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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):209-215
类维生素 A，包括视黄醇及其衍生物［1］，调控 着细胞的分化、增殖与凋亡［2］。近年来研究表明，
收稿日期 ：2014-11-24
作者简介 ：袁源，硕士研究生，研究方向 ： 二型糖尿病与肥胖的分子病理研究 ；E-mail ：stacyy116@hotmail.com
通讯作者 ：陈亚琼，博士，研究方向 ：二型糖尿病与肥胖的分子病理研究 ；E-mail ：yqchen@sibs.ac.cn
视黄酸刺激 RARE 调控荧光素酶报告基因表达系统的
构建与应用
袁源  陈亚琼
（中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所，上海 200031）
摘 要 ： 类维生素 A，通过视黄酸（retinoic acid，RA）代谢旺盛组织的靶基因调控，与生物节律通路相互作用，在代谢性
疾病发展过程中发挥着重要作用。在 293T 及小鼠肝原代细胞中，构建视黄酸反应元件（RARE）调控的荧光素酶报告基因表达系统，
为研究类维生素 A 与节律和代谢研究中靶基因上游调控信号分子提供可能。用定点突变 PCR 方法在 pGL3-Basic 载体中插入 RARE
片段，检测报告基因表达及 RARE 对视黄酸响应的半数有效浓度（EC50），初步筛选可能调控 RARE 的靶基因，通过酶切连接将
荧光素酶报告基因 Luciferase 和启动子 RARE 片段构入穿梭载体 pShuttle，转入感受态细胞 BJ518 获得重组腺病毒载体 Ad-Basic-
RARE-Luc，转染 MGH 细胞并进行扩增，在小鼠肝原代细胞检测腺病毒活性。结果显示，构建的 RARE 调控的荧光素酶报告基因表
达载体在 293T 细胞可被 RA 刺激，RARβ 促进 RA 刺激 RARE 表达，而 CRY1 抑制 RARE-Luc 对 RA 的响应，并成功构建了在小
鼠肝原代细胞响应 RA 刺激的 Adeasy-Basic-RARE-Luc 腺病毒载体。
关键词 ： 视黄酸 ；RARE ；荧光素酶报告基因 ；节律 ；代谢
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.033
Construction and Application of RARE-regulated Luciferase Reporter
Gene System Stimulated by Retinoid Acid
Yuan Yuan Chen Yaqiong
（Institute for Nutritional Science，Shanghai Institutes for Biological Sciences，Chinese Academy of Science，Shanghai 200031）
Abstract: Biostearin plays a crucial role in the development of metabolic diseases by target gene regulation of retinoic acid（RA）in
metabolically active tissues and interaction with circadian pathway. The luciferase reporter gene system regulated by retinoic acid response
element（RARE）was constructed and expressed in 293T and primary hepatocyte of a mouse, which provides the possibility for studying
biostearin and circadian, as well as signaling molecules of upstream regulation of target genes in researching metabolism. By PCR-based site-
specific mutagenesis, RARE promoter was inserted into multiple clone sites of pGL3-Basic vector. In 293T cells, we detected the gene expression
and half maximal effective concentration（EC50）of RARE responding to RA and screened the possible target genes of regulating RARE. The
pGL3-RARE-Luc plasmid and pShuttle vector were digested by restriction enzyme and ligated. Through transformation into competent cell BJ518
the recombinant adenovirus vector Ad-Basic-RARE-Luc was obtained and amplified after transfection to MGH cells. The activity of recombinant
adenovirus was detected in primary hepatocyte of a mouse with Dual-luciferase Reporter Assay System. The results indicated that luciferase
reporter gene vector regulated by RARE in 293T cells was stimulated by RA. RARβ promoted the stimulation of RA in RARE regulation, and
CRY1 prohibited the response of RARE-Luc to RA. The adenovirus vector Adeasy-Basic-RARE-Luc responding to RA stimulation in primary
hepatocyte of a mouse was constructed successfully.
Key words: retinoid acid ；RARE ；luciferase reporter gene ；circadian ；metabolism
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6210
在代谢性疾病发展过程中，类维生素 A 发挥着重要
作用。类维生素 A 通过调控靶基因表达进而调节哺
乳动物的糖脂代谢，被认为是糖尿病，肥胖等重要
的治疗靶点。报道称 RA 过量会引起小鼠体重减轻，
白色脂肪减少［3，4］，改善小鼠胰岛素敏感性［4］。有
研究表明维生素 A 还影响着生物钟和节律，尤其是
视黄酸（retinoid acid，RA）信号通路与生物钟信号
通路相互调节［5］。肝脏是维生素 A 主要的吸收代谢
场所，同时也高表达节律基因参与机体生物钟调节，
此外在中枢神经系统发现高表达 RARα，其转录
mRNA 水平呈周期性变化，有力证明了 RA 影响中
枢生物钟［6］。越来越多的证据表明生物节律紊乱和
糖尿病肥胖等代谢性疾病有着重要关系，如 CRY1
节律基因过表达可以降低血糖以及改善 db 糖尿病老
鼠胰岛素敏感性［7］。RA 作为维生素 A 中最主要的
具有转录活性的组分，通过与视黄酸受体（Retinoic
acid receptors，RARs）和类视黄醇 X 受体（Retinoid
X receptors，RXRs）结合［8］，调控超过 500 种基因
的表达。众多功能各异的维生素 A 靶基因的启动子
序列中均含有两个重复的 PuG（G/T）TCA 的位置［9］，
即视黄酸反应原件（RARE）。RARs 和 RXRs 形成
的异源二聚体可以结合到 RARE 上，调控靶蛋白的
转录。类维生素 A 对代谢的调控主要是通过 RA 代
谢旺盛组织的基因调控实现的，但其具体的的分子
机制还不清楚。因此研究肝脏类维生素 A 对节律调
控以及代谢的信号通路具有深远意义，而 RA 对其
靶基因调控的分子机制是一个重要方向，RARE 可
能可以作为研究类维生素 A 与靶基因调控的重要位
点。本研究通过构建 RARE 元件调控的荧光素酶报
告基因表达系统，更直接高效地筛选出影响 RARE-
Luc 对 RA 响应敏感性的基因，并构建在小鼠肝原代
细胞表达的 RARE-Luc 腺病毒表达载体，更好地模
拟小鼠体内信号通路，旨在为进一步探寻 RA 调控
代谢靶基因的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
pGL3-Basic 荧光素酶报告基因质粒及 pShuttle
穿 梭 载 体 质 粒 购 于 Promega， 大 肠 杆 菌 XL-1 Blue
及 BJ 5183 为本实验室保存，人胚胎肾细胞株 293T
及 MGH 细 胞 由 本 实 验 室 保 存，C57 正 常 小 鼠 购
自 南 京 模 式 动 物 研 究 所。Kpn I-HF、Sal I-HF 及
T4 连 接 酶 购 自 NEB 公 司，Cutsmart 酶 切 缓 冲 液
（BioLabs）、细胞培养液 DMEM（GIBCO）、胎牛血清
（Hyclone）、胰蛋白酶 Trypsin、M199 和 HBSS 缓冲
液购自 Invitrogen，HEPES、台盼蓝染液和胶原酶购
自 Sigma，DNA ladder marker V、6×loading buffer 及
2×Taq Master Mix 购自莱枫 DNA 胶回收试剂盒（Bio
Dev-Tech），Prime Star HS DNA Polymerase 和 5×PS
buffer 来自 TaKaRa。荧光素酶报告基因检测系统
（Thermo Scientific），Master Flex 蠕动泵（Cole-Parmer
Instrument Company）。
1.2 方法
1.2.1 定点突变 PCR 根据 GenBank 提供的 RARE
序列，参照 pGL3-Basic-Luc 序列，根据引物设计原
则，用 Primer5 软件设计一段完全互补的引物序列。
所用引物由上海桑尼生物科技公司合成。正向引物：
TAT CGA TAG GTA CCG AGC TCG CGA GTT CAG
CAA GAG TTC AGC CGG CGA GTT CAG CAA GAG
TTC AGC CGG GGC TCG AGA TCT GCG ATC，反向
引物 ：AGA TCG CAG ATC TCG AGC CCC GGC TGA
ACT CTT GCT GAA CTC GCC GGC TGA ACT CTT GCT
GAA CTC GCG AGC TCG GTA CCT ATC GAT。
取 10 ng pGL3-Basic 质粒，用 PrimerStar 试剂盒
进行 20 μL 体系 PCR 反应 ：93℃ 3 min，93℃ 30 s，
60℃ 30 s，72℃ 4 min，22 个循环，72℃ 5 min，最
后 4℃保存。取 PCR 反应前后样品通过 1% 琼脂糖
凝胶电泳方法鉴定长度，分别在 4 600 bp 和 4 800
bp 左右。将 PCR 产物用 Dpn I 在 37℃ 酶切 2 h，将
酶切后产物转化涂板 ：将 XL-1 Blue 感受态从 -80℃
取出，放置冰上 10 min，加入 Dpn I 酶切产物再在
冰上静置 15 min，在 42℃水浴锅热击 1 min，然后
放回冰上 10 min，取 300 μL 含 Kam 的 LB 液体培养基，
在 37℃ 摇床培养 30 min，涂含有 Kam 抗生素 LB 平
板，37℃培养过夜，挑单克隆测序。
1.2.2 pGL3-Basic-RARE-Luc 质粒转染和报告基因
检测 将培养的 293T 细胞用含有 10%FBS 的 DMEM
培养基接种于 24 孔细胞培养板，37℃培养箱培养
约 18 h 后，细胞长到 80% 左右，用脂质体瞬转细胞
2015,31(6) 211袁源等：视黄酸刺激 RARE 调控荧光素酶报告基因表达系统的构建与应用
的方法，通过 PEI 介导，每个孔共转染 50 ng pGL3-
Basic-RARE-Luc 和 25 ng 内 参 质 粒 pRSV-Renilla，
6 h 后换液加入 RA（1 μmol/L），18 h 后去掉培养基，
用荧光素酶报告基因裂解缓冲液裂解细胞，静置 10
min 后，取上清分别检测 Luc 和 Renilla 报告基因表达：
50 μL 裂解液加 50 μL 报告基因显色液。用 Renilla
报告基因的表达量对 Luc 进行校正，以 Luc/Renilla
比值作为最终的报告基因活性。
1.2.3 重组穿梭质粒 pShuttle-Basic-RARE-Luc 的构
建 取测序正确的 pGL3-Basic-RARE-Luc 和 pShuttle
质粒，用 Kpn I-HF 和 Sal I-HF 进行双酶切，40 μL
反 应 体 系 如 下 ：pGL3-Basic-2RARE-Luc 和 pShuttle
质粒各 500 ng，用 ddH2O 补平至 33.2 μL，Cutsmart
酶切缓冲液 4 μL，BSA 0.4 μL，Kpn I-HF 和 Sal I-HF
各 1.2 μL。37℃培养箱酶切 5 h，酶切产物用 1% 琼
脂糖凝胶进行鉴定，根据预估目的片段大小，切胶
并用 DNA 胶回收试剂盒进行回收纯化。测定回收
DNA 浓度，按照如下体系进行连接 ：10 ng pShuttle
酶切产物，2 μL T4 ligasion buffer，1 μL T4 连接酶，
实验组加入 pGL3-Basic-RARE-Luc 酶切产物补平至
20 μL，对照组则加入等体积的 ddH2O 至 20 μL 室温
连接过夜。连接产物取 10 μL 用于转化 XL-1 Blue 感
受态（转化步骤同前），涂含有 Kam 抗生素 LB 平板，
37℃培养过夜，挑单克隆送上海博尚测序公司测序。
1.2.4 重 组 腺 病 毒 载 体 Adeasy-Basic-RARE-Luc 的
构 建 取 测 序 正 确 pShuttle-Basic-RARE-Luc 质 粒
10 μg 用 Pme1 酶 切 ：cutsmart buffer 44 μL，BSA 0.4
μL，Pme I μL。37℃恒温培养箱酶切 5 h。酶切产
物用 DNA 胶回收纯化试剂盒进行纯化，用 50 μL
ddH2O 洗脱，取一半用于转化 BJ5183 感受态（同
XL-1 Blue 转化步骤，37℃摇床活化 30 min，涂 Kam
LB 平板，37℃恒温培养箱培养过夜，挑取单克隆）。
用 质 粒 小 抽 试 剂 盒 提 取 质 粒， 用 50 μL ddH2O 洗
脱，取 30 μL 用 PacI 酶切鉴定 ：30 μL 洗脱的质粒，
buffer I 4 μL，BSA 0.4 μL，Pac I 0.7 μL ddH2O 补平到
40 μL。37℃酶切 5 h 后，用 0.8% 琼脂糖凝胶鉴定，
如果酶切产物有 30 kb 左右和 4.5 kb（或 3 kb）两条
片段，则认为 Adeasy-Basic-RARE-Luc 重组质粒构建
正确，可转 XL-1 Blue，摇菌并中抽质粒，可用于包
装腺病毒。
1.2.5 腺病毒包装与扩增 取 60 μg 重组腺病毒载体
Adeasy-Basic-RARE-Luc 在 30 μL Buffer I，15 μL BSA
和 15 μL Pac I 体系酶切 4 h，酶切产物用 DNA 回收
纯化试剂盒纯化，最后用 50 μL ddH2O 洗脱。在长
到 80% 左右的 10 cm MGH 培养皿中加入纯化过的
酶切产物，37℃细胞培养箱培养 1-2 周，等细胞几
乎全部漂起，收培养基得到第一代包装成功的腺病
毒。选取活力较好，可在传代后 3 d 内长满的 MGH
细胞，在 MGH 长满的 15 cm 细胞培养皿中加入包装
成功的第一代腺病毒。等待细胞全部漂起后，收取
培养基，加入到 6 个长满的 MGH 15 cm 细胞培养皿
中，等待细胞全部漂起，收获的培养基再感染 30 个
长满的 MGH 15 cm 细胞培养皿，收获全部漂起的细
胞，6 000 r/min 离心 8 min，离心下来的细胞沉淀用
10 mL PBS 重悬，补足到 20 mL，在液氮中冻融 3 次，
每次 10 min，储存在 -80℃。把上清收集到一个新的
广口瓶，按照 242.3 g/L 加入硫酸铵，在室温搅拌 2
h，6 000 r/min 离心 6 min，去掉上清，沉淀用 10 mL
PBS 重悬，补足到 20 mL，储存在 -80℃。
1.2.6 原代肝细胞分离与重组腺病毒活力检测 准
备肝原代分离所需的缓冲液：冲洗缓冲液（HBSS+50
mmol/L HEPES+5 mmol/L EGTA）， 消 化 缓 冲 液
（HBSS+50 mmol/L HEPES+5 mmol/L EGTA+5 mmol/L
CaCl2+30 mmol/L 胶原酶），预热到 37℃。选取正常
C57 小鼠，称重，按照 6 μL/g 体重腹腔注射 10% 水
合氯醛。等老鼠麻醉后，打开老鼠腹腔，将针管刺
入肝门静脉，打开蠕动泵，灌流冲洗缓冲液把血冲
干净，换消化缓冲液灌流。关掉蠕动泵，把整个肝
脏组织剪下来，放入冲洗缓冲液中，在超净台用镊
子和剪刀把细胞刮下来，用 250 μmol/L 尼龙滤网进
行过滤，滤液 600 r/min 离心 2 min。去掉上清，加
入无血清的 M199 培养基重悬混匀，600 r/min 离心 3
min，去掉上清，用 30 mL 含有 10% FBS 的 M199 培
养基重悬混匀，取 100 μL 重悬液与 100 μL 台盼蓝染
液混匀涂板计数，按照每个孔 20 万细胞种在已经包
被好的 24 孔板。37℃培养 4 h 后，去掉培养基，换
成无血清 M199 培养基，在实验组加入重组腺病毒，
对照组加入 GFP 腺病毒，培养过夜。第 2 天换液加
入 RA 1 μmol/L，2 h 后去掉上清，裂解细胞，检测
荧光素酶报告基因表达。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6212
2 结果
2.1 pGL3-Basic-RARE-Luc的活性鉴定
将测序正确的定点 PCR 突变产物 pGL3-Basic-
RARE-Luc 在 293T 细胞中瞬转，以 RSV-Renillla 作
为对照，6 h 后加入 RA，18 h 后检测报告基因的表达，
结果（图 1）显示，用 Renilla 检测值校正后，pGL3-
Basic-RARE-Luc 的报告基因活性明显高于空白对照，
相对活性约为 1.4（Luc/Renilla），具有统计学意义，
说明 pGL3-Basic-RARE-Luc 能在 293T 细胞中正常表
达。加入 RA 后，表达活性增强 4 倍左右，RA 能促
进 pGL3-Basic-RARE-Luc 报告基因的表达，差异均
具有统计学意义。
约为对照的 2-3 倍 ；与 β-Gal 空白对照相比，RARβ
增强 RARE-Luc 对 RA 刺激的响应，而 HA-CRY1 下
调 RA 促进的 RARE-Luc 的表达，差异均具有统计
学意义。
-
- -
+ +
+
8
6 ***
***
4
2
0
pGL3-RARE-Luc
R
A
R
E-
Lu
c/
R
R
RA
图 1 pGL3-Basic-RARE-Luc 在 293T 中报告基因活性检
测及对 RA 的响应
2.2 pGL3-Basic-RARE-Luc对RA的响应受RARβ
和CRY1调控
在 293T 细胞中瞬转 pGL3-Basic-RARE-Luc，同
时过表达 RARβ，以 RSV-Renillla 作为对照，6 h 后
加入 RA，从 10 μmol/L 依次 10 倍稀释，设置 8 个
浓度梯度，18 h 后检测报告基因的表达，绘制曲
线 求 得 EC50。 结 果（ 图 2-A） 显 示 RARβ 过 表 达
后，pGL3-Basic-RARE-Luc 对 RA 响应的 EC50 值从
53 μmol/L 降低到 93 nmol/L，差异具有统计学意义，
说明 RARβ 增强 RARE-Luc 对 RA 刺激响应的敏感
性。以 RARβ 作为阳性对照，β-Gal 作为空白对照，
在 293T 细胞中过表达 HA-CRY1，检测 RA 刺激（1
μmol/L）下 RARE-Luc 报告基因表达，结果（图 2-B）
显示与对照组比，RA 显著促进 RARE-Luc 的表达，
-14 -12 -10 -8 -6 -4
0
20
40
60
-
RARβ
LgM, RARARE-Luc/RRA
0
100
200
300
400 B-Gal
RARβ
HA-CRY1
RAμmol·L-1 0 1*****RARE-Luc/RRB
A ：在 293T 细胞中 RA 刺激 pGL3-Basic-RARE-Luc 的 EC50 检测及受 RARβ
的影响 ；B ：HA-CRY1 对 pGL3-Basic-RARE-Luc 响应 RA 刺激的调控
图 2 RARβ 和 CRY1 调控 RARE-Luc 在 293T 细胞对 RA
的响应
2.3 重组穿梭质粒pShuttle-Basic-RARE-Luc的构建
对 载 体 pShuttle 和 构 建 正 确 的 pGL3-Basic-
RARE-Luc 用 Kpn I-HF 和 Sal I-HF 进行双酶切，以
酶切前质粒作为对照，用琼脂糖凝胶电泳对酶切产
物进行检测。载体 pShuttle 双酶切产物琼脂糖凝胶
电泳显示（图 3），与酶切前对比，在 6 000 bp 左
右有一条清晰的带，与理论值相符，pGL3-Basic-
RARE-Luc 酶切前条带在靠近 5 500 bp 处，双酶切
后产物显示有两条清晰的条带，分别在 3 500 bp 和
2 500 bp，2 500 bp 和 1 500 bp 之 间，RARE-Luc 酶
切片段理论值应该在 1 700 bp 左右，即靠下面的一
条（1 500 bp 和 2 500 bp 之间）。切下来正确的片段
用于胶回收以及后续的连接反应，构建重组穿梭质
粒 pShuttle-Basic-RARE-Luc。
2015,31(6) 213袁源等：视黄酸刺激 RARE 调控荧光素酶报告基因表达系统的构建与应用
显被启动，Luciferase 报告基因信号强度约为空白对
照的 3 倍左右，加入 RA 刺激，可以增强报告基因
的表达，信号强度为刺激前的 2 倍左右，差异均具
有显著统计学差异。
5500
bp
M 1 2 3 4
3500
2500
1500
M ：marke ；1 ：pShuttle-CMV ；2 ：pShuttle-CMV 双 酶 切 产 物 ；3 ：pGL3-
Basic-RARE-Luc ；4 ：pGL3-Basic-RARE-Luc 双酶切产物
图 3 重组穿梭质粒 pShuttle-Basic-2RARE-Luc 构建中载
体和插入片段双酶切图
2.4 重组腺病毒载体Adeasy-Basic-RARE-Luc的酶
切鉴定
重组腺病毒载体 Adeasy-Basic-RARE-Luc 阳性
克隆鉴定。首先将测序鉴定正确的 pShuttle-Basic-
RARE-Luc 用 Pme I 酶切后转化 BJ5183 感受态，涂
含 Kam 的平板，挑取阳性克隆摇菌培养，小抽提取
质粒，用 Pac I 酶切后的产物在 1% 琼脂糖凝胶电泳
进行鉴定。结果（图 4）显示有两条清晰条带，和
Adeasy 空载体酶切产物比较，分别在大于 5 500 bp，
以及 3 500 bp 和 2 500 bp 之间，和理论值 30 kb 和 3
kb 符合，酶切鉴定结果为阳性。
5500
bp
M 1 2
3500
2500
M ：marker ；1 ：Adeasy 空载体单酶切产物 ；2 ：Adeasy-Basic-RARE-Luc 单
酶切产物
图 4 重组腺病毒 Adeasy-Basic-RARE-Luc 用 Pac I 酶切鉴
定图
2.5 RA促进腺病毒Adeasy-Basic-RARE-Luc在肝原
代细胞表达
在 肝 原 代 细 胞 中 感 染 Adeasy-Basic-RARE-Luc
重组腺病毒颗粒，饥饿过夜后加入 RA 刺激，1 h 后
检测荧光素酶报告基因表达活性，结果（图 5）显示，
加入腺病毒感染后，肝原代细胞中报告基因信号明
-
- -
+ +
+
160000
120000 ***
***
80000
40000
0
Ad-Bsc-RARE-Luc
Lu
c
RA
图 5 重组腺病毒在肝原代细胞中表达活性检测及对 RA 的
响应
3 讨论
类维生素 A（以下简称维生素 A）既指食物中
存在的天然物质，又包含人工合成的化学药剂。研
究表明 VA 缺乏饮食的大鼠在食物摄入量差异不大
的情况下，丙糖肝糖异生能力下降，肝糖原消耗增
加［10］，饮食摄入的维生素 A 和胡萝卜素与 NAFLD
的发展负相关［11-13］，目前关于维生素 A 缺乏对肝脏
脂肪代谢的影响还没有定论。McGrane 等［14］发现
在维生素 A 缺失饮食的小鼠，其肝脏线粒体和脂肪
酸氧化相关基因表达量下降，并发展为脂肪肝。但
Oliveros 的研究发现在维生素 A 缺失引起大鼠肝脏
脂肪酸合成减少，线粒体脂肪酸氧化增强［15］。由于
在动物模型上维生素 A 缺乏研究结果不一致，在基
因水平上维生素 A 相关蛋白研究成为一个新的热门
方向，有研究表明通过肝细胞中表达负显性 RARα
的转基因小鼠能抑制肝脏中维生素 A 信号通路［16］，
以及利用 RAR 信号通路的激动剂，通过小鼠腹腔注
射 atRA 建立维生素 A 过量模型，脂肪酸合成及肝
脏甘油三酯量均下降［17］。目前关于维生素 A 信号通
路还没有深入报道，由于小鼠模型的复杂性及其耗
费大量的时间和资源，如果能在已有研究提示的基
础上，建立一个体外的研究模型，利用荧光素酶报
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6214
告基因系统的灵敏性，可以更直观深入的研究维生
素 A 相关基因作用。类维生素 A 中最具有转录活性
的视黄酸（RA），通过与 RARs/RXRs 异源二聚体及
RARE 结合，调控靶基因的转录。RARE 序列位于
众多类维生素 A 靶基因的启动子中，含有两个重复
的 PuG（G/T）TCA 的位置。类维生素 A 主要通过
RA 代谢旺盛组织的基因调控，在肥胖和糖尿病发
展过程中发挥重要作用，成为一个重要的治疗靶点。
因此以 RARE 作为类维生素 A 调节代谢与节律信号
通路的关键位点，来寻找可能的调控基因，对于研
究 RA 及其信号通路调控的具体分子机制，深入探
讨维生素 A 在肝脏节律与代谢调节中的作用，具有
重要的临床意义。本研究采用定点突变 PCR 的方法，
在 pGL3-Basic 的质粒中插入 RARE 序列，用荧光素
酶报告基因检测系统鉴定重组质粒 pGL3-RARE-Luc
在 293T 表达活性及对 RA 的响应，建立由 RA 刺激
RARE 调控荧光素酶报告基因的表达系统，与已有
的小鼠模型相比，可以简便高效地筛选影响 RA 对
RARE 调控作用的基因，更直接地研究其作用机制，
为进一步研究维生素 A 及其通路在代谢中的作用提
供体外细胞筛选模型。
RA 是生物节律调控因子，其信号通路中的许多
基因具有节律震荡，与节律通路互相调控。在节律
通路中，BMAL1 和 CLOCK 结合促进 CRY/PER 的转
录，而 CRY 和 PER 上调后又抑制 BMAL1/CLOCK，
形成一个基于 Ebox 生物钟反馈调节通路［18］。研究
发现 RARα 与 RARβ 启动子含有 Ebox 位点［19］，而
且 RA 促进 RARα/RXRα 二聚体与 BMAL 竞争性和
CLOCK 结合，抑制 BMAL/CLOCK 转录活性［20］。此
外发现在 PER1/BMAL 启动子中含有 RARE 序列［21］，
提示 RA 与节律通路的相互调节。本研究利用已经
构建的 RA 刺激荧光素酶报告基因载体，在 293T 分
别过表达 CRY1 和 RARβ，检测 RARE-Luc 对 RA 响
应信号的变化，结果发现 RARβ 可以增强 RARE-
Luc 对 RA 的响应，而 CRY1 则抑制 RA 刺激 RARE-
Luc 的表达。揭示了 CRY1 可能通过 RARE 启动子
对 RA 下游靶基因的调控作用，进而提示节律通路
与 RA 互相作用，并为研究其具体作用机制提供一
个新的突破点，具体靶基因的筛选待后续研究。
为了更好地模拟肝脏中 RA 调控通路，用已
构 建 的 pGL3-Basic-RARE-Luc 把 RARE 序 列 及
Luciferase 报告基因构建到 pShuttle 穿梭质粒中，转
化到 BJ5183 大肠杆菌感受态中，成功构建重组腺病
毒载体 Adeasy-Basic-RARE-Luc，在小鼠肝原代细胞
中响应 RA 刺激，可用于更好地在体内研究 CRY1
及其他可能的调控因子与 RA 信号通路调控的机制，
更深入阐释维生素 A 代谢紊乱与肥胖糖尿病等疾病
的关系。
4 结论
本研究利用定点突变 PCR 方法构建了 RARE 启
动子调控的荧光素酶报告基因载体，在 293T 细胞
中，RA 刺激 RARE-Luc 表达，RARβ 增强 RA 刺激
RARE-Luc 表达，发现 CRY1 抑制 RARE-Luc 对 RA
的响应，并利用 pGL3-Basic-RARE-Luc 载体，进一
步成功构建出在肝原代被 RA 刺激表达的 Adeasy-
Basic-RARE-Luc 的腺病毒载体。
参 考 文 献
［1］ Goodman DS. Vitamin A and retinoids in health and disease［J］.
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［2］ Balmer JE, Blomhoff R. Gene expression regulation by retinoic
acid［J］. J Lipid Res, 2002, 43（11）：1773-1808.
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（责任编辑 李楠）