actinomycete strain I06-03147 was isolated from rhizosphere soil of medicinal plant Aconitum carmichaeli Debx. collected
from Chongqing. The fermentation broth of strain I06-03147 exhibited inhibitive activity of IMPDH. In view of morphology, physiological and
biochemical characteristics, chemotaxonomic data, phylegentic analysis based on 16S rRNA gene sequence, the studied strain belonged to genus
Kineosporia.
Key words:  Rhizosphere Rare actinomycetes Screening Identification Kineosporia.
资源的深入挖掘，是提高微生物新药筛选效率的重
要途径和环节。
本研究即围绕新药筛选工作，从药用植物乌
头根际土中分离到一株稀有放线菌株，具有次黄嘌
呤核苷磷酸脱氢酶抑制活性 ；并对其进行多相分类
鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源 I06-03147 分离土样来自重庆南川
药用植物乌头根际土。挖取乌头根，除去根系之间
大量的土壤，将附着于根系上的土壤盛放于样品袋
中备用。
2012年第12期 151袁丽杰等 ：一株具有 IMPDH 抑制活性的稀有放线菌的筛选和鉴定
1.1.2 菌株分离培养基 Mannan- tryptophane 培养基
（%）：甘露聚糖 0.2，色氨酸 0.1，K2HPO4 0.1，重铬
酸钾 0.05，琼脂 1.5，pH7.2-7.4。
1.1.3 发酵培养基 葡萄糖 5 g ；麦芽膏 10 g ；棉籽
饼粉 10 g ；可溶性淀粉 20 g ；酵母膏 5 g ；磷酸氢二
钾 0.5 g ；硫酸铵 5 g ；碳酸钙 3 g ；氯化钠 1 g ；双蒸
水 1 000 mL ；pH7.2。
1.1.4 酵母 -麦芽膏琼脂培养基（ISP2） 酵母浸膏
粉 4 g，麦芽膏 10 g，葡萄糖 4 g，琼脂 12 g，蒸馏
水 1 000 mL，pH7.2。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离 土样采集后置于阴凉处，自然风
干，然后取风干土样 2 g，充分研细，加入生理盐水
18 mL，180 r/min 60 min。取 1 mL 土悬液加入到 9
mL 1% 酚液中，pH7.0，30℃，180 r/min 30 min，取出，
稀释得到 10-3 溶液，0.2 mL/ 平板，均匀涂布，28℃
培养箱培养 7-28 d。根据菌落在平板上形态特征挑
取放线菌。用 ISP2 培养基划线纯化后，保藏于 15%
的甘油中，置于 -80℃保藏。
1.2.2 菌株发酵 将保存于斜面试管中的菌株转接
于 ISP2 斜面培养基，28℃培养 7 d。将生长良好的
斜面培养物接种于含 10 mL 发酵培养基的 50 mL 三
角瓶中，于 180 r/min，28℃发酵 96 h。
1.2.3 发酵液处理 将菌株发酵液离心（4℃，4 000
r/min），上清液用滤膜过滤，倒入平皿中，-20℃冰
箱中冷冻，冷冻真空干燥仪中抽干，称重 ；同时收
集菌丝体，加入 20 mL 丙酮浸泡过夜，过滤，留取
上清，挥干丙酮，50% DMSO 溶解备用。
1.2.4 形态观察 在 ISP2 培养基于 28℃进行埋片培
养，分别于 7、14、21、28 d，取出埋片，用光学显
微镜初步观察形态，选取体现菌丝特征的视野直接
喷金进行电镜观察、拍照。
1.2.5 菌种鉴定 采用国际链霉菌计划中推荐的标
准培养基进行培养特征测定［2］。斜面接种，28℃培
养，分别于 7、14、21、28 d 后观察并记录生长情
况、基内菌丝、气生菌丝、孢子丝及可溶性色素情况。
生理生化试验主要参照 Shirling 和 Gottlieb［2］的方法
和《常见细菌系统鉴定手册》［3］中的方法。细胞化
学分类分析参考相关文献［4-10］。
1.2.6 16S rRNA 基因的 PCR 扩增及其序列分析 采
用 Chelex-100 法 提 取 基 因 组 DNA。PCR 扩 增 16S
rRNA 基因序列采用通用引物。27f（对应 E.coli 8-27
碱基：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3），1525r（对
应 E.coli 1525-1545 碱 基 5-AGAAAGGAGGTGTACC-
AGCC-3）。
PCR 反应条件 ：95℃预变性 5 min，95℃变性 1
min，54℃退火 45 s，72℃延伸 1.5 min，35 个循环 ；
最后 72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物送大连宝生物
公司进行测序。
1.2.7 基于 16S rRNA 基因序列的系统发育分析 利
用 Blast 软件将测序所得 16S rRNA 基因序列在 Gen-
Bank 数据库中进行相似性比较，调出相关模式菌株
的 16S rRNA 基因序列，用 CLUSTAL X 软件［11］进
行多序列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序
列相似性，用 MEGA 2.1 软件包中的邻接法（N-J），
构建供试菌与参比菌之间的系统进化树，分析其系
统发育地位。
2 结果
2.1 菌株分离及其活性
通过土样预处理及放线菌的分离培养基培养，
从药用植物乌头根际土中分离得到 1 株具有次黄嘌
呤核苷磷酸脱氢酶抑制活性的菌株 I06-03147。
2.2 菌株形态
菌株 I06-03147 在 ISP2 培养平板上生长状态见
图 1。菌株橙黄色，基内菌丝体发达。扫描电子显
微镜观察显示，菌体无气生菌丝，基内菌丝高度分支，
且排列为中心放射状，基丝上产生球形或卵圆形孢
子，呈串珠状排列。在分支的基丝末端可见单个球
状孢子（图 2）。
图 1 菌株 I06-03147 在 ISP2 平板上生长 12 d 形态
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期152
2.3 生长特性
菌株 I06-03147 在所有供试培养基上均不形成
气丝。在 ISP2、ISP3、马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂
生长良好，形成丰富的基内菌丝，菌体表面光泽。
菌丝颜色从乳白到橙黄，菌株在 ISP3 和马铃薯浸汁
琼脂培养基上可以产生浅黄色可溶性色素。在不同
培养基上的生长情况，见表 1。
2.4 生理生化特征
菌株 I06-03147 的 pH 值生长范围为 pH6.0-8.5，
最适生长 pH 值为 pH7.0-8.0。最适生长盐浓度为
小于或等于 3%。生长温度范围为室温到 28℃，在
28℃的条件下，菌株生长最快。
菌株 I06-03147 对碳源利用范围较宽，但不能
利用西蒙枸橼酸盐、葡萄糖酸盐、丙二酸盐、苯丙
氨酸、乙酰胺、醋酸盐、黏液酸。不能降解 DNA，
不产生 H2S，淀粉水解阴性、明胶液化阴性。能利
用腺嘌呤、次黄嘌呤、酪蛋白作为氮源，对溶菌酶
敏感，对 0.05% 的酚有抗性。牛奶凝固胨化阳性，
纤维素水解阴性（表 2）。
图 2 I06-03147 在 ISP2 培养基上培养 14 d 的扫描电镜照片
表 1 菌株 I06-03147 的培养特征
培养基 生长 气生菌丝 基内菌丝 可溶性色素
ISP2 良好 - 橙黄 -
ISP3 良好 - 粉黄 浅黄
ISP4 中等 - 黄 -
ISP5 差 - 乳白 -
马铃薯浸汁琼脂 良好 - 土黄 浅黄
察氏琼脂 中等 - 黄 -
营养琼脂 良好 - 黄 -
-. 未生长或未产色素
2.5 细胞化学组分分析
对菌株 I06-03147 全细胞糖型和细胞壁氨基酸
组分分析表明，细胞壁氨基酸中主要含有多量 LL-
DAP 及少量 meso-DAP。全细胞水解液中检测到半
乳糖、葡萄糖。该菌磷脂主要含有 PC。优势醌型为
MK-9（H4）及少量的 MK-8（H4）、MK-9（H6）。优
势 脂 肪 酸 是 C16∶0（28%）、C18∶1（40%）、C18∶0 10
Methyl（10%）。均符合该属菌株特点。
2.6 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析
该菌株基因组 DNA G+C mol% 值为 69.8 mol%。
表 2 I06-03147 的部分生理生化特性测定结果
特征 结果 特征 结果 特征 结果
葡萄糖 + 乳糖 + 黏液酸 -
甘露醇 + 棉子糖 + DNA -
阿拉伯糖 + 松三糖 + β-半乳糖苷 +
木糖 + 糊精 + 0.05% 苯酚 R
半乳糖 + 淀粉 - 0.1% 苯酚 S
山梨醇 + 蕈糖 + 0.5% 苯酚 S
卫茅醇 + 葡萄糖胺 + 1% 苯酚 S
鼠李糖 + 水杨素 + 2% 苯酚 S
肌醇 + 尿素 + 牛奶凝固胨化 +
侧金盏花醇 + 七叶苷 + 纤维素水解 -
果糖 + 西蒙枸橼酸盐 - 腺嘌呤 +
甘露糖 + 丙二酸盐 - 次黄嘌呤 +
D- 核糖 + 葡萄糖酸盐 - 酪氨酸 -
山梨糖 + 苯丙氨酸 - 丙氨酸 -
麦芽糖 + 乙酰胺 - 脯氨酸 -
蔗糖 + 硫化氢 - 酪蛋白 +
松二糖 + 明胶液化 - 几丁质 -
蜜二糖 + 硝酸盐还原 + 黄嘌呤 -
纤维二糖 + 醋酸盐 - 弹力蛋白 -
5% 乳糖 + 酒石酸盐 + 溶菌酶抗性 S
20.0μm 50.0μm
+ 表示菌株可利用此碳源 / 氮源 ；- 表示菌株不能利用此碳源 / 氮源 ；S 表示
菌株对底物敏感 ；K 表示菌株对底物有抗性
2012年第12期 153袁丽杰等 ：一株具有 IMPDH 抑制活性的稀有放线菌的筛选和鉴定
对菌株 I06-03147 16S rRNA 基因序列扩增测序后，
得到 1 44 2bp 碱基（提交 GenBank database 序列号
为 EU438911）。
从 系 统 进 化 树（ 图 3） 可 以 看 出， 菌 株 I06-
03147 在动孢囊菌属中构成一个独立的分枝。其与
该属中 Kineosporia aurantiaca JCM 3230T 之间序列相
似性为 97.5%，与 Kineosporia succinea I-273T 的序列
相似性为 98.3%，即与上述几个标准菌株间同源性
均高于 97%，菌株与该属标准菌株间主要生理生化
特性的差异见表 3。根据《伯杰细菌鉴定手册》对
Kineosporia 属放线菌的描述，同时结合菌株的形态
特征、培养特征、细胞化学组分分析及分子分类特
征结果，可以确定菌株 I06-03147 为动孢囊菌属中的
一个分类单元。
3 讨论
动孢囊菌属（Kineosporia）是由 Pagani 和 Parenti
于 1978 年建立的。该属菌株形态特征较丰富 ；不形
成气丝，基丝高度分支，基丝上可产生球形或卵圆
形孢子，呈串珠状排列 ；在分支的基丝末端可见单
个球状孢子。胞壁含 LL-DAP 和 meso-DAP，可以含
量相似或以其中某一种为主［13］。该属全细胞水解液
主要糖组成含半乳糖、葡萄糖、甘露糖、核糖。磷
脂主要含 PC，优势 MK 是 MK-9（H4），优势脂肪酸
主要含 C16∶0、C18∶1、C18∶0 10 Methyl 及微量的 C16∶0
2OH，不含异式或反异式支链脂肪酸［12，13］。有关该
属菌株的次级代谢产物未见相关研究报道。
到目前为止，在 22 500 多种来自微生物的生
物活性物质中，有 10 100 种由放线菌产生，其中
有 100-120 种得到应用，占应用品种总数的 70%-
75%［14］。因而，放线菌已被认为是开发微生物药物的
重要资源。随着人们对放线菌生存的首选天然场所
土壤的不断挖掘，大量常见放线菌被重复分离，大
量生物活性物质被重复发现，新活性物质被发现的
几率逐渐下降。生境多样性是生物群落多样性甚至
是整个生物多样性形成的基本条件，因此为了减少
大量菌株的重复分离，并扩展放线菌次生代谢产物
的化学多样性，需要在尽可能广泛的特殊的生境环
境中寻找稀有放线菌新资源，这已成为当今微生物
资源学研究的重要内容。
植物根际环境是相对特殊的生境，根在生长过
06-03147
Kineosporia succinea I-273TAB003932
Kineosporia aurantiaca JCM3230TAB003931
Kineosporia rhizophila I-449TAB003933
Kineosporia rhamnosaI-132TAB003935
Kineosporia rhamnosa I-113TAB003934
Kineococcus aurantiacus IFO15268TX77958
0.005
100
94
70
89
图 3 菌株 I06-03147 与相关菌株的系统进化树
表 3 菌株 I06-03147 与动孢囊菌属菌株间表型特性差异
1 2 3 4 5 6
分解
DNA + + + NG + -
七叶甙 + - - - - +
次黄嘌呤 - + - - - +
利用
L-阿拉伯糖 + + + + +- +
D-阿糖醇 + + + + - ND
卫矛醇 - + - +- +- +
肌醇 + + - + + +
D-乳糖 + + + + - +
D-松三糖 + + + + - +
蜜二糖 + + + + - +
甲基 -α-D-葡糖苷 - - - + - ND
棉籽糖 - - + - +- +
D-核糖 + + + + - +
水扬苷 + + + + - +
D-山梨糖醇 - + - - + +
蔗糖 + + + +- +- +
D-海藻糖 + + + + - ND
柠檬酸盐 + - - - - -
NaCl 耐受（%，w/v） <3 <5 <5 <1 <2 <3
1. K. aurantiacaT ；2. K. succineaT ；3. K. rhizophilaT ；4，K. mikuniensisT ；
5. K. rhamnosaT ；6. I06-03147 ；ND. 未检测 ；NG. 未生长
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期154
程中分泌多种成分如氨基酸，单糖等，为生存在根
际环境中的微生物提供直接或间接营养，而微生物
生长过程中产生的各种代谢产物同时也影响植物的
生长。微生物、土壤、植物之间形成特殊紧密关系，
促使根际微生物在种类和数量都有别于非根际微生
物类群［15］。
药用植物蕴涵着种类丰富的生物活性成分，为
医药、化工等领域提供了丰富的原材料。药用植物
大多为根部入药，因此其根部是药效的主要分布区
域。生活于药用植物根际的微生物，由于长期受药
用植物根系分泌物的影响，根际放线菌的种类明显
高于其他植物根际和非根际微生物，且菌种多样性
受药用植物种类的影响很大，同时其产生抗菌物质
和其它生理活性物质的比例也明显高于其它植物根
际以及非根际微生物［16］。赵坷［17］应用分子生态学
技术研究了 7 种药用植物根际放线菌的多样性，结
果表明，同一采样点不同药用植物根际放线菌的
DGGE 图谱差异显著，根际放线菌群落结构在不同
药用植物的影响下发生明显变化。还有报道显示，
从药用植物根际分离的放线菌对临床耐药菌、肿瘤
等表现出广泛的生物活性［18，19］。黄小龙等［20］研究
了海南 12 种药用植物根际放线菌，其初筛阳性率呈
现较大差异，部分来自不同药用植物根际的菌株具
有较高的菌株相似性，但表现出不同的生物活性，
提示药用植物根际放线菌生物活性的差异性可能更
多地与植物种类有关。由此可见，从多种药用植物
根际区域挖掘稀有的放线菌资源是扩展药源微生物
资源的一个重要途径，也是筛选丰富生物活性物质
的重要手段，值得我们深入挖掘和开发利用。
4 结论
菌株 I06-03147 从重庆南川药用植物乌头根际
土中分离得到。该菌株 NaCl 耐受范围是 0-3%，温
度和 pH 值耐受范围是 20-28℃和 6.0-8.5。基内菌
丝发达、分支，白色到橙黄色。无气生菌丝。在马
铃薯和 ISP3 培养基上可产生淡黄色可溶性色素。基
丝上产生球形或卵圆形孢子，呈串珠状排列。在分
支的基丝末端可见单个球状孢子。降解腺嘌呤、酪
蛋白、次黄嘌呤、淀粉。利用核糖醇、纤维二糖、
果糖、半乳糖、葡萄糖、肌醇、乳糖、阿拉伯糖、
松三糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、水杨素、山梨
醇、蔗糖、木糖、鼠李糖、枸橼酸盐、卫茅醇、甘
露糖、核糖、松二糖、蜜二糖、葡萄糖胺及酒石酸
盐作为唯一的碳源。牛奶凝固胨化阳性。水解七叶
灵和尿素，还原硝酸盐，不产生 H2S。对苯酚及溶
菌酶敏感。菌株含有 LL-DAP，meso-DAP，全细胞
水解液中主要含半乳糖。主要磷脂是 PC。优势 MK
是 MK-8（H4），MK-9（H4），MK-9（H6）。优势脂肪
酸是 C16∶0（28%）、C18∶1（40%）、C18∶0 10 Methyl（10%）。
基因组 DNA G+C mol% 值为 69.8 mol%。菌株为动孢
囊菌属（Kineosporia）的菌株，具有次黄嘌呤核苷磷
酸脱氢酶抑制活性。在该属菌株中尚未见此活性报
道，显示了菌株潜在的应用价值，有待进一步深入
研究。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）