全 文 ：Vol. 31 , No. 1
pp. 108 - 113 　Jan. , 2005
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 31 卷 第 1 期
2005 年 1 月 　108～113 页
抗草甘膦基因 aroAM12 及抗虫基因 Bts1m 的转基因棉株
赵福永1 　谢龙旭1 ,2 　田颖川3 　徐培林1 , 3
(1 中山大学基因工程教育部重点实验室 ,广东广州 510275 ;2 河南师范大学生命科学学院 ,河南新乡 453002 ;3 中国科学院微生物研究所 ,北京
100080)
摘 　要 :构建了一种新的植物高效表达载体 pAM122s1m ,其上携带有通过基因优化 (gene shuffling) 技术获得的抗草甘膦突
变基因 ( aroAM12)和抗虫人工合成重组 Bt 基因 ( Bts1m) 。aroAM12 基因表达由 CaMV35S启动子控制 , Bts1m 基因表达由
2E235S启动子和Ω因子控制。以棉花无菌苗下胚轴为外植体 ,采用农杆菌介导法将 aroAM12 和 Bts1m 基因导入棉花品
种石远 321 中 ,以 aroAM12 基因作为选择标记 ,草甘膦为选择剂直接筛选获得 52 棵再生植株。PCR 和 Southern blot 分析
表明再生植株均整合有 aroAM12 基因 ,其中 38 棵植株同时整合有 aroAM12 和 Bts1m 基因。Northern blot、Western blot 分析
进一步证明整合到植株中的两个基因在转录和翻译水平上进行了有效表达。离体叶片草甘膦抗性和虫试实验证明 ,获
得的转基因棉花对草甘膦和棉铃虫具有较强的抗性。
关键词 :转基因棉花 ;草甘膦 ; aroAM12 基因 ; Bts1m 基因 ;选择标记
中图分类号 : S562
Glyphosate2resistant and Boll worm2resistant Transgenic Cotton Plants with the
aroAM12 and Bts1m Genes
ZHAO Fu2Yong1 ,XIE Long2Xu1 ,2 ,TIAN Ying2Chuan3 ,XU Pei2Lin1 , 3
(1 The Key Laboratory of Gene Engineering of Ministry of Education , Zhongshan University , Guangzhou 510275 , Guangdong ;2 College of Life Science , Henan Nor2
mal University , Xinxiang 453002 , Henan ;3 Institute of Microbiology , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100080 , China)
Abstract :A new binary vector , pAM122s1m , harboring the aroAM12 gene encoding 52enolpyruvyl2shikimate232phosphate
synthase ( EPSPS) and a synthetic recombinant Bts1m toxin gene consisting of 331 N2terminal amino acids of CryIAc and
284 C2terminal amino acids of CryIAb was constructed1 The truncated aroAM12 gene , which was obtained through gene
shuffling technology , was ligated with a transit sequence of Arabidopsis EPSPS and expressed in cotton plants , and driven
by cauliflower mosaic virus 35S (CaMV35S) promoter1 The chimeric Bts1m toxin gene was fused with DNA sequence en2
coding PR1b secretary signal peptide and expressed under the control of 2E235S promoter and“Ω”translation enhancer se2
quence derived from tobacco mosaic virus1 The mutant EPSPS of aroAM12 gene product conferring highly resistant to
glyphosate , the active ingredient in herbicide Roundup ○R , was used as a dominant selectable marker for cotton plant trans2
formation1 The genes were introduced into commercial cultivar Shiyuan 321 of cotton ( Gossypium hirsutum L1) by Agrobac2
terium2mediated transformation1 The transformants were selected directly on medium supplemented with 80μmolΠL glypho2
sate1 In this research , 52 regenerative cotton plantlets were obtained through screening1 Integration of aroAM12 and Bts1m
genes was confirmed by PCR and Southern blot , the results indicated that all the 52 plants possessed the aroAM12 gene ,
38 of which possessed both the aroAM12 and Bts1m genes1 Expression of both the genes was proved by Northern and West2
ern blots analyses1 Insect bioassay and glyphosate resistance assay indicated that the transgenic cotton plants obtained were
highly resistant to glyphosate and insect1
Key words :Transgenic cotton ; Glyphosate ; aroAM12 gene ; Bts1m gene ; Selective marker
　　棉花是一种重要的经济作物 ,近年来杂草和虫
害已成为制约皮棉产量和质量的两个主要因素。常
规育种途径因抗性种质资源匮乏而难以解决问题 ,
因此利用基因工程技术 ,将抗除草剂基因和抗虫基
繱基金项目 : 国家“863”高技术研究发展计划 (2001AA212191)和广州市科技计划 (20012Z2040201)资助。
作者简介 : 赵福永 (1976 - ) ,男 ,湖南衡山人 ,博士研究生 ,研究方向 :植物基因工程。 3 通讯作者 :徐培林。Tel :020284038085 ; E2mail :
13640737322 @1631net
Received(收稿日期) :2003206220 ,Accepted(接受日期) :20032122031

因同时导入棉花 ,培育抗除草剂和抗虫双抗转基因
棉花新品种 ,一方面不仅可以降低植棉投入 ,增加棉
农收入 ,另一方面还可简化棉花栽培体系 ,在农业生
产上具有重要意义。同时 ,抗除草剂基因在棉花杂
交育种上还可作为重要的遗传标记。目前已有多种
抗除草剂和抗虫转基因棉花报道 ,国外Tro2linder[1 ]
与 Bayley[2 ] 将抗 2 , 42D 的 tf dA 基因、Keller[3 ] 将抗
PPT的 bar 基因成功导入到棉花中 ,获得抗除草剂
转基因棉花。Monsanto 公司的 Perlak[4 ] 等将 Bt 基因
导入到棉花中 ,并开始商品化生产。国内学者也相
继将抗 2 ,42D 的 tf dA 基因和改造过的系列 Bt 及双
价抗虫基因转入到棉花中[5～8 ] 。国外将草甘膦抗性
基因转入到烟草、番茄等作物的研究较多 ,但成功转
化棉花的报道很少。Nida 等[9 ] 将 CP4 EPSPS 编码基
因转化棉花 ,该基因只作为草甘膦抗性的目的性状
基因 ,而不作为选择标记。国内还未见将草甘膦抗
性基因转入到棉花中的报道。本研究所采用的草甘
膦抗性基因 aroAM12 是通过基因优化技术 ( gene
shuffling) [10 ]而获得 ,抗虫基因 Bts1m 由中国科学院
微生物研究所田颖川研究员等改造人工合成。应用
分子克隆技术将该两个基因整合到同一个质粒上 ,
构建成植物高效表达载体。采用农杆菌介导法转化
棉花 ,并首次利用 aroAM12 基因为选择标记 ,直接应
用草甘膦筛选获得抗草甘膦抗虫双抗转基因棉花。
1 　材料与方法
111 　菌株和质粒
　　大肠杆菌 XL12Blue 和根癌农杆菌 LBA4404 由
本实验室保存 ,含 Bts1m 基因的质粒 pBts1m 由中科
院微生物所田颖川研究员赠送 ,含 aroAM12 基因的
pGRA1300、pCR211M12 质粒由本实验室构建并保存。
112 　植物材料
陆地棉栽培品种石远 321 种子由中国农科院棉
花研究所刘正德研究员馈赠。
113 　酶与试剂
各种限制性内切酶、连接酶等购自 Promega 公
司 ;Hexal Label PlusTM DNA Labeling Kit、Western Blot
Kit BCPIΠNBT System 购自 MBI Fermentas 公司 ;草甘
膦 (Roundup ○R ) 购自 Monsanto 公司 ; PCR 引物由上海
博亚 (BioAsia)生物技术公司合成。
114 　植物表达载体的构建
用 Hind Ⅲ+ Sal Ⅰ酶切质粒 pBts1m ,回收含 2E2
35S2Ω2BtS1m 片段 ; 用 Hind Ⅲ + Xho Ⅰ酶切质粒
pCR211M12 ,回收含 Nos 片段 ,将回收的两 DNA 片
段经 T4 DNA Ligase 连接后 ,得到 pBtpCR211 质粒。
用 Hind Ⅲ + Xba Ⅰ分 别 切 割 pBtpCR211 和
p GRA1300 ,回收相应片段 ,连接后得到植物高效表
达双元载体 pAM122s1m (图 1) ,采用氯化钙法[11 ] 将
pAM122s1m 转化农杆菌LBA4404。
115 　棉花的转化及再生
将 3～5 日龄的无菌苗下胚轴切成 3～5 mm 切
段 ,用含 pAM122s1m 质粒的农杆菌 LBA4404 菌液
(OD600 = 016) 感染 7 min ,灭菌滤纸上吸干残余菌液
后 ,接种到铺有一张灭菌滤纸的共培养基上 (MS +
3 %葡萄糖 + 011 mgΠL 2 ,42D + 011 mgΠL KT + 200
mgΠL 乙酰丁香酮 + 012 % Gelrite ,pH 510) 。暗培养
48 h 后 ,转移到愈伤组织诱导培养基上 (MS + 3 %葡
萄糖 + 011 mgΠL 2 ,42D + 011 mgΠL KT + 500 mgΠL
Cef + 012 % Gelrite ,pH 518) ,培养一周后转移到含
80μmolΠL 草甘膦的相同培养基上 ,诱导抗性愈伤组
织的形成 ,每 30 d 继代一次。2～3 个月后 ,将诱导
出的抗性愈伤转移到增殖培养基 (MS + 3 %葡萄糖
+ 0191 gΠL MgCl2 + 012 % Gelrite ,pH 518)上 ,待出现
米粒状胚性愈伤时 ,转移到分化培养基 (无 NH+4 、
KNO3 加倍的 MS + B5 + 1 gΠL 天门冬酰胺 + 2 gΠL 谷
氨酰胺 + 2 %葡萄糖 + 0125 % Gelrite ,pH 518) 上 ,诱
导胚状体的成熟和植株再生 ,待再生苗形成良好根
系时 ,采用低温移植法将其移栽到大棚中 ;对于无根
或根生长不好的转基因苗采用嫁接法移栽。
116 　再生植株的 PCR分析
棉花 DNA 的提取参照 Bushra 等[12 ] 的方法。根
据 aroAM12 和 Bts1m 基因序列 ,设计两对特异性引
物。aroAM12 基因特异引物 P1 : 5′2CATGCCATG2
GAATCCCTGACGTTACAA23′, P2 : 5′2CGCGGATCCT2
TAGC AGGCTACTCATTC23′; Bts1m 基因特异引物 P3 :
5′2TATCCCATTGTTCGCAGTCC23′, P4 : 5′2CATCACGA
CTCAAGTTGTTA23′。反应参数为 : 94 ℃预变性 5
min ;94 ℃1 min ,54 ℃1 min ,72 ℃1 min ,循环 30 次 ;
72 ℃延伸 10 min。
117 　转基因棉花离体叶片草甘膦抗性实验
试验叶片取自相同叶期转基因和非转化植株 ,
分别置于培养皿中 ,叶柄处用沾水棉球保湿 ,用不同
浓度的草甘膦 ( Roundup ○R ,Monsanto) 均匀涂抹叶片 ,
观察叶片受损伤情况。
118 　转基因棉花抗虫实验
将经 PCR 检测呈阳性 ( Bts1m 基因)的棉花转化
株主茎第 5 叶放入垫有浸湿滤纸的培养皿中 ,以非
转化株作为对照 ,以 2 龄棉铃虫 ( Helicoverpa armi2
gera ,中山大学生物防治国家重点实验室提供) 作为
受试虫 ,每皿接种 6 头 ,置于 (25 ±2) ℃和 16Π8 h 光
901　第 1 期 赵福永等 :抗草甘膦基因 aroAM12 及抗虫基因 Bts1m 的转基因棉株 　　　

暗周期的培养箱中。接虫后第 3、6 天统计死亡率、
活虫体重及叶片受害情况。
119 　转基因棉花 Southern blot 分析
取 10μg 总 DNA ,经 Hind Ⅲ完全酶切后 ,018 %
琼脂糖凝胶电泳 ,参照《分子克隆实验指南》[11 ] 方法
转膜与杂交。
1110 　转基因棉花的 Northern blot 分析
棉花 RNA 的提取参照夏兰芹等的方法[13 ] 。取
10μg RNA ,112 %甲醛变性凝胶电泳 ,参照《分子克
隆实验指南》[11 ]方法转膜与杂交。
1111 　转基因棉花 Western blot 分析
棉花可溶性粗蛋白的提取参照 Nida[9 ] 等的方
法。采用 Bradford 法测定蛋白浓度[14 ] 。参照 West2
ern Blot Kit 所提供的方法 , 分别用 EPSPS抗血清 (兔
抗血清 ,效价 1∶200 ,实验室自制) 和 Bt 毒蛋白抗血
清 (兔抗血清 ,效价 1∶250 ,田颖川研究员赠送) 进行
Western blot 检测。
2 　结果与分析
211 　植物双元表达载体 pAM122s1m 的构建
　　本研究将 aroAM12 和 Bts1m 基因整合到同一个
质粒中 ,得到抗草甘膦、抗虫植物高效表达载体
pAM122s1m (图 1) 。在 aroAM12 基因 5′端连接了一
段 240 bp 的拟南芥 EPSPS信号肽 ASP 编码区序列 ,
该基因表达由 CaMV35S 启动子控制。在 Bts1m 基因
5′端添加了烟草致病相关蛋白的信号肽 (PR1b)编码
区序列 ,同时在该基因的前面加有增强翻译功能的
烟草花叶病毒 (TMV) RNA 的Ω片段编码序列和 2E2
35S强启动子序列。
图 1 植物表达载体 pAM122s1m
Fig11 Construction of the plant expression vector pAM122s1m
212 　再生棉花植株的 PCR 检测
通过草甘膦直接筛选共获得 52 棵再生植株 ,用
aroAM12 基因特异性引物扩增 ,均出现预期的 113
kb 片段 ;用 Bts1m 基因特异性引物扩增 ,其中有 38
棵植株出现预期的 0196 kb 片段。该结果表明在携
带有外源基因的 T2DNA 片段整合到植物基因组的
过程中 ,约有 2619 %(14Π52) 的 Bts1m 基因丢失。图
2 为部分转化植株 PCR 扩增结果。
213 　转基因棉花的草甘膦抗性检测
选取主茎第 5 叶进行离体试验 ,用不同浓度的
草甘膦涂抹 ,5 d 后对照叶片在 10 mmolΠL 变黄枯
萎 ,而转基因棉花叶片在 50 mmolΠL 逐渐失绿变黄
(图 3) ,表明在离体条件下 ,棉花抗性提高了约 5 倍。
图 2 转化棉花株的 PCR检测
Fig12 PCR analysis of putative transformants and untransformed cotton plants
(A) : aroAM12 引物扩增 ; (B) : Bts1m 引物扩增 ;Lane M: DNA marker ;Lane P : pAM122s1m 质粒 ;Lane N : 非转化植株 ;Lanes 1～10 : 转化植株
PCR analysis using two primer sets : aroAM12 (A) and Bts1m (B) gene specific ; Lane M: DNA marker ; Lane P : pAM122s1m plasmid ;
Lane N : Untransformed plant ; Lanes 1 - 10 : Putative transformants
图 3 转基因棉株离体叶片对草甘膦的抗性
Fig13 Analysis of transgenic cotton resistance to glyphosate
TG: 转基因植株 ;CK: 非转化植株。从左到右草甘膦的涂抹浓度依次为 0、5、10、30、50 mmolΠL1
TG: Transgenic plant ; CK: Untransformed plant1 The concentration of glyphosate swabbed from left to right is 0 , 5 , 10 , 30 , 50 mmolΠL , respectively1
011 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

214 　转基因棉花抗棉铃虫检测
抗虫性比较发现 ,大部分转化植株 ( Bts1m PCR
阳性)表现出明显的抗虫性 ,叶片仅被取食几个小
孔 ,受试虫就死亡 ,而对照叶片则大部分被取食。图
4 为经过 3 d 后部分叶片被棉铃虫取食的情况。其
具体发育和死亡情况见表 1。
215 　转化棉花的 Southern blot 分析
随机挑选的 6 株棉花的总 DNA 进行 Southern
blot 分析。杂交结果表明 ,1～6 号株均出现了杂交
信号 ,结合图52A可以推断出其杂交条带数就是
aroAM12 基因插入植株的拷贝数 ,分别为 2、1、2、1、
1、1 (图 52B) 。对于 Bts1m 基因 ,只有 1～4 号株出现
了杂交信号 ,其拷贝数依次为 1、2、3、1 ,而 5、6 号两
棵转化植株同对照植株一样 ,无杂交信号出现 (图
52C) 。这一结果表明在携带有 aroAM12 和 Bts1m 基 因的 T2DNA 向植株染色体整合的过程中 ,有部分Bts1m 基因的丢失 ,这一结果同 PCR 结果相符合。图 4 转基因棉花对棉铃虫( Helicoverpa armigera)的抗性Fig14 Leaf bioassay of transgenic cotton leavesagainst Helicoverpa armigera1～3 : 转基因植株 ;4 : 非转化植株。1 - 3 : Transgenic plant ;4 : Untransformed plant1
表 1 转基因棉花对棉铃虫( Helicoverpa armigera)的抗性结果
Table 1 Effects of transgenic cotton on survival and development of Helicoverpa armigera second instar larvae at three and six days infestation
植株编号
No1 of plant 死亡率Mortality ( %)
3 days 6 days
存活幼虫体重
Weight of survival H1 a1(mg)
3 days
叶片受损级别
Leaf damage grade
1 8515 100 0175 ±0130 +
2 8010 9010 018 ±0120 + +
3 6510 8010 018 ±0135 + + +
4 8510 100 0165 ±0128 +
5 8210 100 017 ±0125 +
6 8415 9510 0175 ±0133 + +
7 7010 8315 0185 ±0120 + + +
8 8515 100 0175 ±0125 +
CK 0 0 515 ±014 + + + +
　　注 :1～8 :转基因植株 ; CK: 非转化植株 1 Notes :1 - 8 :Transgenic plants ; CK: Untransformed plant1
图 5 转基因棉花植株 Southern blot 分析
Fig15 Southern blot analysis of transgenic cotton plants
(A) pAM122s1m T2DNA 区域示意图。T0 代棉花基因组 DNA 经 Hind Ⅲ酶切后分别与 (B) aroAM12 和 (C) Bts1m 基因特
异性探针杂交。N :非转化植株 DNA ;1～6 : 转化植株 DNA。
(A) Schematic map of the T2DNA of the binary vector pAM122s1m1 Total genomic DNA of T0 transformants was digested with Hind Ⅲ
and hybridized with aroAM12 DNA fragment (B) or with Bts1m DNA fragment (C) Lane N : Untransformed plant ; Lanes 1 - 6 : Transformants1
111　第 1 期 赵福永等 :抗草甘膦基因 aroAM12 及抗虫基因 Bts1m 的转基因棉株 　　　

216 　转基因棉花的 Northern blot 分析
Northern blot 结果表明 ,用 aroAM12 基因探针杂
交时 ,1～6 号转化植株均出现了 1130 kb 左右的杂
交条带 ,与预期值大小相近 ,而非转化植株未出现任
何杂交信号 ,表明 aroAM12 基因在转录水平上进行
了有效表达。从杂交信号上看 ,2 号植株最强 ,1、3
号次之 ,4、5、6 号相对较弱 (图 62A) 。用 Bts1m 基因
探针杂交时 ,只有 1～4 号株出现了 0196 kb 左右的
杂交条带 ,与期望值大小相近 ,有 2 株转化植株 (5、6
号) 未出现杂交信号 (图 62B) ,表明 1～4 株中的 Bts1m 基因在转录水平上得到了表达。217 　转基因棉花的 Western blot 分析为检测 aroAM12 和 Bts1m 基因是否正确表达出EPSPS和 Bt 毒蛋白 ,取 10μg 总的可溶性蛋白进行Western blot 分析。图 72A 中 ,6 个随机挑选的转基因棉花粗蛋白样品同 EPSPS 抗血清杂交后均在 48kDa 处出现杂交带 ,同阳性对照结果完全相同。图72B 中 ,同样的蛋白样品同 Bt 毒素蛋白抗血清杂交后 ,只有 1～4 出现了同阳性对照相同大小的 68 kDa杂交带 ,且杂交信号存在一定差异。
图 6 转基因棉花植株 Northern blot 分析
Fig16 Northern blot analyses of transgenic cotton plants
N : 非转化植株 ;1～6 : 转化植株。植株 RNA 分别与 aroAM12 (A)和 Bts1m (B)基因探针杂交。
Line N : Untransformed plant ; Lanes 1 - 6 : Cotton transformants1 The RNA was hybridized with aroAM12 DNA fragment (A)
or with Bts1m DNA fragment (B) 1
图 7 转基因棉花植株 Western blot 分析
Fig17 Western blot analysis of transgenic cotton plants
(A) : EPSPS抗血清检测。M:分子量标记 ;P : EPSPS蛋白 ;N :非转化植株 ;1～6 :转基因植株。
(B) : Bt 毒蛋白抗血清检测。M:分子量标记 ;P : Bt 毒素蛋白 ;N :非转化植株 ;1～6 :转基因植株。
(A) :The EPSPS protein of aroAM12 gene product was detected using anti2EPSPS serum1 M: Molecular marker ; Lane P : EPSPS protein ;
Lane N :Untransformed plant1 (B) :The Bt toxin protein of Bts1m gene product was detected using anti2Bt toxin
serum1 M: Molecular marker ; Lane P : Bt toxin protein ; Lane N :Untransformed plant ; Lanes 1 - 6 :Transformants1
3 　讨论
目前 ,棉花转化过程中的筛选标记基因大部分
采用 npt Ⅱ(新霉素磷酸转移酶) 基因或 htp (潮霉素
磷酸转移酶)基因。草甘膦作为除草剂具有广谱、高
效、低残留量的特性 ,是一种理想的筛选剂。草甘膦
作用的靶标酶是莽草酸羟基乙烯转移酶 ( EPSPS) ,
其作用机制在于抑制植物体内芳香族氨基酸的生物
合成。抗草甘膦育种通常有 3 条途径 :导入修饰的
或突变的酶靶基因 ;导入过量表达的酶靶基因 ;导入
草甘膦降解酶基因。本研究所采用的草甘膦抗性基
因 aroAM12 是通过基因优化技术 (gene shuffling) 获
得的 ,其表达产物在多个氨基酸位点发生突变 ,造成
酶对底物 PEP 亲和性增加 ,同时对草甘膦的亲和性
下降 ,导致草甘膦抗性水平的提高[10 ] 。构建高效表
达载体时 ,在 aroAM12 基因上游连接了一段来自拟
南芥 EPSPS信号肽 ASP 编码区序列 ,从而能够大大
提高转基因植株的抗性 ,因为整个芳香族氨基酸的
合成过程是在叶绿体中进行[15 ] 的。采用农杆菌介
导法 ,以 aroAM12 为选择标记基因筛选出的 T0 代转
化植株抗草甘膦 ,说明草甘膦是一种有效的筛选剂。
Bts1m 基因是人工合成的重组基因 ,即由 CrylAb N
端的 331 个氨基酸和 CrylAc C 端 284 个氨基酸组合
而成[16 ] 。在该基因的 5′端有加倍的增强子元件 2E2
35S以增强基因转录功能 ;5′端Ω序列是蛋白质翻
译过程中核糖体的结合位点 ,可大幅提高蛋白质的
表达量[17 ] 。另外 ,为使植物表达的 Bt 杀虫蛋白能
分泌到细胞外间隙以提高杀虫蛋白的稳定性 ,在
211 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

Bts1m 基因前添加了烟草致病相关蛋白的信号肽
(PR1b)编码区序列 ,其作用与 ASP 序列类似。该基
因 3′端的 polyA 序列的添加 ,提高了杀虫基因 mRNA
的稳定性。通过筛选得到的抗虫棉花植株尽管单株
间所表现出的抗性呈现一定的差异 ,但抗虫能力都
较强 ,并且植株的其他生长性状并未受到影响 ,说明
组建的嵌合 Bts1m 基因进行了充分的表达。South2
ern blot 结果表明不同转基因植株中的外源基因的
拷贝数和整合位点均不完全相同。结合 Northern
blot、Western blot 及棉花离体叶片草甘膦抗性和虫试
结果分析发现 ,转基因植株抗性的强弱同插入的基
因拷贝数并不呈正相关 ,有些多拷贝插入的植株抗
性反而较低 ,这可能是由基因沉默现象造成的[18 ] 。
关于转化植株中 aroAM12 和 Bts1m 基因能否稳定地
遗传给后代以及遗传方式如何 ,有待进一步的研究
和分析。
References
[1 ] 　Trolinder N , Bailey C , Quisenberry J , Ow D1 2 ,42D resistant trans2
genic cotton1 In vitro , 1991 , 3 (27) : 95A
[2 ] 　Bayley C , Trolinder N , Ray C , Morgan M , Quidenberry J E , Ow D
W1 Engineering 2 ,42D resistance into cotton1 Theor Appl Genet , 1992 ,
83 (9) : 645 - 649
[3 ] 　Keller G, Spatola L , Mccabe D , Martinell B , Swain W , John M E
Transgenic cotton resistant to herbicide bialaphos1 Transgenic Research ,
1997 , 6 (6) : 385 - 392
[4 ] 　Perlak F J , Deaton R W , Armstrong T A1 Insect resistant cotton pla2
nts1 BioΠTechnology , 1990 , 8 (10) : 939 - 943
[5 ] 　Chen Z2X(陈志贤) ,Llewelly D J , Fan Y2L (范云六) , Li S2J (李淑
君) ,Guo S2D (郭三堆) ,Jiao G2L (焦改丽) , Zhao J2X(赵俊侠) 1
2 ,42D resistant transgenic cotton plants produced by Agrobacterium2me2
diated gene transfer1 Scientia Agricultura Sinica (中国农业科学) ,
1994 ,27 (2) : 31 - 37(in Chinese with English abstract)
[6 ] 　Sun Y(孙岩) , Ni W2C(倪万潮) , Guo S2D(郭三堆) 1 The acquire2
ment of transgenic bollworm2resistant Xinjiang cotton plants with the
synthetic gene coding Bacillus thuringiensis insecticidal protein1 Acta
Agriculture Boreali2occidentalis Sinica (西北农业学报) , 1998 , 7 (4) :
1 - 3 (in Chinese with English abstract)
[7 ] 　Guo H2N(郭洪年) , Wu J2H(吴家和) , Chen X2Y(陈晓英) 1 Cot2
ton plants transformed with the activated chimeric crylAc and API2B
genes1 Acta Botanica Sinica (植物学报) , 2003 ,45 (1) : 108 - 113
[8 ] 　Li F2G(李付广) , Guo S2D(郭三堆) , Liu C2L (刘传亮) ,Li F2L (李
凤莲) ,Cui H2Z(崔洪志) ,Zhou Y(周勇) ,Li X2L (李秀兰) 1 The
study on the transformation and selection of insect2resistant cotton har2
boring double2gene1 Acta Gossypii Sinica (棉花学报) ,1999 , 11 (2) :
106 - 112
[9 ] 　Nida D L , Kolacz K H , Buehler R E , Deaton W R , Schuler W R ,
Armstrong T A , Taylor M L , Ebert C C , Rogan G J , Padgette S R ,
Fuchs R L1 Glyphosate2tolerant cotton : genetic characterization and
protein expression1 J Agric Food Chem , 1996 , 44 (7) : 1 960 - 1 966
[10 ] 　He M(何鸣) ,Zeng H2Y(曾海燕) ,Xu P2L (徐培林) , Ye C2M(叶
长明) 1 Cloning and mutagenesis of the aroA gene1 Acta Scientiarum
Naturalium Universitatis Sun Yat Seni (中山大学学报) , 2002 , 41
(2) : 76 - 79(in Chinese with English abstract)
[11 ] 　Sambrook J , Fritsch E F , Maniatis T1 Molecular Cloning : A
Laboratory Manual1 2nd ed1 New York : Cold Spring Harbor Laboratory
Press , 1989
[12 ] 　Bushra C , Afshan Y, Tayyab H1 Mini2scale genomic DNA extraction
from cotton1 Plant Molecular Biology Reporter , 1999 , 17 : 1 - 7
[13 ] 　Xia L2Q(夏兰芹) , Guo S2D(郭三堆) 1 A method of RNA fast ex2
tracting in cotton tissues1 Acta Gossypii Sinica (棉花学报) ,2000 ,12
(4) :205 - 207(in Chinese with English abstract)
[14 ] 　Bradford M M1 A rapid and sensitive method for the quantitation of mi2
crogram quantities of protein utilizing the principle of protein2dye bind2
ing1 Anal Biochem , 1976 , 72 : 248 - 254
[15 ] 　Della C G, Bauer S C , Klein B K, Shah D M , Fraley R T , Kishore
G1 Translation of the precursor of 52enolpyruvylshikimate 232 phos2
phate synthase into chloroplasts of higher plants in vitro1 Proc Natl
Acad Sci USA , 1986 , 83 (18) : 6 873 - 6 877
[16 ] 　Zhao C2Y(赵存友) , Yuan Z2Q (袁正强) , Qin H2M(秦红敏) ,
Tian Y2C (田颖川) 1 Studies on transgenic tobacco plants expressing
two kinds of insect resistant genes1 Chinese Journal of Biotechnology
(生物工程学报) ,2001 ,17 (3) : 273 - 277 (in Chinese with English
abstract)
[17 ] 　Gallie D R , Sleat D E , Watts J W , Turner P C , Wilson T M1 The 5′
leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression
of foreign gene transcripts in vitro and in vivo1 Nucl Acids Res , 1987 ,
15 (8) : 3 257 - 3 273
[18 ] 　HervéV , Mathilde F1 Transcriptional gene silencing in plants : tar2
gets ,inducers and regulators1 Trends in Genetics , 2001 ,17 (1) : 29 -
34
311　第 1 期 赵福永等 :抗草甘膦基因 aroAM12 及抗虫基因 Bts1m 的转基因棉株