全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
随着蛋白分离技术与质谱技术的发展，结合基
因组学和转录组学研究获得的海量信息，对蛋白质
的研究已从蛋白质化学发展到蛋白质组学的研究阶
段，并成为 21 世纪生命科学的重要技术支撑和战
略前沿。蛋白质组学中的蛋白质鉴定、定量以及相
互作用的研究已实现了其对细胞信号转导和相关通
路机制的研究作出贡献的早期设想。新的蛋白质组
学技术在很大程度上推进了细胞信号转导研究的深
入，阐明了细胞信号转导通路是通过蛋白质间相互
作用（protein-protein interaction）从而实现信号传递
收稿日期 ： 2013-06-04
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31160469），内蒙古自然基金项目（2011MS0521）
作者简介 ：王玮鹏，男，研究方向 ：基因工程 ；E-mail ：biometre@gmail.com
通讯作者 ：王志钢，男，研究方向 ：哺乳动物生殖生物学与生物技术 ；E-mail ：lswzg@imu.edu.cn
蛋白质组学技术在细胞信号转导研究中的应用
王玮鹏1  苗芳芳1  武丹丹1  杨军2  王志钢1
（1. 内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021 ；2. 内蒙古呼和浩特市环境科学研究所，呼和浩特 010030）
摘 要 ： 蛋白质组学技术提供了从蛋白质整体活动的角度来研究生命活动规律的手段，为研究细胞信号转导提供了新的方
法和思路。应用于蛋白质分离鉴定中的双向电泳和液质联用等技术有效地促进了细胞信号转导研究中蛋白之间相互作用，分子伴
侣功能的确定，信号通路的关联机制及细胞内信号转导的动态变化等方面的研究。综述近年来蛋白质组学技术在细胞信号转导研
究中的应用情况及所取得的成就，并展望未来的发展前景。
关键词 ： 蛋白质组学 细胞信号转导 串话
Application of Proteomics Technology in Study of
Cell Signaling Transduction
Wang Weipeng1 Miao Fangfang1 Wu Dandan1 Yang Jun2 Wang Zhigang1
（1. College of Life Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010021 ；2. Institute of Enviromental Sciences，Hohhot，
Inner Mongolia，Hohhot 010030）
Abstract:  Proteomics allows for the exploration of the proteome by looking at the intracellular protein interaction and its own unique
activity pattern. This opens the door to studying the cellular signal transduction with new tools and techniques. The application of these new
methods, such as two-dimensional gel electrophoresis and liquid chromatography-mass spectrometry, as used in proteome quantification and
identification, have promoted the study of the cellular signal transduction effectively. This is seen more so in the research of protein interaction,
molecular chaperone functioning, present passway crosstalk, and the dynamic activities of cellular signal transduction. This review presents
proteomic applications and a number of the outstanding achievements accomplished in cellular signal transduction research as well as a
prediction of the prospective application of these findings in the future.
Key words:  Proteomic Cellular signal transduction Cross-talking
的机制。利用蛋白质组学技术进一步确定各种信号
转导通路中的未知分子，实现对这些通路之间的联
系（cross-talk）及所构成的错综复杂的细胞内信号
网络系统更深入的认识是目前的研究热点。
1 蛋白质组学的概念与技术
1.1 蛋白质组学的定义
1994 年澳大利亚 Macquarie 大学的 Wilkins 和
Williams 等在意大利的第一届 Siena 会议上首次提出
了蛋白质组（Proteome）这个概念，并最初定义为“一
个基因组所表达的蛋白质”［1］。目前认为蛋白质组
2013年第11期 47王玮鹏等 ：蛋白质组学技术在细胞信号转导研究中的应用
是指一个基因组所编码的全部蛋白质，蛋白质组学
是指利用直接测定和鉴别蛋白质的高通量方法，大
规模研究蛋白质组的表达动力学和蛋白质相互作用。
蛋白质组学是研究细胞和组织中全部蛋白质的科学，
试图通过蛋白质组学的研究从细胞水平及整体水平
上研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入认识
有机体的各种生理和病理过程。
1.2 蛋白质组学研究领域与技术
对蛋白质组的功能分析是功能基因组学的核心。
蛋白质组学的研究一般可以划分为 3 个领域 ：一是
蛋白质鉴定和分析 ；二是不同生长条件下蛋白质的
泛蛋白质组（proteome-wide）差异显示；三是蛋白质 -
蛋白质相互作用。其运用的技术主要是蛋白质分离
与鉴定技术，同时生物信息学技术也是蛋白质组学
研究技术中不可或缺的部分。
传统蛋白质研究方法的单一应用已经不能满足
目前对蛋白质组研究的要求，在已有方法的基础上
将其整合与创新，已经形成了系统的蛋白质组学分
离与鉴定、蛋白质相互作用与修饰及定量研究技术。
对蛋白质样品的制备通常从样品的预分级开始。常
用的预分级方法如二维高效液相色谱、液相等电聚
焦及膜电泳，亚细胞分级与单细胞水平样品制备等，
主要用以提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度，
并且可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。蛋
白质的分离与鉴定是预分级处理后蛋白质组学研究
中极为重要的一环，双向凝胶电泳（two-dimensional
gel electrophoresis，2-DE） 和 高 效 液 相 色 谱（high
performance liquid chromatography，HPLC） 是 目 前
常用的方法，毛细管电泳（capillary electrophoresis，
CE）则是经典电泳技术与现代微柱分离技术相结合
的产物，具有极高的分辨率，而毛细管色谱（capillary
electro chromatography，CEC）则同时具有毛细管电
泳的高效分离性和 HPLC 的高效选择性。
蛋白质鉴定的主要手段之一便是生物质谱（Bio-
mass spectrometry，Bio-MS），Bio-MS 是 通 过 制 备、
分离、检测气相生物大分子来鉴定化合物的高通量
技术，具有较高特异性与灵敏性。液质连用（liquid
chromatography-mass spectrometry，LC-MS） 是 以 液
相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统对复杂样
品进行实时分析的综合技术，它综合了液相色谱较
宽的分离范围特性与 MS 的高选择性和高灵敏度的
特点，能够实现很好的鉴定效果。在此基础上建立
的 液 相 色 谱 串 联 质 谱 联 用（liquid chromatography-
tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术则将液相
色谱与串联质谱相结合，检测样品即使在液相色谱
难分离的情况下，只要通过多级质谱对目标化合物
进行的中性碎片扫描，即可发现并突出混和物中的
目标化合物，提供更精确的鉴定效果。此外，近年
基体辅助激光解吸电离 - 飞行时间质谱技术（matrix-
assisted laser desorption ionization-time of flight-mass
spectrometry，MALDI-TOF-MS）、Shotgun 混 合 蛋 白
鉴定技术及蛋白质从头测序（De-novo）等技术在未
知样品分析及翻译后修饰鉴定中得到了广泛应用。
同时，蛋白质定量技术近年也逐步发展起来，一是
基于传统双向凝胶电泳及染色基础上的定量，如双
向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescence
difference gel electrophoresis，DIGE），通过三色荧光
染料分别对内标和生物样本进行标记，再通过图像
分析准确地发现差异表达的蛋白 ；另一是基于质谱
检测技术的定量，包括采用差异同位素标记的相对
定量技术，如 ICAT（isotope-coded affinity tag）、SIL-
AC（stable isotope labeling with amino acids in cell）和
iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantita-
tion）等，以及含有特定同位素的目标肽段的绝对定
量技术。值得注意的是，高通量的蛋白质组学技术
的应用是与生物信息学技术的发展分不开的，蛋白
质定性与定量测定结果的分析依赖于生物信息学建
立起来的计算模型和数据库，尤其是未知蛋白的结
构和功能预测更离不开生物信息学的支持。
2 细胞信号转导与分子调控
细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，
它不仅受到时间和空间的限制，还受到营养条件和
细胞内外环境条件的影响。尽管目前对细胞生长和
细胞周期的调节机制了解得很少，但它已经成为了
现代细胞生物学的研究重点，同时也取得了许多重
大进展。细胞内存在许多不同的信号通路来调控细
胞内外刺激所引发的反应，并介导细胞的代谢、增殖、
分化、迁移、周期阻滞或凋亡等生物学过程。信号
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期48
分子是细胞的信息载体，种类繁多。信号分子与靶
细胞表面受体或胞内受体的特异性结合将受体活化
后可以启动靶细胞内一条或多条信号转导途径从而
引发细胞代谢或基因表达的改变，进而调控细胞生
长与分化［2］。
尽管不同的信号通路具有各自不同的调节机制，
但准确的信号传递则需要各个通路之间的交叉作用
（cross-talk）从而进一步形成复杂的细胞内信号网络
（intracellular network）。随着细胞内新的信号分子的
不断发现和鉴定，细胞内信号网络愈加复杂，针对
单一信号分子的研究技术和方案已难于满足对细胞
生理活动的全面了解的需要。蛋白质组学技术在细
胞信号转导研究中的应用为我们揭示了细胞内复杂
的信号网络系统，鉴定信号分子复合物，探讨蛋白
质间相互作用的分子基础，新伴侣分子的发现，以
及已知通路之间的交叉和实现细胞信号转导的动态
变化研究提供了重要手段。
3 蛋白质组学技术在细胞信号转导研究中的
应用
3.1 在蛋白质之间相互作用中的应用
免 疫 共 沉 淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）
和酵母双杂交技术是研究蛋白之间相互作用的基本
方法。Co-IP 是用抗体将相应特定分子沉淀的同时，
与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉
淀出来的技术，这种技术常用于验证蛋白质之间相
互特异性结合。酵母双杂交技术则是在单细胞真核
生物酵母在体内利用“诱饵蛋白”（bait）捕获“猎
物蛋白”（prey），二者在细胞内相互作用后形成转
录激活复合物从而启动报告基因表达。此外，融合
蛋白沉降技术与免疫荧光技术也广泛适用于蛋白质
相互作用的研究。pull-down 技术是利用 GST 对谷胧
甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液
中纯化相互作用蛋白，常采用原核表达纯化技术，
适用于体外研究蛋白质在溶液中的相互作用。近年
单分子操作技术、荧光共振能量转移（fluorescence
resonance energy transfer，FRET）技术也有应用于蛋
白质 - 蛋白质相互作用研究的报道，使得蛋白之间
的相互作用检测实现了直接可测。蛋白质芯片技术
目前得以广泛应用，可将待检测的蛋白混合样品与
结合到固相基质上的蛋白质相杂交，从而实现对未
知蛋白的分离和鉴定。由于蛋白质芯片的高特异性
和敏感性，结合质谱、荧光、显色等方法可以直接
或间接地鉴定出与靶蛋白相结合的蛋白质，适用于
高通量的蛋白质表达谱分析。
蛋白质复合体在细胞内行使多种功能。鉴定
蛋白质复合体的亚基是理解蛋白质复合体功能的基
础。Guerrero 等［3］发明了一种体内串联亲和纯化交
联蛋白质复合体的定量分析（quantitative analysis of
tandem affinity purified in vivo cross-linked（X）protein
complexes，QTAX）技术来描述体内蛋白质间相互作
用（protein-protein interaction，PPI），并利用这一策
略成功绘制了酵母中 26S 蛋白酶体（细胞内降解蛋
白的蛋白质复合体）的相互作用网络。26S 蛋白质
复合体中有 64 对潜在的 PPI，其中 42 对是新发现
的相互作用。
较为复杂的研究则包括许多非常规的蛋白质组
学手段。例如，酵母是研究 G-蛋白偶联受体（G-pr-
otein coupled receptor，GPCR） 信 号 通 路 的 一 种 模
式生物。GPCR 研究为理解丝裂原活化蛋白激酶
（mitogen activated protein kinase，MAPK） 通 路 包 括
交配信息素（mating pheromone）的应答提供了基
础。Gruhler 等使用 13C6-Lysine 和
13C6-Arginine 标记，
对赖氨酸和精氨酸营养缺陷型酵母交配信息素诱导
的磷酸化改变进行定量蛋白质组学分析，用固定
化金属离子亲和层析（immobilized metal ion affinity
chromatography，IMAC）富集磷酸化肽段 ；在离子
阱（ion trap）中大量发生中性丢失的离子可被进一
步 分 离、 碎 裂 和 分 析， 这 称 为 MS/MS/MS（MS3）。
准确的母离子质量结合 MS3 图谱信息，可以提高几
个数量级的磷酸肽鉴定可信度。该研究以混合线性
离子阱 - 傅立叶变换粒子回旋共振（linear ion trap-
Fourier transform ion cyclotron resonance，LTQ-FTICR）
质 谱 仪 进 行 MS/MS 和 中 性 丢 失 导 向（neutral loss-
directed）的 MS3 分析，提高对磷酸肽检测及鉴定的
灵敏度和准确性。利用 MS/MS 扫描自动触发数据依
赖的 MS3 对中性丢失的母离子进行碎裂，这一中性
丢失依赖的MS3 运行模式会出现特征性磷酸丢失（-98
Da），通过 2 次连续的串联质谱对磷酸肽进行测序。
共鉴定了 700 个磷酸肽，其中 139 个表达变化在 2
2013年第11期 49王玮鹏等 ：蛋白质组学技术在细胞信号转导研究中的应用
倍以上，主要是 MAPK 信号通路成员［4］。
3.2 在分子伴侣研究中的应用
分子伴侣是存在于细胞中，帮助蛋白质正确
折叠使之正常行驶功能的小分子蛋白质，对细胞内
的信号转导具有重要意义。近几年应用蛋白质组学
技术在分子伴侣的相关研究中取得了较大的进展
（表 1）。
3.3 在信号转导通路之间的关联与机制研究中的
应用
细胞信号传导是细胞通过胞外或胞内的刺激后，
激活受体而改变细胞内生理机能的过程，这种刺激
可以是很小的分子、蛋白、甚至是光子，细胞经过
刺激后通过基因表达水平的改变对外界刺激做出回
应。通过对调节生长发育起关键作用的信号通路分
表 1 应用蛋白质组学技术发现的重要分子伴侣及相关功能
分子伴侣 相关蛋白 相关功能或疾病 所属信号通路 应用技术
Hsp90 BMPRs，SMADs 转移性骨肿瘤形成的乳腺癌、
前列腺癌和肺癌
p38，JNK，Erk5
Co-IP，MS，HLPC，FRET 细胞化学，荧
光免疫技术［5］
Hsp90 Sin1，hVps34，VPS15RAPTOR Bcr-Abl 白血病 PI3K-AKT-mTOR
Hsp90 IKBKAP，TBK-1，TAB1，PKD2 原发性骨髓细胞转化 MAPK，NF-κB Co-IP，MS，LC-MS，Western Blot，
SILAC，FPR，LSCM-荧光技术［6］Hsp90 Raf-1，A-Raf，ERK，p90RSK，Vav 骨髓性白血病 MAPK，NF-κB
Hsp40，70 α-Syn，CSPα，NRG1，c-jun 神经衰退型疾病
e.g. 帕金森，阿兹海默氏病
-- ESI-MS，MPF，CEC［7］
Hsp70，90 IL-6 系统性红斑狼疮 -- 免疫细胞化学，荧光技术，Western［8］
Hsp90 eNOS，Sgt1 细菌鞭毛运动，真菌耐药性 -- Co-IP，Western，免疫荧光技术［9］
Hsp104 Hsp104 Sub，Sup35（cross-b） 诱发蛋白质解聚 -- AC，荧光蛋白标记与灵敏度检测技术［10］
表 2 应用蛋白质组学技术发现的重要通路交叉位点及相关功能
目标蛋白 作用蛋白 交叉位点 相关功能或疾病 相关信号通路 应用技术
Gli1 S6K1 Gli1 EAC 食道癌 TNF-α/mTOR，mTOR/
S6K1，Hedgehog
荧光素酶测定，Western，荧
光免疫技术［12］
YAP mTORC1 YAP 器官发生 PI3K/mTOR，Hippo 免疫组织化学，荧光技术［13］
GAB
RAF
ERK
AKT
TSC2，mTORC1 细胞癌变与凋亡 Ras/MAPK，Hippo，
PI3K/mTOR
Co-IP，Bio-MS，免疫细胞化
学［14］
Ikk2 Hes1，Hey1，Tnf-α，Hes1 Ikk 胰腺癌，瘤原性的炎症 NF-κB 免疫荧光技术，流式细胞术，
荧光素酶技术，RT-PCR［15］
Srcs，Syks FAK，Pyk NF-κB 免疫系统、应激反应、细胞
凋亡与分化
NF-κB 流式细胞术，免疫荧光技术［16］
A/Smad2，3 Nanog Gsk3β（Wnt） 多能干细胞的胞内信号通路 PI3K/Akt Western，免疫荧光化学，转
录标记技术［17］
EGFR PRMT5 ERK 蛋白质甲基化修饰 ERK Co-IP，光谱测技术［18］
子进行研究发现，应答过程不是一条通路的作用结
果，而是不同通路之间交互的调控作用结果［11］。随
着蛋白质组学的发展，对于细胞通路的交叉作用的
研究显得极为重要。通过研究不同通路之间的交叉
作用，发现了一些重要通路间的交叉位点（表 2）。
4 小结
虽然蛋白质组学技术已经给相关研究带来了许
多指导性的结果，但是相关的技术仍具有很大的发
展空间。首先是蛋白质的分析与鉴定方面，将某个
蛋白质组样品中的所有蛋白质分离并检测仍然是不
现实的，目标蛋白质过低的丰度，特殊的蛋白质修
饰等都对此技术的发展造成了阻碍。这样便限制了
对未知的细胞信号通路中或已知的通路中未知蛋白
质的发现。此外，将一个蛋白质相互作用组与另一
个相比较几乎是不可实现的，两个相互作用网络间
的比较仍然没有很好的方法能够完成，这限制了信
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期50
号通路间交叉作用的研究。倘若这一技术得到发展，
两个相互作用网络的差异得以方便地确定，则会大
大增进通路间交叉作用的新发现。
未来蛋白质组学在信号转导研究中可能会更加
侧重于生命体依赖的复合物、通路以及网络的形式
来协调蛋白质之间的相互作用的研究方向。例如，
目前通路间的蛋白质相互作用网络是一个相对静态
的连线图，需要将基因敲除及系统扰动等数据加入
进来，以期认识信号转导作用的本质，发现网络的
核心。除此之外，如何在不影响细胞的正常生理条
件下的活细胞分析及检测动态的蛋白间相互作用仍
然会是研究的热点。
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（责任编辑 狄艳红）