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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
收稿日期 : 2012-02-09
基金项目 : 国家“十二五计划”课题（2011AA10A210）, 北京市自然科学基金项目（6102009）, 北京市优秀人才培养资助项目（2010D00-
2020000009)
作者简介 : 吕学泽 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 动物遗传育种与繁殖 ; E-mail: lvxueze0310@163.com
通讯作者 : 王宏俊 , 博士 , 研究方向 : 预防兽医学 ; E-mail: whj_1209@163.com
副鸡禽杆菌（Avibacterium paragallinarum，Apg）
是巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌［1］ ，可以
引起鸡急性上呼吸道传染病。该病目前在世界许多
国家和地区都有发生和流行［2］ 。根据血凝抑制试验
的分型方法，副鸡禽杆菌分为 A（A-1、A-2、A-3 和
A-4）、B（B-1）和 C（C-1、C-2、C-3 和 C-4）3 个血
清型［3］。目前国际上普遍使用的灭活疫苗绝大多数
都包含了 A 型和 C 型，最近国内外陆续发现有大量
B 型 Apg 的流行和发生［4］ ，南非学者 Bragg 等［5］曾
证实了血清型 C-3 株为高毒力株，并报道了其已经
副鸡禽杆菌 aroA基因克隆及序列分析
吕学泽1， 2 梁玉荣1， 2 贺云霞1 张培君1 龚玉梅1 王宏俊1
（1 北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097 ；2 河北工程大学农学院，邯郸 056001）
摘 要： 旨在建立一种方便、高效的同源保守基因克隆方法，并对副鸡禽杆菌 aroA基因进行克隆和结构分析。本试验以副
鸡禽杆菌国际标准株 145（C-3） 基因组 DNA为模板，用 CODEHOP软件设计针对 aroA基因的兼并引物，并运用改进的染色体步
移方法扩增 aroA基因序列；对该核酸序列及其编码蛋白进行结构分析并与该菌其他血清型及相关细菌进行序列比对分析。结果显示，
获得了完整的 aroA基因，全长 1 293 bp。该基因编码由 430个氨基酸组成的多肽，具有 2个功能位点和 5个抗原表位位点。不同
血清型间氨基酸序列同源性为 88.1%-100%，与其他相关细菌核酸同源性为 75%以上。首次将兼并 PCR和改进的染色体步移技术
结合起来对副鸡禽杆菌 aroA基因全长进行扩增研究，得到了预期的结果。
关键词： 副鸡禽杆菌 aroA 基因克隆 蛋白结构 分子进化
Molecular Cloning and Sequence Analysis of the aroA Gene of
Avibacterium paragallinarum
Lü Xueze1， 2 Liang Yurong1， 2 He Yunxia1 Zhang Peijun1 Gong Yumei1 Wang Hongjun1
（1Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100097；2 Agricultural
College，Hebei University of Engineering，Handan 056001）
Abstract: In order to establish a convenient and efficient gene cloning method to clone unknown genes, and do some researches on
molecular structure and evolutionary of Avibacterium paragallinarum （Apg） aroA complete sequence. This experiment took an international
standard strain 145 （C-3） of Apg as template, designed degenerate primers according to aroA gene with CODEHOP software. The improved
chromosome walking was used to amplify the whole gene sequence of aroA. Some structure researches on the nucleicacid and coding protein
sequence have been done. Besides, we also did some research on molecular evolution analysis with other serotypes and related bacteria by
sequence alignment. Results showed the complete aroA gene of Avibacterium paragallinarum was obtained, which is 1 293 bp, and encode a
protein sizes as 430 aa with two function sites and several epitopes. The homology of amino acid sequences is 88.1%-100% between different
serotypes experiment strains, and the nucleic acid homology is over 75% between bacteria of the same family. This trial has combined the
Degenerate PCR and improved chromosome walking for the research of genes complete sequence for the first time, and obtained the expected
results.
Key words: Avibacterium paragallinarum aroA Gene cloning Protein structure Molecular evolution
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期84
在南非之外传播的事实。
aroA 基因编码产物为 5- 烯醇丙酮酸莽草酸 -3-
磷酸合成酶（EPSPS）是细菌芳香族氨基酸代谢通
路中一个较为重要的酶。aroA 基因最早发现于大
肠杆菌中，后来人们从多种细菌中陆续成功克隆到
aroA 基因。目前关于副鸡禽杆 aroA 基因的研究仅局
限于其部分序列，宋敏训等［6］建立的针对副鸡禽杆
菌 aroA 基因的 PCR 诊断方法可在该菌不同血清型
中扩增出 800 bp 左右的特异性片段。本试验以副鸡
禽杆菌为模板，旨在建立一种方便、高效的未知基
因全长克隆方法，从而丰富该菌的分子生物学数据
库，同时也为其后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 10 株副鸡禽杆菌国际标准株（包括 C-3
株）来自澳大利亚昆士兰州动物研究所，由本实验
室保存 ；4 株国内分离株及 668 疫苗株，由陈小玲
老师馈赠。
1.1.2 试剂和仪器 TSA，TSB 培养基购自 BD 公司，
基因组 DNA 提取试剂盒购自 OMEGA 公司，PCR
mix，D2000 购自天根生化公司，BSA 购自 NEB 公司，
梯度 PCR 仪（德国 Eppendorf），琼脂糖凝胶成像系
统（BioLab 公司），引物合成和基因测序由北京六合
华大基因公司完成。
1.1.3 引物和序列分析软件 所有设计引物序列，
见表 1，序列分析软件工具有 BLAST、DNA STAR、
MEGA4.0 和 EXPASY。
1.2 方法
1.2.1 细菌基因组 DNA 提取 将在 TSA 上生长的
单菌落挑到含有 10% 小牛血清和 0.5% 烟酰胺腺嘌
呤二核苷酸的TSB中37℃过夜培养，离心3 mL菌液，
基因组提取按照试剂盒提供的方法进行。
1.2.2 扩增aroA基因片段 首先分析副鸡禽杆菌16s
RNA 同源性，再利用 Block maker 在线软件以相似性
高的副猪嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、溶血性曼氏杆菌、
胸膜肺炎放线杆菌及多杀性巴氏杆菌 aroA 氨基酸序
列为备选对象寻找其保守区域，用 CODEHOP 设计
针对 aroA 基因的兼并引物。用该兼并引物扩增得到
部分序列，反应按降落 PCR 方法进行 。
1.2.3 TAIL-PCR 扩增和序列拼接 采用改进的 TA-
IL-PCR 方法［7］对副鸡禽杆菌 aroA 基因片段进行上
下游扩增以得到完整的 aroA 序列。以 aroA 基因 700
bp 片段序列设计 2 组特异性巢式引物，分别用于扩
增其上下游序列，并用 10 个碱基长的 RAPD 引物代
替步移试剂盒中的随机兼并引物，通过热不对称的
3 轮巢式 PCR 最终得到特异性条带。将所得片段回
收测序，并与 aroA 部分片段用 DNASTAR 拼接。
1.2.4 aroA 全基因获得与鉴定 根据拼接好的全序
列设计上下游引物 FaroA 和 RaroA，对 3 个标准株
进行扩增，得到含 aroA 全基因片段，并以回收的该
片段和基因组为模板，以 Fa 和 Ra 为引物对 aroA 全
基因进行反向验证。最后，BLAST 与 NCBI 数据库
比对证实拼接得到的片段为副鸡禽杆菌 aroA 基因。
1.2.5 aroA 基因编码蛋白分析 利用在线序列分
引物 序列 （ 5-3） 扩增 （bp） 应用
Fdp ACTAATTTATTAGATTCTGATGATATTCGTCAYATGYTNA 996 针对副鸡禽杆菌 aroA 的兼并引物Rdp GGTTGAATACGAATAAAATCTTGACCYTCYTCNAC
FaroA TTGGGGACACGATTTAGACGGC 1 963 包含 aroA 全序列的引物RaroA AATTCCTCAAAGAATGTTGGGAAGG
Af GCGATGCTTCTTCTGCCTCTTA
扩增 aroA 上游片段Af2 GCGAGGATTTTATCCAAGCAGA
Af3 GACCGCCTGAGTGCAATGCAA
Ar GACGTAATGCGTCCACCAAATG
扩增 aroA 下游片段 Ar2 CTCAAAGGTCGCATCGCCGTT
Ar3 TCGCATTCACGCTTATCTTGTG
Fa ATGGAAAAATTAACGCTACAAC 1 293 扩增 aroA 阅读框引物Ra TTATCGTACAATCTTCGCAAATT
表 1 本试验所用引物
2012年第8期 85吕学泽等 ：副鸡禽杆菌 aroA 基因克隆及序列分
析工具 ClustalW2.0 对 aroA 基因全序列进行功能位
点鉴定分析，并对其上下游邻接序列进行 BLSAT
比对和序列分析，最后应用 EXPASY 服务器上
的 SOPMA、HNN 工具预测 aroA 基因编码蛋白的
二级结构，并结合 HOOP-WOODS 亲水性参数，
AVERAGE FLEXIBILITY 柔韧性参数，ZIMMERMAN
极性参数以及采用人工神经网络的 ABCpred 软件预
测其 B 细胞抗原表位。
1.2.6 各血清型 aroA 基因的扩增和序列比对 选用
国际标准株 0083（A 型），0222（B 型），modest（C
型），国内分离株 B2（B 型）和疫苗株 668（C 型），
以 aroA 基因全序列引物 Fa 和 Ra 扩增 DNA，再进
行氨基酸序列分析，比较各菌株间编码产物的差异。
1.2.7 不同细菌 aroA 基因序列比对 从 GenBank 中
搜集嗜血杆菌属以及巴氏杆菌科主要细菌的 aroA 全
序列，将其用 MEGA4.0 与巴氏杆菌科细菌进行比
对分析，构建遗传距离矩阵并绘制进化树，从而得
出各菌株间 aroA 基因遗传进化关系。
2 结果
2.1 aroA全基因序列的获得与验证
用兼并引物 Fdp 和 Rdp 对国际标准株 145 进
行扩增可得到 996 bp 的 aroA 基因片段（图 1），步
移延长和拼接后得到包含 aroA 完整 ORF 的长为
2 178 bp 的序列。另外，根据拼接序列设计上下游
引物 FaroA 和 RaroA 对 3 个标准株进行 PCR 扩增可
得 1 963 bp 包含 aroA 基因全长片段（图 2），并分
别以该回收片段和基因组为模板，以 Fa 和 Ra 为引
物对 aroA 全基因进行验证，结果均扩增出了与预期
结果相符的特异性片段（图 3）。经分析此基因序列
中包括 aroA 阅读框（1 293 bp）。将 aroA 全基因序
列登录 GenBank 获取基因序列号 ：JF834213。该基
因所编码蛋白为 5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成
酶（EPSPS），由 430 个氨基酸组成，预测分子量为
46.9 kD。BLAST 比对证实了拼接得到的确实为副鸡
禽杆菌 aroA 基因。
2.2 aroA二级结构分析结果
功能位点鉴定分析，其主要功能位点位于 ：
90-104，341-359 位氨基酸。该基因上游为组氨醇
磷酸转氨酶（HisC）基因，等电点为 5.31，细菌中
的半衰期大于 10 h，不稳定指数为 30.18，较稳定。
带负电荷残基数（Asp + Glu）：52，带正电荷残基数
（Arg + Lys）：44。不稳定系数为 30.18，ExPASy 上
的 SOPMA、HNN 工具均提示该蛋白二级结构中以
柔性区域为主 ；潜在的 B 细胞抗原表位为 ：49-64、
99-114、407-422、322-337、152-167 aa。根据 Bur-
khard［8］的理论，该蛋白为混合型蛋白。综合二级
M. D2000 DNA Marker ；
1. 国际标准株 145
图 1 aroA基因片段
M.D2000 DNA Marker ；1. 国际标准株 0083；
2. 国际标准株 0222 ；3. 国际标准株 modest
图 2 aroA基因全序列
M.D2000 DNA Marker ；1. aroA 片段序列 ；
2. aroA 全基因序列 ；3. 阴性对照
图 3 aroA基因验证结果
预测结果，表明该蛋白为结构相对散乱的球状蛋白。
2.3 不同血清型aroA基因扩增
通过上下游引物 Fa 和 Ra 对 5 个参考株进行
PCR 扩增，结果均得到了预期片段（图 4）。
2.4 基因序列分析结果
本试验副鸡禽杆菌各血清型间 aroA 氨基酸序
列同源性分析结果，见表 2 ；与巴氏杆菌等核苷酸
序列比对结果和系统发育进化树，见表 3 和图 5。
序列分析表明副鸡禽杆菌不同血清型 aroA 氨基
酸序列间呈高度相似性，再一次验证了该基因的保
守性。不同细菌间核苷酸序列比对结果除了与志贺
菌、大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌同源性较远外，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期86
和沙门氏菌、耶尔森菌相似度在 65% 以上，和同科
的巴氏杆菌相似度在 75% 以上。
3 讨论
为了验证此方法的可重复性，笔者用同样的方
法对具有免疫原性的保守蛋白——外膜蛋白 D-15 进
行了克隆研究，亦获得了成功。所以该方法可为各
种功能和毒力相关基因克隆提供新的思路和方法。
结合亲水性参数、柔韧性参数、可及性参数以及抗
原表位参数进行综合分析比较。研究表明，该方法
M.D2000 DNA Marker; 1. 国 际 标 准 株 0083; 2. 国 际 标 准 株
0222; 3. 国际标准株 modest; 4. 国内分离株 B2; 5. 疫苗株 668
图 4 不同血清型 aroA基因扩增
得到的预测结果对细菌生物学研究和疫苗研制具有
重要参考价值［9］。在许多革兰氏阴性细菌中，aroA
基因上游为 serC 基因或者磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
基因 ［10， 11］，但在本试验中，aroA 基因上游为组氨醇
磷酸转氨酶（HisC）基因部分序列，这与最新报道
的 aroA 基因与 HisC 基因在同一个转录操纵子中的
结构吻合［12， 13］。序列测定结果表明 Apg 不同血清型
中 aroA 基因编码氨基酸序列的同源性达到 88.1% 以
上，呈高度保守性。与巴氏杆菌科其他成员间 aroA
表 2 13 Hps aroA基因氨基酸序列同源性比较（%）
表 3 巴氏杆菌科不同成员及其他相关细菌间 aroA基因序列同源性比较（%）
图 5 不同细菌 aroA基因序列遗传进化树分析
2012年第8期 87吕学泽等 ：副鸡禽杆菌 aroA 基因克隆及序列分
基因也具有较高的同源性，这与文献报道 aroA 基因
比较保守的观点一致［14］。此外，与国内陈焕春［15］
和薛晓晶［16］等所测副猪嗜血杆菌 aroA 基因相似度
高且覆盖率大，表明 aroA 基因遗传进化具有一定的
地域性特征，不过遗传进化树显示其成单独一支。
这为其编码蛋白生物学功能的研究，诊断试剂和亚
单位疫苗以及基因缺失突变的研制提供了理论依据。
4 结论
本试验首次将兼并 PCR 和染色体步移技术结合
起来对基因全长进行扩增研究（并对常规染色体步
移技术做了相关改进）得到了预期的结果。同时，
还应用生物信息学方法对 Apg 相关蛋白的二级结构
和潜在 B 细胞抗原表位进行了分析和预测，结果得
到 5 个潜在的 B 抗原表位。最后，通过对副鸡禽杆
菌各血清型及同科细菌进行序列比对分析进一步验
证了 aroA 基因的保守性。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）